張金麗， 曹雯娟， 熊喜峰， 劉志河

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實驗研究

穗花杉雙黃酮調(diào)控人瘢痕成纖維細胞活性及凋亡的研究

張金麗， 曹雯娟， 熊喜峰， 劉志河

目的 探討穗花杉雙黃酮調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細胞生長與凋亡的作用機制。方法 將細胞接種于24孔板，分別加入不同濃度的穗花杉雙黃酮(0、25、50、100、150、200 μmol/L), 48 h后,酶標儀檢測490波長的吸光度。選取濃度為50 μmol/L和100 μmol/L的穗花杉雙黃酮作為后續(xù)實驗的用藥濃度，以0 μmol/L穗花杉雙黃酮為對照，加入到人增生性瘢痕成纖維細胞中作用48 h，分別采用DAPI染色檢測穗花杉雙黃酮對人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的作用， Western blot檢測穗花杉雙黃酮對人增生性瘢痕成纖維細胞磷酸化AKT(p-AKT)及凋亡相關(guān)蛋白，如翻譯控制腫瘤蛋白、BAX、caspase 3、caspase 8、caspase 9的影響。結(jié)果 穗花杉雙黃酮對人增生性瘢痕成纖維細胞的活力具有劑量依賴性抑制作用，穗花杉雙黃酮濃度為50 μmol/L以上與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DAPI染色顯示，穗花杉雙黃酮具有誘導人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的趨勢，與對照組相比，加藥組細胞表現(xiàn)為細胞核深染、核膜皺縮、有凋亡小體形成。Westernblot顯示，與對照組相比，AKT磷酸化水平降低；促凋亡蛋白BAX表達升高；抗凋亡蛋白TCTP表達降低；caspase3、caspase8、caspase9表達升高。結(jié)論 穗花杉雙黃酮可誘導瘢痕成纖維細胞凋亡，抑制其活力，有望成為臨床治療增生性瘢痕的一種有效藥物。

增生性瘢痕； 成纖維細胞； 凋亡； 穗花杉雙黃酮； 實驗研究

增生性瘢痕是燒傷患者受傷后傷口修復過程中常見的并發(fā)癥。隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，傷后患者的生存率得到了很大的提高，但形成的增生性瘢痕卻嚴重影響患者的生活質(zhì)量和心理健康[1]。增生性瘢痕是因成纖維細胞增殖生長失控、膠原過度沉積導致受傷部位異常愈合而形成，其中成纖維細胞的異常增殖在瘢痕的形成中起主要的作用[2]。目前，增生性瘢痕的治療仍以激素為主，同時還有5- 氟尿嘧啶、免疫調(diào)節(jié)劑等其他藥物，但治療效果各有利弊[3]。近年來，中草藥治療逐漸引起了人們的關(guān)注[4]。有研究證實，從卷柏中提取的穗花杉雙黃酮(amentoflavone, AF)具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種功效，且AF對UVB照射引起的正常皮膚成纖維細胞DNA損傷有保護作用[5-8]。自2014年6月至2015年3月，暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所將AF作用于增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts, HSFBs)，以觀察其對HSFBs活力與凋亡的影響。

1 臨床資料

1.1 主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清、胰酶及青鏈霉素(美國GIBCO公司);XTT(美國SIGMA公司);兔多克隆抗體TCTP、小鼠單克隆抗體BAX(美國SANTA CRUZE公司);兔單克隆抗體caspase 3、兔多克隆抗體caspsae 8、小鼠單克隆抗體caspase 9、兔單克隆抗體p-AKT(美國CST公司);DAPI染色封片劑(美國SANTA CRUZE公司);AF(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。

1.2 組織來源 增生性瘢痕組織來源于暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所需做手術(shù)切除的3例男性患者，年齡分別為4、7、45歲。均為創(chuàng)面愈合后5～12個月的增生期瘢痕，瘢痕高出皮膚表面。顏色鮮紅至暗紅，患者自覺偶有瘙癢感，無瘢痕潰瘍、破損、感染等情況，無合并腫瘤、糖尿病等基礎(chǔ)疾病。均獲患者的知情同意。

2 實驗方法

2.1 HSFBs的分離培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法，將收集到的標本用滅菌PBS液反復沖洗3次，去除瘢痕組織的表皮層和脂肪組織，然后將組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，接種于培養(yǎng)瓶中，添加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，待細胞從組織塊中長出并接近融合成單層時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2 XTT檢測AF對HSFBs活力的影響 取第3代生長旺盛的細胞接種于24孔板中,每孔接種3×104個細胞，次日，分別加入不同濃度的AF(0、25、50、100、150、200 μmol/L),每組3個復孔，48 h后加入XTT孵育4 h，放入酶標儀檢測吸光度。

2.3 DAPI染色觀察AF對HSFBs凋亡的影響 取第3代細胞接種于已鋪有蓋玻片的六孔板中，每孔接種10萬個細胞，次日，分別加入不同濃度(0、50、100 μmol/L)AF，作用48 h后，PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min,加入DAPI對細胞核進行染色并至熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)。

