劉漢文， 周志齊， 陳洪興， 趙朱麗， 劉潤煊， 龔星宇，潘鳳濤， 季中春

(1鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；2鹽城市怡美食品有限公司，江蘇 射陽 224333)

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梅童魚內(nèi)源蛋白酶自水解工藝的優(yōu)化

劉漢文1， 周志齊1， 陳洪興1， 趙朱麗1， 劉潤煊1， 龔星宇1，潘鳳濤2， 季中春2

(1鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；2鹽城市怡美食品有限公司，江蘇 射陽 224333)

摘要：為提高海捕低值魚加工利用率，合理利用魚糜及魚糜制品加工中的副產(chǎn)物，充分利用魚類自身內(nèi)源酶，尋求低值魚精深加工的低碳高效利用，以梅童魚(Collichthyslucidus)為研究對象，利用魚類自身的內(nèi)源蛋白酶將魚體內(nèi)的蛋白質(zhì)酶解，在自然pH條件下，觀察了液料比、自溶溫度、時(shí)間對梅童魚蛋白水解的影響，以可溶性蛋白/總蛋白的值為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化自溶條件。通過求解回歸方程得到的最優(yōu)自溶條件為：液料比3.4，溫度53 ℃，時(shí)間267 min。經(jīng)過驗(yàn)證，可溶性蛋白/總蛋白的值為18.35%，與回歸方程的預(yù)測值18.55%相比，相對誤差1.1%，說明模型能較好地預(yù)測自溶過程中可溶性蛋白/總蛋白的值。在此條件下，測得水解度為15.84%，過0.45 μm微濾膜蛋白質(zhì)量比為9.83%。研究表明，該水解工藝可為生產(chǎn)魚露、活性肽、氨基酸等提供技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梅童魚；內(nèi)源蛋白酶；自水解；響應(yīng)面分析

梅童魚(Collichthyslucidus)是石首魚科梅童魚屬的一種，是近海常見的小型經(jīng)濟(jì)魚類之一，魚肉嫩刺軟，味道鮮美。梅童魚主要加工為魚干、魚糜及魚糜制品，在此過程中會產(chǎn)生約占魚體40%的魚頭、脊骨、魚皮等副產(chǎn)物。通常情況下，這些副產(chǎn)物只能制作成魚粉或加工成飼料，極少用于以食用為目的的產(chǎn)品開發(fā)，使得原料未能得到充分利用、水產(chǎn)品加工效益偏低[1-3]。梅童魚營養(yǎng)價(jià)值高，特別是魚頭富含磷質(zhì)，是養(yǎng)腦的滋補(bǔ)品[4-6]。開展海捕魚精深加工，實(shí)現(xiàn)低碳高效利用是產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向[7-11]。利用梅童魚自身內(nèi)源蛋白酶將梅童魚魚體水解，產(chǎn)生可溶性蛋白、肽以及氨基酸等，開發(fā)生產(chǎn)魚露、不同生理活性的多肽、氨基酸等高值化產(chǎn)品，為梅童魚內(nèi)源蛋白酶的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

梅童魚購于江蘇射陽黃沙港海產(chǎn)品市場，貯于冰箱冷凍室(-18 ℃)。牛血清蛋白(BSA)：MW 66700(華美生物工程公司)；實(shí)驗(yàn)所用試劑包括95%乙醇、磷酸、無水乙醚、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲醛、硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備包括：JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；95-1磁力攪拌器，上海志威電器有限公司；PH400臺式酸度計(jì)(精度0.01)，安萊立思儀器科技(上海)有限公司；UV-9600紫外可見分光光度計(jì)(準(zhǔn)確度 ± 0.1 nm)，北京瑞利分析儀器有限公司；10～100μL可調(diào)量程移液器(精確度 ≤ 1.0%)，德國Peppercorn公司； TGL-16G離心機(jī)，美國Labnet公司；202-1AS數(shù)顯電熱干燥箱，上海索譜儀器有限公司；TX223L電子天平(精度1 mg)，日本島津公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋(溫度波動 ± 0.5 ℃)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SX2-2.5-10馬弗爐，泰州市駿前電熱器材有限公司。

1.3方法

1.3.1梅童魚的主要成分測定與自溶酶解

梅童魚的主要成分包括水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分，均按照食品的一般分析方法測定[12-15]。

