李東萍++張展++郭珊珊++羅永康

摘 要：為了研究酶解時間、pH值及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小對鳙魚（Aristichthys nobilis）魚肉蛋白酶解產(chǎn)物加工特性及抗氧化性的影響，本研究采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對鳙魚魚肉進行酶解，對其酶解產(chǎn)物進行加工特性和抗氧化性分析。結(jié)果表明：2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物在pH 4條件下的溶解性和熱穩(wěn)定性均低于pH 7。其中，堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解產(chǎn)物分別在酶解4.0 h和1.0 h具有較優(yōu)的溶解性及熱穩(wěn)定性。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的亞鐵離子螯合能力，而乳化性、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率及還原力則是風味蛋白酶酶解產(chǎn)物更優(yōu)。酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性受蛋白酶種類、酶解時間、pH值及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小的影響。

關鍵詞：鳙魚；魚肉；酶解產(chǎn)物；加工特性；抗氧化性

鳙魚（Aristichthys nobilis）又叫花鰱、胖頭魚，是中國四大家魚之一，分布范圍較廣，具有較高的營養(yǎng)價值及經(jīng)濟價值[1]，但由于其肉質(zhì)口感較差，土腥味嚴重，而且消費者更喜食鳙魚頭的一系列原因，造成了鳙魚魚身銷量不佳的現(xiàn)狀。因此，對鳙魚肉進行再加工，提高其附加值是目前亟待解決的問題。動植物蛋白多肽鏈內(nèi)部普遍存在著功能區(qū)，功能區(qū)中所蘊藏的生物活性肽在母體的蛋白質(zhì)序列內(nèi)不具生物活性，但是通過蛋白酶酶解后即可發(fā)揮特定的功能[2]。因此，近年來通過制備動植物蛋白酶解產(chǎn)物進而提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值已然成為熱點[3-5]。

目前，國內(nèi)外對于利用生物酶解技術開發(fā)食源性生物活性肽已有大量報道[6-11]，對蛋白酶解產(chǎn)物功能的研究也有一定報道，主要包括加工特性（溶解性、熱穩(wěn)定性及乳化性等）及抗氧化性（（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及總還原力等）[12-16]。但對鳙魚蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性尚未進行系統(tǒng)研究。因此，本實驗采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶分別酶解鳙魚魚肉，對其酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性進行研究，以期為魚肉蛋白的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚購于北京市小月河農(nóng)貿(mào)市場（質(zhì)量

（1 390±200）g，體長（44±1）cm）?；铙w運至實驗室后敲擊頭部致死，迅速去鱗、頭、內(nèi)臟、骨，洗凈后取肉（白肉），用高速勻漿機攪成肉糜。

堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；風味蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）、DPPH、啡咯嗪 美國Sigma公司；其他試劑均為化學分析純。

1.2 儀器與設備

UNICO-2700分光光度計 美國Unic公司；FE20梅特勒-托利多實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1PF冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；TGL-16A臺式高速冷凍離心機 上海安亭科技儀器廠；LM-125中空纖維超濾設備 北京旭邦膜設備有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的制備

鳙魚魚糜+去離子水→混合調(diào)整蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至5 g/100 mL→95 ℃水浴10 min（滅內(nèi)源性蛋白酶）→勻漿→分別添加堿性蛋白酶（pH 8.0，55 ℃）、風味蛋白酶（pH 7.0，50 ℃）→分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h→95 ℃水浴10 min（滅酶）→3 600 r/min離心20 min→取上清液

處理1：上清液直接-60 ℃冷凍干燥；處理2：上清液→5 kD超濾分離→透過液3 kD超濾分離→各區(qū)分物濃縮→-60 ℃冷凍干燥

1.3.2 酶解產(chǎn)物加工特性的測定

溶解度的測定參考李雪等[17]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分別調(diào)節(jié)到4和7。熱穩(wěn)定性的測定參考Fujiwara等[18]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分別調(diào)節(jié)到4和7。乳化性的測定參考Pearce等[19]的方法。

1.3.3 酶解產(chǎn)物抗氧化性的測定

DPPH自由基清除能力測定參考Bougatef等[20]的方法。亞鐵離子螯合力的測定參考Decker等[21]的方法?？傔€原力的測定參考Yildirim等[22]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性

2.1.1 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物溶解性

由圖1可知，經(jīng)堿性蛋白酶及風味蛋白酶處理的鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物在pH 4和pH 7兩種條件下具有較好的溶解性，均高于60%。2 種蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性在pH 7條件下較pH 4條件下高，即酶解產(chǎn)物在酸性條件下溶解性較小。李雪等[23]得到了相似的研究結(jié)果，經(jīng)堿性蛋白酶酶解鰈魚下腳料的酶解產(chǎn)物的溶解性在pH 7時較pH 4時高。此外，這一結(jié)果也與鱈魚、鲅魚等的研究結(jié)果類似[24]。在pH 7條件下堿性蛋白酶酶解4.0 h的酶解產(chǎn)物溶解度最高，達到71.82%。在pH 7條件下風味蛋白酶酶解1.0 h的酶解產(chǎn)物溶解度最高，達到74.29%。