2.4 Western blot檢測AF對HSFBs蛋白表達的影響 細胞接種于培養(yǎng)皿中，加入不同濃度AF(0、50、100 μmol/L)作用48 h后，棄上清，PBS洗3次，加入RIPA細胞蛋白裂解液，離心后收集上清測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉2 h，分別加入一抗(TCTP、BAX、caspase 3、caspase 8、caspase 9、p-AKT),4℃冰箱搖床孵育過夜，次日TBST洗3次，分別加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后加入ECL發(fā)光液，放入化學發(fā)光凝膠成像儀顯影拍照。

3 結(jié)果

3.1 XTT檢測顯示AF抑制HSFBs的活力 當AF濃度為50 μmol/L時，與對照組(0 μmol/L)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明AF對HSFBs的生長有抑制作用；隨著藥物濃度的增加，抑制作用越強(圖1)。

3.2AF對HSFBs凋亡的影響DAPI染色顯示，與對照組相比，50μmol/L與100μmol/LAF組細胞核變小、染色質(zhì)濃縮、核膜皺縮呈不規(guī)則樣、凋亡小體形成(圖2)。

3.3Westernblot檢測AF對HSFBs蛋白表達的影響Westernblot顯示，以對照組蛋白表達為100%，p-AKT和翻譯控制腫瘤蛋白的表達降低，在50、100μmol/LAF的作用下，p-AKT相對蛋白表達分別是(49.30±10.44)%和(54.00±10.69)%，抗凋亡蛋白翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein,TCTP)相對蛋白表達為(70.00±17.00)%和(57.00±13.00)%(圖3，4)；與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。促凋亡蛋白BAX、caspase3、caspase8、caspase9表達升高，在50、100μmol/lAF作用下，蛋白表達分別為BAX：(120.00±36.00)%、(180.00±43.00)%；caspase3：(277.00±38.00)%、(387.00±55.00)%；caspase8：(213.00±20.00)%、(367.00±21.00)%；caspase9：(166.00±56.00)%、(266.00±71.00)%(圖5,6)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4 討論

正常情況下，人體組織受傷后，傷口部位成纖維細胞的生長與凋亡、細胞外基質(zhì)的沉積與消退始終維持著一個動態(tài)平衡，此動態(tài)平衡是保證傷口正常愈合的關(guān)鍵。然而，在有些燒傷患者中，由于炎癥或其他因素的影響，導致傷口處成纖維細胞的異常增生、細胞外基質(zhì)過度沉積，從而形成了增生性瘢痕。因此，抑制HSFBs的增生、誘導HSFBs的凋亡，從而減少細胞外基質(zhì)的分泌是治療增生性瘢痕的一個重要途徑。

本研究結(jié)果顯示，AF能夠劑量依賴性的抑制HSFBs的生長。AF具有抗炎的作用，能夠抑制多種炎癥因子如一氧化氮、前列腺素E2等的表達和釋放。黃振青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AF能夠降低急性肝損傷大鼠血清中TNF-α、TGF-β1、IL-1β 和IL-6的含量，而且肝組織TNF-α和iNOS基因的表達也顯著下調(diào)。李巍等[10]研究表明，黃芩甙能夠通過抑制TGF-β1和Ⅲ型膠原蛋白的表達水平減少細胞外基質(zhì)的異常沉積來影響皮膚瘢痕的形成。因此，AF很可能通過減少這些炎癥因子的生成而降低炎癥因子對HSFBs的生長刺激作用，從而抑制HSFBs的生長。此外，我們還通過DAPI染色觀察AF處理過的HSFBs細胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)這些細胞核具有細胞凋亡的特征；Western blot檢測結(jié)果也證實，AF能夠激活caspase 3、caspase 8、caspase 9蛋白酶從而誘導HSFBs凋亡。caspase 8可通過兩條平行通路促進凋亡：一方面它可以直接剪切并激活caspase 3；另一方面它還可以切割Bid，截短的Bid進入線粒體，促進細胞色素C的釋放，從而激活caspase 9和caspase 3，而caspase 3是所有凋亡途徑的必經(jīng)之路。曾有文獻報道，AF可以增強細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑和抑癌基因p53的活性，通過下調(diào)細胞周期素等途徑，激活細胞凋亡蛋白酶caspase 3 和caspase 9，通過線粒體固有途徑誘導細胞凋亡[11]。楊雨等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，AF可以通過影響caspase 3和β-catenin表達誘導結(jié)腸癌細胞SW480凋亡。

圖1 不同濃度AF對HSFBs活力的影響 圖2 熒光顯微鏡下觀察HSFBs凋亡細胞核的形態(tài)學特征(×400) a.對照組 b.50 μmol/L AF組 c.100 μmol/L AF組 圖3 Western blot檢測AF對HSFBs中p-AKT、BAX、TCTP蛋白表達的影響 圖4 p-AKT、BAX、TCTP蛋白表達半定量分析 圖5 Western blot檢測AF對HSFBs中caspase 8、caspase 9、caspsae 3蛋白表達的影響 圖6 caspase 8、caspase 9、caspsae 3蛋白表達半定量分析

