張文斌　李文德　王治江　王少秋（. 甘肅省張掖市經(jīng)濟(jì)作物推廣站，甘肅 張掖 734000；. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

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真姬菇液體培養(yǎng)特性及胞外酶的活性研究

張文斌1李文德1王治江2*王少秋2
（1. 甘肅省張掖市經(jīng)濟(jì)作物推廣站，甘肅 張掖 734000；2. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

摘 要通過液體發(fā)酵方式，測定不同碳源、氮源、礦質(zhì)元素、初始pH對真姬菇菌絲生長的影響及胞外酶活性。結(jié)果表明：真姬菇液體培養(yǎng)最適的碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為蛋白胨，最佳礦質(zhì)元素是硫酸銅，適宜于生長的初始pH為4～6。在整個發(fā)酵期內(nèi)，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶的酶活性高峰交替出現(xiàn)。其中：愈創(chuàng)木酚酶、羧甲基纖維素酶活性在第2天為高峰，鄰苯二酚酶出現(xiàn)在第3天，淀粉酶在第4天達(dá)到高峰。

關(guān)鍵詞真姬菇；液體培養(yǎng)；特性；胞外酶活性

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇、海鮮菇，秋季群生于闊葉樹的朽木上，廣泛分布于日本、歐洲、北美、西伯利亞等地。形態(tài)美觀、肉質(zhì)脆嫩，味道鮮美似螃蟹。在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之說［1］，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，是北溫帶一種優(yōu)良的食用菌。富含賴氨酸、精氨酸、葡聚糖，具有促進(jìn)青少年智力發(fā)育、抗癌、抵抗HIV病毒、降血壓、降低膽固醇、提高人體免疫力等功效［2］。

利用傳統(tǒng)的工藝生產(chǎn)固體菌種，生產(chǎn)周期長、環(huán)節(jié)多，污染不易控制；利用液體培養(yǎng)生產(chǎn)液體菌種有生產(chǎn)周期短、菌齡一致、接種簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)［3］。近年來真姬菇的相關(guān)研究報(bào)道側(cè)重栽培和生物學(xué)特性方面，營養(yǎng)生理研究較少。筆者測定了真姬菇生長發(fā)育過程中羧甲基纖維素酶、淀粉酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶的活性變化，以期從中找出真姬菇在生長發(fā)育過程中胞外酶的變化規(guī)律，為促進(jìn)真姬菇液體菌種工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　試驗(yàn)材料

1.1菌種

真姬菇菌種購自北京吉蕈園科技有限公司。供試碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，均為分析純。供試氮源為蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、尿素，均為分析純。麩皮購于張掖市市場。礦質(zhì)元素為硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅，均為分析純。

1.2培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、水1 000 mL。液體種培養(yǎng)基為不加瓊脂的母種培養(yǎng)基。碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中葡萄糖用供試碳源代替。氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中將蛋白胨用供試氮源代替。礦質(zhì)元素基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中將磷酸二氫鉀、硫酸鎂用供試礦質(zhì)元素代替。初始pH基礎(chǔ)培養(yǎng)基為在母種培養(yǎng)基中用10%的鹽酸和10%的氫氧化鈉調(diào)至所需pH。

2　試驗(yàn)方法

2.1液體菌種培養(yǎng)

將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入已經(jīng)活化的斜面母種（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25 ℃、110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)1周。

2.2真姬菇培養(yǎng)特性研究

（1）不同碳源對真姬菇菌絲生長量的影響。分別稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉各20 g，溶于1 000 mL供試碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每種碳源3次重復(fù)，經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，在25 ℃、110 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。7天后測定菌絲生物量、菌液中殘?zhí)橇?、菌液pH。

（2）不同氮源對真姬菇菌絲生長量的影響。分別稱取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、麩皮各4 g，溶于1 000 mL供試氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每種氮源3次重復(fù)，經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)。7天后測定菌絲生物量、菌液中殘?zhí)橇?、菌液pH。

（3）不同礦質(zhì)元素對真姬菇菌絲生長量的影響。分別在礦質(zhì)元素基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸二氫鉀各0.5 g，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每處理3次重復(fù)，經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)。7天后測定菌絲生物量、殘?zhí)橇俊⒔K止pH。

（4）初始pH對真姬菇菌絲生長量的影響。用10%氫氧化鈉溶液和10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)母種培養(yǎng)基初始pH分別為2、4、6、8、10、12，將培養(yǎng)基分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每處理3次重復(fù)。經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，在25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)。7天后測定菌絲生物量、菌液pH和菌液中殘?zhí)橇俊?/p>

2.3胞外酶特性研究

（1）粗酶液的制備。在250 mL的三角瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基，每瓶接入2%的母種培養(yǎng)液，在25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后將菌液用4層紗布過濾，取濾液10mL于離心管中，在5 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

