劉開放,薛正蓮,王 洲

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

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p GEX-4T-2-A表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其融合蛋白GST-Pla A的表達(dá)優(yōu)化

劉開放,薛正蓮?,王 洲

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

摘要:構(gòu)建pGEX-4T-2-A表達(dá)質(zhì)粒來獲得融合蛋白GST-Pla A．PCR擴(kuò)增粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因Pla A,定向克隆到pGEX-4T-2載體上．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109菌株中,進(jìn)行陽性克隆的篩選并測(cè)序．將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)PLysS中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并進(jìn)行SDS-PAGE分析,驗(yàn)證融合蛋白GST-PlaA的表達(dá),同時(shí)優(yōu)化培養(yǎng)條件．p GEX-4T-2-A表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,其融合蛋白GST-Pla A以包涵體形式表達(dá)．在OD值為0．8時(shí)加入終濃度為0．5 m M的IPTG,37℃誘導(dǎo)8 h時(shí),融合蛋白GST-Pla A表達(dá)量最高．為磷脂酶A1蛋白的純化與功能研究奠定了基礎(chǔ)．

關(guān) 鍵 詞:磷脂酶A1;融合蛋白;SDS-PAGE;表達(dá)條件

磷脂酶是水解甘油磷脂的一類酶,磷脂酶A1能夠特異性水解天然磷脂Sn-1位?；?得到L-β溶血磷脂．許多微生物能產(chǎn)生磷脂酶A1,如曲霉菌、沙雷氏菌MK1和灰色鏈霉菌等．在工業(yè)生產(chǎn)中其主要用途是生產(chǎn)溶血磷脂、大豆油脫膠、加工卵黃、奶酪及甘油二酯的制備等[1-2]．在植物油脫膠方面,磷脂酶A1的高效率、低能耗、低污染等優(yōu)勢(shì)受到廣泛地關(guān)注、應(yīng)用及研究[3]．

基于基因工程技術(shù)的發(fā)展以及表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn),選用微生物來源的磷脂酶A1進(jìn)行克隆和表達(dá)的研究越來越多．蘇燕南[4]等構(gòu)建的重組菌BL21/Ap28菌株,最終表達(dá)了磷脂酶A1．但其表達(dá)水平低,酶活也較低[5],傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化很難大幅度提高酶活以供工業(yè)所需,且其純化比較困難．因此,鑒于GST標(biāo)簽具有助融純化的特性,能使酶活力提高且有利于其純化分離,實(shí)驗(yàn)通過將目的基因Pla A連接到帶有GST標(biāo)簽表達(dá)載體p GEX-4T-2,旨在表達(dá)GST-Pla A融合蛋白并對(duì)表達(dá)菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,為Pla A蛋白的純化和功能研究,乃至磷脂酶A1蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1．1 菌種質(zhì)粒及主要試劑

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)PL-06、大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、BL21(DE3)PLysS由安徽工程大學(xué)生化學(xué)院208實(shí)驗(yàn)室保藏;AP28質(zhì)粒由安徽工程大學(xué)生化學(xué)院208實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;質(zhì)粒載體p GEX-4T-2由江南大學(xué)國家工程實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)．

酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、聚丙烯酰胺、雙叉聚丙烯酰胺、Protein Marker和IPTG購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Bam HΙ限制性內(nèi)切酶、EcoRΙ限制性內(nèi)切酶、T4 Ligase購自Thermo公司;其他部分試劑購自國藥．

1．2 方法

(1)AP28質(zhì)粒(模版)的提?。畢⒄丈ど?上海)股份有限公司SanPrep柱式質(zhì)粒DNA微量抽提試劑盒說明書步驟進(jìn)行提?。?/p>

(2)目的基因pla A的擴(kuò)增．設(shè)計(jì)pla A基因的一對(duì)引物,在上游引物和下游引物的5’段分別加上Bam HΙ和EcoRΙ酶切位點(diǎn),并添加保護(hù)堿基．利用合成的引物,以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的磷脂酶A1基因pla A與p ET-28a重組質(zhì)粒(簡稱AP28質(zhì)粒)為模板進(jìn)行目的pla A基因片段的擴(kuò)增．PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為: 95℃、5 min預(yù)變性后,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)．參數(shù)為:95℃、35 s;56℃、35 s;72℃、35 s;最后一次循環(huán)結(jié)束后, 72℃再延伸8 min．