Fig 1 Effect of different concentration AF on HSFBs vitality. Fig 2 Apoptotic features of HSFBs nuclear under fluorescence microscopy (×400). a. control group. b. 50 μmol/L AF group. c. 100 μmol/L AF group. Fig 3 Influence of AF on the expression of apoptosis-related protein in HSFBs examined by Western blot. Fig 4 Expression of p-AKT, BAX, TCTP proteins examined by semiquantitative analysis. Fig 5 Influence of AF on the expression of apoptosis protein in HSFBs examined by Western blot. Fig 6 Expression of caspase 8, caspase 9, caspsae 3 proteins examined by semiquantitative analysis.

細胞凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細胞自殺機制，細胞凋亡的發(fā)生，一方面需要促凋亡因子的表達，另一方面則需要抑制抗凋亡蛋白的表達。那么，在本研究中AF如何調(diào)控HSFBs凋亡的呢？我們分別檢測了BAX、TCTP及p-AKT的表達，AKT是生存信號傳導中一個重要因子，能夠被許多促生長因子活化，在維持細胞的存活與增殖方面起重要作用，當AKT的活化被抑制以后，能夠阻斷許多促細胞生長、抗凋亡信號的轉(zhuǎn)導，從而抑制細胞的增殖，誘導細胞的凋亡。其結(jié)果顯示，當AF作用于HSFBs時，HSFBs的AKT磷酸化被抑制，而BAX表達升高，TCTP表達降低。BAX屬于一種促凋亡蛋白，當BAX的表達升高時，可以募集并激活caspase 9，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生。唐悅玲等[13]研究表明，腫瘤壞死因子α可通過調(diào)節(jié)瘢痕成纖維細胞內(nèi)BAX的表達而誘導其凋亡。而TCTP具有抗凋亡作用。Rho 等[14]在肺癌細胞系人肺腺癌細胞(A549)中過表達,TCTP能降低由p53 介導的細胞凋亡，而利用siRNA 干擾TCTP的表達則增加了細胞的凋亡。張飛等[15]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞中異常高表達TCTP，可通過上調(diào)Bcl-xL抑制細胞凋亡，從而促進胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，AF很可能是通過抑制AKT磷酸化、降低TCTP蛋白表達、促進BAX升高，進而激活caspase 8、caspase 9及caspase 3，從而抑制HSFBs生長并促進其凋亡。

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Influence of Amentoflavone on the viability and apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts

ZHANGJin-li,CAOWen-juan,XIONGXi-feng,LIUZhi-he.

(InstituteofTraumaticSuigery,GuangzhouRedCrossHospital,MedicalCollageofJinanUniversity,Guangzhou510220,China)

LIUZhi-he,Email:zliu0731@163.com

Objective To investigate the effect of Amentoflavone (AF) on the viability and apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts (HSFBs) and its underlying mechanism. Methods XTT assay was performed to assess cell viability. HSFBs were seeded at 3.0×104cells/well in a 24-well plate overnight, and then treated with different concentrations of AF(0 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L, 200 μmol/L. After incubation for 48 h, cell absorbance was detected at 490 nm wavelength. In following experiments, 50 μmol/l AF and 100 μmol/l AF concentration was used. HSFBs were incubated with 50 μmol/L AF or 100 μmol/L AF or 0 μmol/L AF for 48 h. Cell apoptosis were examined by DAPI staining. Western blotting was used to analyze the expression of cell apoptosis-related proteins such as translationally controlled tumor protein (TCTP), BAX, caspsae 3, caspase 8, caspase 9, and p-AKT in HSFB treated with AF. Results AF can inhibit the viability of HSFB dose dependently. Comparing control group (AF: 0 μmol/L) with 50 μmol/L AF or higher AF groups, the difference in cell viability was significant (P<0.05).DAPIstainingshowedAF-inducedapoptosisinHSFBs.AFinducestypicalapoptoticfeaturessuchasmembraneblebbing,cellshrinkageanddetachment,nuclearcondensationandfragmentation.WesternblotshowedthattheexpressionofAKTphosphorylationandanti-apoptoticproteinTCTPwerelower,whiletheexpressionofpro-apoptoticproteinBAXandcaspase3,caspase8,caspase9werehighercomparedwiththecontrolgroup. Conclusion Amentoflavone could induce aptosis of scar fibroblasts so as to inhibit its activity which is expected to become effective medicine for hyperplastic scar treatment.

Hypertrophic scar; Fibroblast; Apoptosis; Amentoflavone; Experimental study

國家自然科學基金(81272222)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20131A011038) 作者單位：510220 廣東 廣州，暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院 創(chuàng)傷外科研究所 第一作者：張金麗(1979-)，女，河南人，主管技師，碩士研究生. 通信作者：劉志河，510220，暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院 創(chuàng)傷外科研究所，電子信箱:zliu0731@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.018

R

A

1673-7040(2016)03-0173-04

2015-12-19)