（2）淀粉酶活性的測定。試管中加入0.5%可溶性淀粉溶液（用pH 5.8、0.2 mol/L NaAc-HAc緩沖液配置）1.5 mL，再加稀釋10倍的粗酶液0.5 mL，混勻，于38 ℃水浴鍋中保溫30 min，取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，于100 ℃水浴中煮沸5 min，冷卻后加入蒸餾水21.5 mL，混勻。用722型可見分光光度計(jì)520 nm處測OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復(fù)。酶活單位以反應(yīng)前后光密度的改變值表示。

（3）羧甲基纖維素酶活性的測定。試管中加入1.5 mL用pH 4.6、0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，再加入稀釋10倍的粗酶液0.5 mL混勻，于50 ℃水浴鍋中保溫30 min，其后按淀粉酶活性測定方法操作。

（4）鄰苯二酚氧化酶活性的測定。試管中加入0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液2.0 mL及0.07 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.0）2.0 mL。再加未稀釋的粗酶液0.1 mL，混勻，于28 ℃水浴鍋中保溫30 min后，立即用722型可見分光光度計(jì)測400 nm處OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復(fù)。酶活單位以反應(yīng)前后光密度的改變值表示。

（5）愈創(chuàng)木酚氧化酶活性的測定。試管中加入0.8 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液0.5 mL及0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉（pH 4.6）緩沖液3.0 mL，再加稀釋10倍的粗酶液0.5 mL，混勻，于28 ℃水浴鍋中保溫30 min后，立即用722型可見分光光度計(jì)測490 nm處OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復(fù)。酶活單位以反應(yīng)前后光密度的改變值表示。

3　結(jié)果與分析

3.1不同碳源菌絲的生長量

碳源主要是提供菌種生命活動所需的能量，構(gòu)成菌體和代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同碳源對真姬菇菌絲生長的影響見表 1。6種碳源中以可溶性淀粉的菌絲生長速度較快，為 0.7716 g/100 mL，與其他5種碳源比差異極顯著?？扇苄缘矸劬z生長速度較快的原因可能為可溶性淀粉屬于多糖，能被真姬菇菌絲更好地分解吸收利用，也可能是淀粉增加了培養(yǎng)基的黏度而有利于菌球的形成。此結(jié)果同文獻(xiàn)［4］的報(bào)道。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖為碳源，菌絲的生長速度分別為0.3669 g/100 mL、0.3289 g/100 mL、0.3141 g/100 mL、0.2396 g/100 mL，相互之間無顯著差異。甘露醇菌絲生長速度較慢，為 0.1978 g/100 mL，與其他5種碳源比有顯著差異。

表1　不同碳源與真姬菇菌絲生長的關(guān)系

3.2不同氮源的菌絲生長量

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)，包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸，以及含氮代謝物。不同氮源對真姬菇菌絲生長的影響見表 2。6種氮源中蛋白胨的菌絲生長速度最快，為0.3669 g/100 mL，與其他5種氮源差異極顯著，這一結(jié)果同文獻(xiàn)［5］的報(bào)道。酵母膏與麩皮間無顯著差異，但與其他氮源差異顯著；硝酸鉀與硝酸銨之間無顯著差異，但與其他氮源比差異顯著；尿素的菌絲生長速度較慢，為0.0509 g/100 mL，與其他5種氮源比差異顯著。原因可能是尿素在分解過程中產(chǎn)生氨，不利于菌絲生長。

3.3不同礦質(zhì)元素的菌絲生長量

6種不同礦質(zhì)元素對真姬菇菌絲生長的影響差異顯著（表3），以硫酸銅的菌絲生長速度較快，為0.3607 g/100 mL，與其他5種礦質(zhì)元素比差異極顯著，這一結(jié)果不同于文獻(xiàn)［4］的報(bào)道。原因可能與真姬菇的不同品種對礦質(zhì)元素有不同的偏愛有關(guān)。硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳之間差異不顯著，但與硫酸鋅差異顯著。硫酸鋅的菌絲生長速度較慢，為0.1188 g/100 mL，與其他5種礦質(zhì)元素比差異顯著。

表2　不同氮源與真姬菇菌絲生長的關(guān)系

表3　不同礦質(zhì)元素與真姬菇菌絲生長的關(guān)系

3.4不同初始pH的菌絲生長量

由圖1可知，不同初始pH對真姬菇菌絲生長有影響，適宜的初始pH范圍為4～6。初始pH 為4時菌絲生長較快，為0.3339 g/100mL；初始

圖1　不同初始pH與真姬菇菌絲生長量的關(guān)系

pH為10時生長速度較慢，為0.1969 g/100 mL。

3.5酶活性測定

（1）淀粉酶活性。由圖 2可知，在整個發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)期內(nèi)，淀粉酶均有活性，在第4天時活性達(dá)到高峰。這是因?yàn)榫z生長初期胞外酶分泌較少，能利用的主要是培養(yǎng)基中的小分子碳源。隨著菌絲的生長和胞外酶的分泌，淀粉酶活性逐漸升高達(dá)到高峰。隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，淀粉含量又復(fù)減少，酶活隨之逐漸下降，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［6］的報(bào)道一致。