(3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定．PCR擴(kuò)增得到的plaA基因片段通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證大小后,使用試劑盒進(jìn)行膠回收．將PCR產(chǎn)物與提純的pGEX-4T-2質(zhì)粒,分別用Bam HΙ和EcoRΙ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切．酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化,再通過T4DNA連接酶將pla A基因片段連接到p GEX-4T-2質(zhì)粒的Bam HΙ和EcoRΙ酶切位點(diǎn)上．構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為p GEX-4T-2-A．將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)菌中．涂布在已加入氨芐青霉素LB平板上,挑取生長的單菌落,過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR,電泳驗(yàn)證產(chǎn)物大?。瑫r(shí),對(duì)重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-A進(jìn)行雙酶切并電泳驗(yàn)證．兩種方法驗(yàn)證正確后送上海生工測(cè)序．測(cè)序正確后,將重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-A轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)PLysS中,命名為PLysS/ p GEX-4T-2-A并進(jìn)行相應(yīng)菌株的保種．重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-A構(gòu)建示意圖如圖1所示．

(4)融合蛋白GST-Pla A表達(dá)形式的鑒定．從平板上挑取單菌落PLysS/p GEX-4T-2-A接種至5 m L LB/Amp液體培養(yǎng)基中,在37℃、200 r/min下過夜培養(yǎng)．次日,轉(zhuǎn)接1 m L菌液至100 m L LB培養(yǎng)基中,同樣條件下振蕩培養(yǎng)至OD值為0．5時(shí)加入終濃度為0．2 m M IPTG培養(yǎng)4 h后收菌．4 000 r/min離心,收集菌體,重懸,超聲破碎后分別制備全菌,破碎上清,破碎沉淀蛋白樣品．樣品經(jīng)煮沸5 min、12 000 r/min離心,上樣,SDS-PAGE鑒定融合蛋白的表達(dá)形式．

(5)融合蛋白GST-Pla A誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化．依照誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、添加IPTG時(shí)的OD值和IPTG加量進(jìn)行融合蛋白GST-Pla A表達(dá)量的優(yōu)化．誘導(dǎo)溫度梯度設(shè)為28℃、31℃、34℃、37℃、40℃;誘導(dǎo)時(shí)間梯度設(shè)為0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h;加入IPTG時(shí)的OD值梯度設(shè)為0．1、0．3、0．5、0．8、1．0、1．2;IPTG加量終濃度梯度設(shè)為0、0．01 m M、0．05 m M、0．1 m M、0．2 m M、0．5 m M、1．0 m M、2．0 m M．誘導(dǎo)結(jié)束后,制樣,SDS-PAGE電泳確定融合蛋白GST-PlaA最優(yōu)表達(dá)條件．

圖1 p GEX-4T-2-A重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2 結(jié)果與分析

2．1 AP28質(zhì)粒(模版)的提取及pla A基因PCR擴(kuò)增

AP28質(zhì)粒的提取如圖2所示．以AP28質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增Pla A基因片段如圖3所示．由圖3可知,擴(kuò)增產(chǎn)物在goldview染色后的1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,凝膠成像可見一條約1 000 bp大小的條帶,與理論大小為966 bp的Pla A基因片段相符,表明目的基因Pla A片段擴(kuò)增成功．

2．2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-A轉(zhuǎn)化后的菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證

以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的菌液為模板進(jìn)行PCR篩選,結(jié)果擴(kuò)增出約1 000 bp大小片段(見圖4),與PlaA基因大小相符．同時(shí),用Bam HΙ和EcoRΙ雙酶切重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-A,獲得約5 000 bp和1 000 bp大小的兩個(gè)片段,與質(zhì)粒p GEX-4T-2和PlaA基因的理論大小相符(見圖5)．兩種方法驗(yàn)證結(jié)果說明PlaA基因已插入pGEX-4T-2質(zhì)粒中．

2．3 重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-A的測(cè)序

對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-A的測(cè)序結(jié)果表明,Pla A基因的核酸序列正確,且在表達(dá)質(zhì)粒上的基因框架與設(shè)計(jì)相同,說明重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-A構(gòu)建成功．