梅童魚的自溶酶解：將梅童魚從冰箱中取出，用清水解凍，并將外表面的異物清洗干凈，再將其放入組織搗碎勻漿機(jī)中，加入一定量的水，打碎成漿。取100 mL魚漿移入錐形瓶中，在一定溫度的水浴鍋中保溫一定時(shí)間，然后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液快速測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2可溶性蛋白/總蛋白的值測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測定可溶性蛋白，干擾物質(zhì)較少，靈敏度高，穩(wěn)定性好[17-18]。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，采用考馬斯亮藍(lán)法測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在A595 nm處的吸光值；再以吸光值為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述自溶酶解上清液在A595 nm處測定吸光值，計(jì)算出酶解液中的可溶性蛋白濃度(圖1)，y=0.498 2x+0.007；R2=0.996 5。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線Fig.1　The curve of standard protein

可溶性蛋白濃度的計(jì)算公式：

x=(A595- 0.007)/0.498 2

式中：x—可溶性蛋白濃度，mg/mL；A595—待測液在A595nm處的吸光值。

可溶性蛋白/總蛋白的值計(jì)算公式：

X=C×V/m×100%

式中：X—可溶性蛋白/總蛋白的值，%；C—可溶性蛋白濃度，mg/mL；V—上清液體積，mL；m—上清液中總蛋白質(zhì)量，mg；

1.3.3其它指標(biāo)測定

(1)水解度計(jì)算公式：

DH=(C1/C0)×100%

式中：C1—氨氮濃度，mg/mL ，甲醛電位法[19]測定；C0—總氮的濃度，mg/mL，凱氏定氮法[13]測定；DH—水解度，%。

(2)過微濾膜蛋白質(zhì)量比：使用0.45 μm微濾膜，真空抽濾，取濾液于表面皿中，50 ℃烘干12 h，稱量。計(jì)算公式：

Y=m1/m2×100%

式中：Y—過微濾膜蛋白質(zhì)量比，%；m1—濾過物質(zhì)量，mg；m2—可溶性蛋白質(zhì)量，mg。

2結(jié)果與分析

2.1梅童魚的主要成分

試驗(yàn)結(jié)果顯示，梅童魚的主要成分：水分(73.03±0.87)%，灰分(2.24±0.72)%，粗脂肪(7.74±0.73)%，粗蛋白質(zhì)(16.99±0.64)%。

2.2可溶性蛋白的影響因素

(1)自溶時(shí)間對可溶性蛋白的影響。在自然pH、溫度55 ℃、液料比為3的條件下，每隔30 min測定可溶性蛋白的濃度，計(jì)算可溶性蛋白/總蛋白的值。從結(jié)果(圖2)可以看出，在0～150 min之內(nèi)隨著魚肉中可溶性蛋白的浸出及魚肉蛋白逐漸酶解，可溶性蛋白含量增大較快；150～240 min之間可溶性蛋白含量增長變緩；240 min以后，魚肉蛋白和可溶性蛋白酶解的速率基本達(dá)到平衡，可溶性蛋白含量緩慢下降。所以，考慮到自溶酶解的條件，時(shí)間定為240 min。

圖2　時(shí)間對可溶性蛋白/總蛋白的值影響Fig.2　The influence of time on the solubleprotein/total protein

(2)溫度對可溶性蛋白的影響。在自然pH、液料比3、時(shí)間為240 min條件下，測定可溶性蛋白的濃度，觀察可溶性蛋白/總蛋白的值隨溫度的變化情況。從結(jié)果(圖3)可以看出，在45 ℃～60 ℃時(shí)，可溶性蛋白/總蛋白的值較大，在55 ℃時(shí)為最大。表明在最適溫度作用下，酶的活性達(dá)到最大，水解反應(yīng)速率也最大。

圖3　溫度對可溶性蛋白/總蛋白的值影響Fig.3　The influence of temperature on thesoluble protein/total protein