2.1.2 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物熱穩(wěn)定性

由圖2可知，經(jīng)堿性蛋白酶及風味蛋白酶處理的鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物在pH 7條件下的熱穩(wěn)定性均較pH 4條件下的高。風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性在酶解1.0 h為最高，達到72.31%（pH 4）和74.00%（pH 7）。而堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性在酶解4.0 h為最高，達到72.98%（pH 4）和75.12%（pH 7）。熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果同溶解性的結(jié)果有較好的一致性。

2.1.3 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物乳化性

蛋白質(zhì)分子的乳化性主要受其分子質(zhì)量、疏水基團數(shù)量、彈性及分子結(jié)構(gòu)所影響。一定程度的酶解可以使蛋白質(zhì)溶解度增大，從而使魚肉蛋白的乳化性得到有效提高，但如果酶解過度，小分子肽及氨基酸的含量增加過大，反而不利于乳化性的提高[25-26]。

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)逐漸升高，酶解4.0 h時達到247.50 m2/g。風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)在前1.0 h酶解時，逐漸升高，酶解1.0 h時達到369.09 m2/g，之后稍有降低。

2.2鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性

2.2.1 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力

由圖4a可知，經(jīng)堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解的鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物均具有較強的亞鐵離子螯合能力。這可能是酶解過程中，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出的羧基以及在氨基酸側(cè)鏈中存在的酸性和堿性氨基酸殘基的原因[27]。在不同酶解時間條件下，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合力均顯著高于風味蛋白酶酶解產(chǎn)物

（P<0.05）。酶解0.5 h的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合力最高，為89.59%，之后隨著酶解時間的延長逐漸降低，而風味蛋白酶則呈現(xiàn)波動變化，且在整個酶解過程中不存在顯著性差異（P>0.05）。圖4b為超濾所得的不同分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力的差異，分子質(zhì)量小于3 kD的酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力顯著高于高分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物，且堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力較風味蛋白酶酶解產(chǎn)物高，這與

圖4a保持了較好的一致性。此外有研究表明，菜豆堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物[28]及草魚魚肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物[29]均具有較強的亞鐵離子螯合能力。

酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力的影響

2.2.2 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率

酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基清除能力，指酶解產(chǎn)物能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應，并起到降低羥自由基、烷自由基或過氧化自由基的濃度的作用[30]。由圖5a可知，酶解0.5 h的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，為50.23%。在0.5～1.5 h，堿性蛋白酶DPPH自由基清除率逐漸降低，隨后至4.0 h，趨于平緩。而風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率則緩慢升高至2.0 h后趨于平緩，酶解3.0 h時達到最高為71.48%。不同酶解時間條件下，風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05）。由圖5b可知，實驗中3 種分子質(zhì)量酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率差異不大，但風味蛋白酶酶解產(chǎn)物顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05），這與圖5a的結(jié)果相一致。有研究表明，酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸的含量影響酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率，疏水性氨基酸含量越高，DPPH自由基清除率越強[31]。因此推測，2 種酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率有所差異是由于酶解體系及酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量不同。

2.2.3 鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物還原力

產(chǎn)物還原力的影響

由圖6a可知，2 種酶解產(chǎn)物均具有一定的還原力。同DPPH自由基清除率結(jié)果相似，隨著酶解時間延長，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力逐漸降低后趨于平緩；酶解0.5 h時，還原力最高。風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05），但同酶解時間關系不大。由圖6b可知，不同分子質(zhì)量大小的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力差異不大，而分子質(zhì)量小于3 kD的風味蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的還原力。

3 結(jié) 論

酶解時間、蛋白酶種類以及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小是鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性和抗氧化性的影響因素。堿性蛋白酶及風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解性及熱穩(wěn)定性分別在酶解4.0 h及酶解1.0 h時最優(yōu)，2 種酶解產(chǎn)物pH 7條件下的溶解性和熱穩(wěn)定性均較pH 4條件下更好。風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性優(yōu)于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性。

鳙魚魚肉堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的亞鐵離子螯合能力，而風味蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更好的DPPH自由基清除率及還原力。分子質(zhì)量<3 kD的鳙魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力顯著高于高分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物，而不同分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率差異不大。還需進一步的實驗驗證2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性，例如將2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物加入魚糜中，通過測定過氧化物值、共軛二烯值等進行驗證。此外，不同蛋白酶的添加、蛋白酶之間的復配添加對酶解產(chǎn)物加工特性及抗氧化性的影響有待研究。

參考文獻：

[1] 姜啟興， 吳佳芮， 許艷順， 等. 鳙魚不同部位的成分分析及營養(yǎng)評價[J].

食品科學， 2014， 35（5）： 183-187. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201405036.