圖2 AP28質(zhì)粒的提取

圖3 Pla A基因的擴(kuò)增

圖4 重組菌的菌落PCR

圖5 重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-A的雙酶切

2．4 SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白GST-PlaA表達(dá)形式

PLa A蛋白的理論分子量為35 KDa,GST蛋白的理論分子量為26 KDa,融合蛋白GST-Pla A的理論分子量大小應(yīng)該為兩個(gè)蛋白大小之和,即約為61 KDa．重組菌株的SDS-PAGE如圖6所示．由圖6可知, PLysS/pGEX-4T-2-A全菌樣品的SDS-PAGE電泳檢測(cè)出其表達(dá)了理論大小約為61 KDa的融合蛋白GST-Pla A．進(jìn)一步從破碎上清和破碎沉淀的電泳中可以看出,理論大小的融合蛋白GST-PlaA絕大部分存在于破碎沉淀中,而在破碎上清中看不出有無GST-Pla A蛋白表達(dá)．所以,從表達(dá)菌株不同位置的SDSPAGE檢測(cè)結(jié)果表明,目的融合蛋白GST-Pla A主要是以包涵體形式表達(dá)的．原因可能是蛋白質(zhì)表達(dá)過快,來不及正確折疊．

2．5 融合蛋白GST-Pla A誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

(1)誘導(dǎo)溫度對(duì)融合蛋白GST-Pla A表達(dá)的影響．取1 m L過夜培養(yǎng)的PLysS/p GEX-4T-2-A菌液接種至已加氨芐青霉素的100 m L LB培養(yǎng)基中．37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD值為0．5加入終濃度為0．2 m M的IPTG后,分別在28℃、31℃、34℃、37℃和40℃誘導(dǎo)4 h后收菌,分別制樣品,SDS-PAGE電泳檢測(cè)．誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)水平的影響如圖7所示．由圖7可知,在28℃上升至40℃過程中,融合蛋白GST-Pla A的表達(dá)量先增加后降低,且在37℃時(shí)GST-Pla A表達(dá)量達(dá)到最高．所以,選擇37℃作為最佳誘導(dǎo)溫度．

(2)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白GST-Pla A表達(dá)的影響．取1 m L過夜培養(yǎng)的PLysS/p GEX-4T-2-A菌液接種至已加氨芐青霉素的100 m L LB培養(yǎng)基中．37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD值為0．5加入終濃度為0．2 m M的IPTG后,37℃條件下分別在誘導(dǎo)0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h時(shí)取樣,制樣品,SDSPAGE電泳檢測(cè)．誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)水平的影響如圖8所示．由圖8可知,從0～14 h過程中,融合蛋白GST-Pla A的表達(dá)量逐漸升高,在8 h達(dá)到最大值,之后誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量明顯降低．所以,確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h．

圖6 重組菌株的SDS-PAGE

圖7 誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)水平的影響

(3)IPTG加入時(shí)的OD值對(duì)融合蛋白GST-Pla A表達(dá)的影響．取1 m L過夜培養(yǎng)的PLysS/p GEX-4T-2-A菌液接種至已加氨芐青霉素的100 m L LB培養(yǎng)基中．37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD值分別為0．1、0．3、0．5、0．8、1．0和1．2時(shí)加入終濃度為0．2 m M的IPTG,37℃誘導(dǎo)8 h后收菌,分別制樣品,SDS-PAGE電泳檢測(cè)．誘導(dǎo)起始OD值對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)的影響如圖9所示．由圖9可知,當(dāng)IPTG誘導(dǎo)初始OD值從0．1～0．8時(shí),融合蛋白GST-Pla A的表達(dá)量上升至最高,OD值大于0．8后隨著OD值的上升表達(dá)量下降．因此,選擇的最佳OD值為0．8．

圖8 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)水平的影響

圖9 誘導(dǎo)起始OD值對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)的影響

(4)IPTG濃度對(duì)融合蛋白GST-Pla A表達(dá)的影響．取1 m L過夜培養(yǎng)的PLysS/pGEX-4T-2-A菌液接種至已加氨芐青霉素的100 m L LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD值為0．8時(shí)分別加入終濃度0、0．01 m M、0．05 m M、0．1 m M、0．2 m M、0．5 m M、1．0 m M和2．0 m M的IPTG, 37℃誘導(dǎo)8 h收菌,分別制樣品,后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)．IPTG濃度對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)的影響如圖10所示．由圖10可知,當(dāng)IPTG終濃度為0．5 m M 時(shí),GST-Pla A蛋白表達(dá)水平最高．誘導(dǎo)劑終濃度過低,沒有融合蛋白表達(dá),誘導(dǎo)劑終濃度大于0．5時(shí),表達(dá)水平保持穩(wěn)定且稍有下降．因此,確定最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0．5 m M．