圖2　淀粉酶活性與培養(yǎng)時間的關(guān)系

（2）羧甲基纖維素酶活性。從圖 3看，在整個發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)期內(nèi)，羧甲基纖維素酶均有活性，在第2天時達(dá)到高峰，之后迅速降低，到第6天時最低；而到第7天又上升第二個高峰。

圖3　羧甲基纖維素酶活性與培養(yǎng)時間的關(guān)系

（3）鄰苯二酚氧化酶活性。圖 4表明，在整個發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)期內(nèi)，鄰苯二酚氧化酶均有活性。開始時，鄰苯二酚氧化酶的活性上升速度較快，到第3天達(dá)第一個峰值；之后活性下降，第5天降到最低值；之后又復(fù)上升，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［7］的報(bào)道相類似。

圖4　鄰苯二酚氧化酶活性與培養(yǎng)時間的關(guān)系

（4）愈創(chuàng)木酚氧化酶活性。圖5表示在整個發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)期內(nèi)，愈創(chuàng)木酚氧化酶均有活性，活性第一個高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)的第2天；之后開始下降，第4天開始又上升，培養(yǎng)到第7天時，達(dá)到第二個高峰。這一結(jié)果與文獻(xiàn)［8］的報(bào)道相似。

圖5　愈創(chuàng)木酚氧化酶活性與培養(yǎng)時間的關(guān)系

4　討論與結(jié)論

真姬菇液體培養(yǎng)適宜的碳源是可溶性淀粉，原因可能是真姬菇菌絲能分泌淀粉酶，能更好分解吸收利用淀粉；也可能是淀粉增加了培養(yǎng)基的黏度而有利于菌球的形成。最佳氮源是蛋白胨，在有機(jī)氮中菌絲生長速度比在無機(jī)氮中快。真姬菇液體培養(yǎng)的最佳礦質(zhì)元素是硫酸銅，這與其他食用菌不同，可能是品種特性所致。適宜生長的最適pH為4～6，與其他食用菌相似。

在整個發(fā)酵期內(nèi)，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶的酶活性高峰交替出現(xiàn)。其中愈創(chuàng)木酚酶、羧甲基纖維素酶活性第一次高峰出現(xiàn)較早，為第2天；其次是鄰苯二酚酶，在第3天；淀粉酶活性在發(fā)酵培養(yǎng)的第4天出現(xiàn)。無論是自然界生長的還是人工栽培的食用菌，其生存環(huán)境中的主要碳源是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和淀粉等大分子有機(jī)物［8］。真姬菇菌絲在發(fā)酵培養(yǎng)前期主要利用糖類、纖維素，而后期則主要利用木質(zhì)素。

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Study on Hypsizygus marmoreus characteristics and extracellular enzyme activity in submerged culture

Zhang Wenbin1Li Wende1Wang Zhijiang2*Wang Shaoqiu2
（（1. Zhangye Economic Crops Extending Stations， Zhangye， Gansu 734000；2.Institute of Agricultural and Biological Technology， Hexi University， Zhangye， Gansu 734000））

AbstractSubmerged culture was used to determine the effects of different carbon sources， nitrogen sources， mineral elements and original pH value of mycelial's growth. The results showed that the best carbon source was melted amylon，the best nitrogen source was peptone， the best mineral elements was CuSO4and the best original pH value was 4～6 in all submerged culture period， activity peaks of amylase， carboxy menthel cellulose， polyphenol oxidase and guaiacol oxidase appear with difference. Guaiacol oxidase activity appers peak at the second day. The next is polyphenol oxidase appers at the third day. And， amylase， carboxy menthel cellulose appears at the fourth day.

Key WordsHypsizygus marmoreus； submerged culture； characteristics； extracellular enzyme activity

中圖分類號：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）01-043-05

基金項(xiàng)目：甘肅省特色產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目；項(xiàng)目編號Gs2014scgg-05（2）

作者簡介：張文斌（1966—），推廣研究員，主要從事設(shè)施蔬菜栽培技術(shù)研究與示范工作。E-mail：zhang-wb882003@ yahoo.com.cn

*通訊作者：王治江（1965—），高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事食用菌栽培與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工作。E-mail：wangzhijiang0772@163.com