(3)液料比對可溶性蛋白的影響。在自然pH、溫度55 ℃、時(shí)間240 min、不同液料比的條件下，測定可溶性蛋白的濃度，觀察可溶性蛋白/總蛋白的值隨液料比的變化情況。從結(jié)果(圖4)可以看出，在液料比為1.0～3.0時(shí)，可溶性蛋白/總蛋白的值隨液料比的增大而增大，但當(dāng)液料比達(dá)到3以后，增加變得緩慢。這是由于在自溶酶解過程中，底物濃度的大小對酶解速率有一定的影響。水有利于底物的擴(kuò)散，可以使酶與底物更好的接觸，但隨著液料比繼續(xù)增大，酶與底物接觸機(jī)會就會降低，反應(yīng)速率變慢，可溶性蛋白/總蛋白的值值的增速就會減緩。

圖4　液料比對可溶性蛋白/總蛋白的值影響Fig.4　The influence of liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

2.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面分析中的中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design, CCD)對自溶條件進(jìn)行分析優(yōu)化，以A(時(shí)間)、B(溫度)、C(液料比)為自變量，中心點(diǎn)分別為240、55、3，變化步長分別為20、5、1，以可溶性蛋白/總蛋白的值為響應(yīng)值，試驗(yàn)次數(shù)為20，中心點(diǎn)有6個(gè)。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1、表2。

表1　試驗(yàn)因素水平表

表2　中心復(fù)合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3　回歸方程方差分析表

注：*表示顯著性水水平P<0.050；**表示顯著性水平P<0.010

以可溶性蛋白/總蛋白的值為響應(yīng)值，對表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合和方差分析，得到表3?；貧w方程模型的F值為62.14(P<0.000 1)，表明模型顯著，建立的模型回歸方程能較好地解釋響應(yīng)結(jié)果，并預(yù)測最佳自溶酶解條件。由表3可知，對響應(yīng)值可溶性蛋白/總蛋白的值作用顯著的是A、B、C、BC、A2、B2、C2、A2C。

回歸方程為：Y=15.72+1.86×A-0.86×B-1.35×C+0.1×A×B-0.04×A×C+1.22×B×C-0.48×A2-1.15×B2-2.39×C2+3.04×A2×C

由表3可知，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.158 7>0.05)，而模型的P<0.05，說明模型顯著，并且模型的擬合度為0.985 7，信噪比為27.666，說明該模型各因素水平區(qū)間設(shè)計(jì)合理，擬合度良好，可用來預(yù)測。

固定3個(gè)因素中的1個(gè)，作出另2個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面(圖5、6、7)。由表3可以看出，AB、AC交互作用的P值均大于0.05，BC的P值小于0.05，說明AB、AC的交互作用對可溶性蛋白/總蛋白的值影響不顯著，BC的交互作用對可溶性蛋白/總蛋白的值影響顯著。

圖5　溫度與時(shí)間對可溶性蛋白/總蛋白的值的影響Fig.5　Response surface showing the effect of timeand temperature on the soluble protein/total protein

從圖5可以看出，在液料比一定的情況下，當(dāng)溫度在53.0 ℃左右，響應(yīng)值出現(xiàn)最大值；而響應(yīng)值也隨時(shí)間的增加而增大，當(dāng)時(shí)間為267 min時(shí)，可溶性蛋白/總蛋白的值最大。曲面傾斜程度比較小，所以溫度與時(shí)間對可溶性蛋白/總蛋白的值交互作用較小。

圖6　溫度和液料比對可溶性蛋白/總蛋白的值影響Fig.6　Response surface showing the effect oftemperature and liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

從圖6可以看出，在時(shí)間一定的情況下，從溫度的影響來看，可溶性蛋白/總蛋白的值隨著液料比的增加而先增大后減??；從液料比的影響來看，可溶性蛋白/總蛋白的值隨著溫度的升高而先增大后減小。其等高線呈橢圓形，表明溫度和液料比交互影響對可溶性蛋白/總蛋白的值影響是顯著的。

圖7　時(shí)間和液料比對可溶性蛋白/總蛋白的值影響Fig.7　Response surface showing the effect oftime and liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

從圖7可以看出，在溫度一定的條件下，當(dāng)液料比為3.4時(shí)，響應(yīng)值隨時(shí)間而變化，最大值在267 min左右。曲面傾斜程度比較小，所以，時(shí)間和液料比對可溶性蛋白/總蛋白的值的交互作用較小。