圖10 IPTG濃度對(duì)GST-Pla A蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

包涵體形成的原因很多,如蛋白質(zhì)表達(dá)過快、異源蛋白的錯(cuò)誤折疊、蛋白質(zhì)分子間的化學(xué)作用等．磷脂酶A1可以分解磷脂,細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層組成,因而有可能對(duì)細(xì)胞膜有毒副作用．而宿主菌為了自身的保護(hù)作用,也有可能導(dǎo)致GST-Pla A以包涵體形式表達(dá)．對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、加入IPTG時(shí)的OD值和IPTG加量這4個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化．由于誘導(dǎo)溫度過低或過高、誘導(dǎo)時(shí)間過短或過長、加入IPTG 時(shí)OD值過低或過高以及IPTG濃度過低或過高,都會(huì)影響菌體GST-Pla A的表達(dá)水平．這是由于大腸桿菌有自己的最適培養(yǎng)溫度,菌體內(nèi)代謝酶受溫度影響,溫度過低或過高都不利于細(xì)菌的生長,進(jìn)而影響重組蛋白表達(dá)．誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體重組蛋白的表達(dá)影響明顯,時(shí)間過短,IPTG還沒有來得及誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白;而時(shí)間過長,IPTG的毒副作用以及菌體自身的衰亡,也導(dǎo)致目的重組蛋白表達(dá)量降低．加入IPTG時(shí)的OD過低,菌體量過少影響重組蛋白表達(dá);過高又會(huì)因?yàn)榫w自溶同樣降低重組蛋白的表達(dá)．而鑒于IPTG的經(jīng)濟(jì)性和對(duì)宿主的毒性,IPTG濃度過低不足以誘導(dǎo)表達(dá);過高對(duì)宿主有一定的抑制作用,同樣會(huì)使重組蛋白表達(dá)量降低．利用基因工程方法生產(chǎn)重組蛋白的關(guān)鍵是高表達(dá)、易純化和高生物活性,而高表達(dá)是原核表達(dá)技術(shù)的基礎(chǔ)．綜上所述,根據(jù)以上4個(gè)條件的優(yōu)化,確定PlysS/p GEX-4T-2-A菌株誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為:在OD值為0．8時(shí)加入終濃度為0．5 m M的IPTG,37℃誘導(dǎo)8 h．希望在此重組融合蛋白GST-PlaA高表達(dá)條件下,能夠通過包涵體的變復(fù)性得到預(yù)期高活性以及易純化蛋白．

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Construction of expressive system pGEX-4T-2-A and the expression and optimization of its GST-PlaA fusion protein

LIU Kai-fang,XUE Zheng-lian?,WANG Zhou
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:To construct a recombinant plasmid p GEX-4T-2-A for GST-Pla A fusion protein expression．PCR was used to amplify phopholipase A1 gene from Serratia marcescens PL-06 named pla A and inserted into the pGEX-4T-2 vector．The recombinant plasmid was transformed to Escherichia coli JM109 strains to screen the positive recombinant clones and then sent to be sequenced．The correct sequenced recombinant plasmid was transformed to a Escherichia coli BL21(DE3)PLysS strains and the GST-Pla A fusion protein expression after IPTG induction was confirmed by SDS-PAGE analysis．Its cultivation conditions was also optimized．The plasmid p GEX-4T-2-A was constructed successfully,the GST-Pla A fusion protein expressed in the form of inclusion bodies．While the OD was 0．8 and induced at 37℃for 8 h with 0．5 m M IPTG,the GST-Pla A fusion protein expression was at the highest level．This experiment established the foundation for the purification and function of phospholipase A1 protein．

Key words:phospholipase A1;fusion protein;SDS-PAGE;expression conditions

中圖分類號(hào):Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

收稿日期:2015-10-26

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471615,31501465)

作者簡介:劉開放(1990-),男,安徽亳州人,碩士研究生．

通訊作者:薛正蓮(1967-),女,安徽蕪湖人,教授,碩導(dǎo)．