賈建磊++張勤文++張紅見++李莉++丁欣++李紅征++趙靜

摘 要：以青藏高原有機牦牛為研究對象，采用超聲波破碎法提取生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉蛋白， Bradford法進行蛋白質(zhì)定量后，進行雙向電泳，通過PD Quest凝膠圖像分析軟件篩選3 倍或3 倍以上的差異斑點進行基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF），并用Mascot軟件鑒定差異蛋白，以建立青藏高原有機牦牛生鮮肉和冷藏肉背最長肌差異蛋白質(zhì)組學研究方法。結(jié)果表明：經(jīng)雙向電泳圖譜分析所獲得的青藏高原有機牦牛生鮮肉和冷鮮肉背最長肌肌肉蛋白斑點數(shù)分別為1 840±181和2 034±86，分布于pH 3.0～10.0之間，PD Quest軟件篩選青藏高原有機牦牛生鮮肉和冷藏肉背最長肌差異3 倍或3 倍以上蛋白質(zhì)斑點36 個，其中生鮮肉相比冷藏肉有機牦牛背最長肌肌肉蛋白上調(diào)的有12 個點，下調(diào)的有24 個點，質(zhì)譜鑒定有意義的差異蛋白質(zhì)點7 個（蛋白質(zhì)得分>65）（P<0.05），其中2 種蛋白質(zhì)表達量上調(diào)，5 種蛋白質(zhì)表達量下調(diào)。

關鍵詞：有機牦牛；背最長??；冷藏肉；生鮮肉；蛋白質(zhì)組學

肉類產(chǎn)品食用品質(zhì)的大幅下降引發(fā)了人們對現(xiàn)代肉品品質(zhì)及其評價標準的深入思考，尋找一種科學的肉品品質(zhì)評價方法并對其品質(zhì)進行控制已成為國內(nèi)外研究的熱點。肉品品質(zhì)的形成機理與肉質(zhì)性狀高度相關，而幾乎所有的肉質(zhì)性狀都受到復雜的基因和蛋白質(zhì)調(diào)控。已有的研究主要集中在對豬肉等肉質(zhì)進行感官、理化特性和組織學特性的評價，尚未見到應用差異蛋白質(zhì)組學方法對青藏高原有機牦牛宰后生鮮肉及冷藏肉品質(zhì)的形成機理、評價和控制進行研究的報道。

本研究以同一飼養(yǎng)環(huán)境和屠宰條件，宰后以不同貯藏溫度（4、18 ℃）、不同貯藏時間（0、24 h）的生鮮和冷藏有機牦牛肉作為研究對象，以差異蛋白質(zhì)組學技術為研究平臺，篩選與分析生鮮和冷藏的有機牦牛背最長肌肌肉的差異蛋白質(zhì)，為進一步探討有機牦牛肌肉加工過程蛋白質(zhì)的降解規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青藏高原有機牦牛背最長肌肌肉組織取自青海省河南縣有機牦牛背最長?。ǖ谄吒刈档阶詈笠桓刈担４?zhèn)溆谩?/p>

2D裂解液、蛋白質(zhì)定量試劑盒、IPG緩沖液 美國Bio-Rad公司；尿素、硫脲、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（3-（3-cholamidopropyl）dimethylammoniopropanesulfonic acid，CHAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、Tris-HCl、甘油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、甘氨酸 美國Sigma公司；

其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

雙向凝膠電泳系統(tǒng)、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干膠條、Image Master 2D Platinum凝膠成像系統(tǒng) 美國GE公司；PD Quest軟件 美國

Bio-Rad公司；5800基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF） 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

生鮮（宰后18 ℃、0 h）和冷藏（宰后4 ℃、24 h）有機牦牛背最長肌肌肉樣品每份取約0.5 g，加入1 mL 2D裂解液，勻漿（4 m/s、勻漿15 s、停頓2 min），勻漿間隙放于冰上冷卻，重復操作3 次[1]。再對勻漿液進行冰浴超聲破碎（100 W、超聲10 s、間歇15 s），重復操作10 次，13 400 r/min條件下離心15 min，取上清液。

1.3.2 蛋白質(zhì)定量

采用Bradford法進行蛋白質(zhì)定量，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙向電泳

取總蛋白提取物100 μg，上樣量為450 μL，pH 3～10非線性IPG膠條17 cm進行等電聚焦電泳，條件為：30 V、12h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h。等電聚焦結(jié)束后采用12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）膠進行垂直電泳，條件為：15 mA/膠、30 min，30 mA/膠至溴酚藍離膠下沿0.5 cm。垂直電泳結(jié)束采用銀染法進行凝膠染色。

1.3.4 圖像采集

采用Image Master 2D Platinum凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行灰度掃描。所獲得掃描圖像通過PD Quest分析軟件進行差異蛋白質(zhì)組分析。

1.3.5 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索

采用5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對差異蛋白進行質(zhì)譜檢測。生物質(zhì)譜的操作過程：切膠→膠內(nèi)酶解→

ZipTip脫鹽→抽提酶解肽段→MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜測試→數(shù)據(jù)分析→蛋白質(zhì)鑒定。利用Mascot軟件搜索Uniport、Swiss-Port數(shù)據(jù)庫尋找匹配的相關蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bradford定量

采用Bradford方法利用Nano Photometer P360超微量分光光度計對生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉全蛋白質(zhì)提取量進行測定。以1 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液制作標準曲線，以蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得出y=0.003x-0.020（R2=0.988）。由標準曲線公式可知，標準曲線線性關系良好，可以用于實驗蛋白質(zhì)含量的測定。