2.4數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證

利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6 預(yù)測可溶性蛋白/總蛋白的值最大時(shí)的工藝參數(shù)為：自溶時(shí)間267 min、溫度53.0 ℃、液料比3.38，在此條件下，可溶性蛋白/總蛋白的值的預(yù)測值為18.55%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，考慮操作的可行性，控制溫度為53 ℃、液料比為3.4、自溶267 min，做3次平行實(shí)驗(yàn)，測得可溶性蛋白/總蛋白的值的平均值分別為18.58%、18.15%、18.33%，均值為18.35%，與模型理論預(yù)測值18.55%基本吻合，相對誤差1.1%，說明該模型擬合度良好，可用來預(yù)測自溶過程中可溶性蛋白/總蛋白的值。

鄭杰[20]采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到海參腸自溶的最佳條件為溫度48.30 ℃、pH 4.43、液料比3和自溶時(shí)間4 h，預(yù)測三氯乙酸-可溶性寡肽含量最大值為32.59 mg/g；徐偉等[21]通過對魷魚加工副產(chǎn)物內(nèi)源酶自溶水解條件的分析研究得到最佳水解條件：溫度45.48 ℃，液料比為2.44，初始pH6.420，時(shí)間48 h，水解液中的氨基態(tài)氮含量為0.4137 g/100 mL；呂英濤[22]在以魷魚加工副產(chǎn)物制備魚醬油過程中，在初始pH9.0、溫度50 ℃、時(shí)間12 h的條件下，測得酶解液的上清液中α-氨基氮含量為0.4962 g/100 ml。本試驗(yàn)利用梅童魚在自然pH條件下自溶水解，可溶性蛋白/總蛋白的值達(dá)到18.35%，水解度為15.84%，過0.45 μm微濾膜蛋白質(zhì)量比為9.83%。

3結(jié)論

采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白，以可溶性蛋白/總蛋白的值為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析，對梅童魚內(nèi)源蛋白酶自水解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，最終確定了自水解的最佳工藝條件為自然pH、溫度53 ℃、液料比3.4、自溶267 min，在該條件下，可溶性蛋白/總蛋白的值為18.35%，水解度為15.84%，過0.45 μm微濾膜蛋白質(zhì)量比為9.83%。驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測值相比，相對誤差1.1%，說明該模型能夠較好地預(yù)測自溶過程中可溶性蛋白/總蛋白的值。

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Optimization of autohydrolyzing conditions of endogenous proteases fromCollichthyslucidus

LIU Hanwen1, ZHOU Zhiqi1, CHEN Hongxing1, ZHAO Zhuli1, LIU Runxuan1, GONG Xingyu1, PAN Fengtao2, JI Zhongchun2

(1SchoolofOceanandBiologicalEngineering,YanchengInstituteofTechnology,YanchengJiangsu224051,China; 2YanChengYiMeiFoodCo.,Ltd.SheyangJiangsu224333,China)

Abstract：In order to improve the processing and utilization rate of low-value fish species caught from marine capture, rationally use the byproducts from surimi and surimi products processing, make full use fish endogenous enzymes, and seek for the low-carbon, high efficiency deep-processing method for low-value fish,Collichthysluciduswas taken as the object to study the hydrolysis conditions of fish protein using endogenous proteases. Under the condition of natural pH, single factor experiment was adopted to investigate the effects of liquid to sample ratio, temperature and hydrolysis time on the soluble protein/total protein value, and the conditions were optimized as following：liquid to sample ratio being 3.4, temperature 53 ℃, and time 267 min. Under the optimal conditions, the soluble protein/total protein value was up to 18.35%, and compared with the predicted value 18.55% with regression equation, the relative error was 1.1%, illustrating that the model can rather precisely predict the soluble protein/total protein value. Under such conditions, the measured degree of hydrolysis was 15.84% and the protein of passing 0.45μm microfiltration mass ratio was 9.83%. The results show that the hydrolysis process could provide technical support for the production of fish sauce, bioactive peptides, amino acid and so on.

Key words：Collichthyslucidus; endogenous proteases; autohydrolyze; response surface methodology

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.009

收稿日期：2016-03-05修回日期：2016-05-27

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇北科技專項(xiàng)資金(富民強(qiáng)縣)項(xiàng)目(BN2014053)

作者簡介：劉漢文(1962— )，男，高級工程師，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：liuhanwen@ycit.cn

中圖分類號：TS 254.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-9580(2016)03-043-06