2.2 雙向電泳

經(jīng)雙向電泳及銀染后獲得生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉全蛋白雙向電泳圖譜（圖1）及差異蛋白在2-DE圖譜中的位置（圖2）。匹配后利用PD Quest軟件分析篩選差異點，實驗結(jié)果顯示雙向電泳圖譜具有較高的重復性，匹配率為75%。

通過PD Quest軟件對蛋白圖譜進行分析，生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉組織的雙向電泳凝膠的平均蛋白點數(shù)分別為1 840±181和2 034±86，其中具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）且差異在3 倍或3 倍以上的蛋白質(zhì)點共有36 個，其中生鮮有機牦牛背最長肌肌肉相比冷藏肉蛋白上調(diào)12 個點，下調(diào)24 個點。

2.3 質(zhì)譜分析

選取PD Quest軟件檢測相對含量差異3 倍或3 倍以上的蛋白質(zhì)點，手動取出凝膠上差異的蛋白質(zhì)斑點（共計36 個蛋白質(zhì)點），裝入1.5 mL離心管中超純水沖洗干凈后進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜檢測，結(jié)果得到7 個匹配有意義的差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果（表1）。其中，生鮮有機牦牛背最長肌肌肉比冷藏的磷酸丙糖異構酶和熱休克蛋白β-6含量上調(diào)，其余含量下調(diào)。

3 討 論

運用蛋白質(zhì)組學技術對動物肌肉貯藏過程中蛋白質(zhì)組分變化的研究是目前研究的熱點之一。幾乎所有動物肌肉組織的蛋白質(zhì)表達譜都有研究，針對青藏高原特有物種——有機牦牛，僅有少量關于感官、系水力、嫩度等理化性質(zhì)方面的研究資料[2-3]，而對宰后生鮮肉及冷鮮肉品質(zhì)的形成機理、評價和控制方面的研究則鮮見報道。有機牦牛肉品質(zhì)是影響其商品價值的重要因素之一，因其具有復雜而多元的特性，所以研究屠宰后生鮮和冷鮮牦牛肉蛋白質(zhì)變化的生理生化機制及其對嫩度等肉質(zhì)性狀的作用，對于探討有機牦牛肉肌肉生長與肉品品質(zhì)間的相關性以及貨架期的生化反應特點具有重要的意義。

據(jù)報道，動物屠宰后肌肉細胞在一定時間內(nèi)開始死亡，并根據(jù)細胞類型發(fā)生一系列獨特、復雜的分子變化。動物血液循環(huán)終止后供氧停止，且不能去除新陳代謝產(chǎn)物，肌內(nèi)糖原酵解導致乳酸積累，pH值降低，進而導致肌肉持水能力降低及鈣離子釋放，肌球蛋白與肌動蛋白間形成交聯(lián)橋[4]。本研究發(fā)現(xiàn)了7 種在生鮮牦牛肉和冷藏牦牛肉背最長肌中含量有顯著差異的蛋白質(zhì)，其中TPI及KRT4蛋白、肌球蛋白-6、AKI4蛋白質(zhì)是糖酵解和三羧酸循環(huán)的關鍵蛋白質(zhì)。在有機牦牛肉中TPI和HSP β-6含量上調(diào)，肌球蛋白-6和AKI4含量下調(diào)，其原因可能是宰后肌肉為滿足ATP供應而提高了厭氧能量代謝，這些差異蛋白質(zhì)與肉品性狀顯著相關。Jia等[5]應用蛋白質(zhì)組學方法研究牛過度生長的現(xiàn)象，結(jié)果表明肌肉生長抑制素基因上有11 對堿基缺失導致了13 種肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生了改變，包括收縮蛋白和代謝蛋白，這些蛋白質(zhì)大部分是來自有收縮性的器官組織，并能夠加快肌纖維的收縮功能，這與本研究結(jié)果相似。另外Lomiwes等[6]利用蛋白質(zhì)組分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48 h肌肉的蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)為5～200 kD不等，pH值為4～9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15 種顯著變化。Kim[7]、毛衍偉[8]等指出羊的雙肌臀突變導致臀部肌肉異常發(fā)達主要是由于18號染色體的突變，導致鈣激活中性蛋白酶抑制蛋白的活性增強了2～3 倍。

近幾年通過蛋白質(zhì)組學的研究，揭示了結(jié)構蛋白、糖酵解酶和熱休克蛋白/伴生蛋白在肌肉嫩化中的作用[9-11]。

研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)嫩度將牛背最長肌分組，使用熒光差異雙向電泳技術分析其蛋白質(zhì)組后發(fā)現(xiàn)，表達存在差異的蛋白包括糖酵解酶和結(jié)構蛋白，高嫩度牛肉樣品的肌漿蛋白質(zhì)組分中肌球蛋白輕鏈的量相對較高，可以作為預測牛肉蛋白水解和最終嫩度的標記蛋白質(zhì)[12-14]。

Dutaud等[15]研究表明，安格斯牛肉宰后成熟過程中3 種蛋白表達量降低可能由于發(fā)生了等電點沉淀，推測有機牦牛肉成熟過程中表達量降低可能由于pH值的降低，發(fā)生等電點沉淀所造成。

綜上所述，通過雙向凝膠電泳結(jié)合生物質(zhì)譜技術測定生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉差異蛋白質(zhì)，初步篩選出生鮮肉與冷藏肉的差異表達蛋白質(zhì)，涉及糖酵解蛋白、熱應激蛋白、結(jié)構蛋白等，說明這些蛋白在有機牦牛肉貯藏過程中對肉品質(zhì)的影響發(fā)揮了重要的作用。

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