[2] MEISEL H， BOCKELAANN W. Bioactive peptides encrypted in milk proteins： proteolytic activation and thropho-functional properties[J]. Antonie Van Leeuwenhoek， 1999， 76（1/4）： 207-215. DOI：10.1023/A：1002063805780.

[3] ABEYRATHNE E D N S， LEE H Y， JO C， et al. Enzymatic hydrolysis of ovomucin and the functional and structural characteristics of peptides in the hydrolysates[J]. Food Chemistry， 2016， 192： 107-113. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.06.055.

[4] 孫協(xié)軍， 李秀霞， 蔡路昀， 等. 鲅魚蛋白水解產(chǎn)物功能性質(zhì)分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（6）： 179-184. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.032.

[5] JIA J， ZHOU Y， LU J， et al. Enzymatic hydrolysis of Alaska pollack （Theragra chalcogramma） skin and antioxidant activity of the resulting hydrolysate[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010， 90（4）： 635-640. DOI：10.1002/jsfa.3861.

[6] 胡方園. 酶法制備鳙魚低聚肽及其抗氧化活性研究[D]. 無錫： 江南大學， 2012.

[7] MEGIAS C， PEDROCHE J， YUST M D M， et al. Sunflower protein hydrolysates reduce cholesterol micellar solubility[J]. Plant Foods for Human Nutrition， 2009， 64（2）： 86-93. DOI： 10.1007/s11130-009-0108-1.

[8] ROBITAILLE G， LAPOINTE C， LECLERC D， et al. Effect of pepsin-treated bovine and goat casein omacropeptide on Escherichia coli and Lactobacillus rhamnosus in acidic conditions[J]. Journal of Dairy Science， 2012， 95（1）： 1-8. DOI：10.3168/jds.2010-4142.

[9] HOYLE N T， MERRLTT J H. Quality of fish protein hydrolysates from herring （Clupea harengus）[J]. Journal of Food Science， 1994， 59（1）： 76-79. DOI：10.1111/j.1365-2621.1994.tb06901.x.

[10] JAMDAR S N， RAJALAKSHMI V， PEDNEKAR M D， et al. Influence of degree of hydrolysis on functional properties， antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut hydrolysate[J]. Food Chemistry， 2010， 121（1）： 178-184. DOI： 10.1016/j.foodchem.2009.12.027.

[11] BYUN H G， LEE J K， PARK H G， et al. Antioxidant peptides isolated from the marine rotifer， Brachionus rotundiformis[J]. Process Biochemistry， 2009， 44（8）： 842-846. DOI：10.1016/j.procbio.2009.04.003.

[12] 趙玉紅， 王瑋. 魚蛋白水解物功能特性的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報， 2001， 32（2）： 175-180.

[13] WASSWA J， TANG J， GU X H， et al. Influence of the extent of enzymatic hydrolysis on the functional properties of protein hydrolysate from grass carp （Ctenopharyngodon idella） skin[J]. Food Chemistry， 2007， 104（4）： 1698-1704. DOI：10.1016/j.foodchem.2007.03.044.

[14] 刁靜靜， 孔保華， 陳洪生. 骨蛋白水解物的功能特性及抗氧化性的研究進展[J]. 肉類研究， 2007， 21（6）： 26-29. DOI：10.3969/j.issn.1001-8123.2007.06.012.

[15] 郭浩楠， 袁曉晴， 楊榮華. 鰱魚蛋白的酶解及其酶解物功能性的研究[C]//中國食品科學技術學會第六屆年會暨第五屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集， 2009.

[16] 袁曉晴， 胡燕. 鳙魚魚肉蛋白的酶解及其對功能性質(zhì)的影響[J]. 食品科技， 2012（7）： 136-139.

[17] 李雪， 羅永康， 尤娟. 草魚魚肉蛋白酶解物抗氧化性及功能特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報， 2011（1）： 94-99.

[18] FUJIWARA K， OOSAWA T， SAEKI H. Improved thermal stability and emulsifying properties of carp myofibrillar proteins by conjugation with dextran[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（4）： 1257-1261. DOI：10.1021/jf9708148.

[19] PEARCE K N， KINSELLA J E. Emulsifying properties of proteins： evaluation of a turbidimetric technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1978， 26（3）： 716-723. DOI：10.1021/jf60217a041.

[20] BOUGATE A， NEDJAR-ARROUME N， MANNI L， et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of （Sardinella aurita） by-products proteins[J]. Food Chemistry， 2010， 118（3）： 559-565. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.05.021.

[21] DECKER E A， WELCH B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1990， 38（3）： 674-677. DOI：10.1021/jf00093a019.

[22] YILDIRIM A， MAVI A， KARA A A. Determination of antioxidant and antimicrobial activities of Rumex crispus L. extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49（8）： 4083-4089. DOI：10.1021/jf0103572.

[23] 李雪， 羅永康， 呂元萌， 等. 鰈魚下腳料酶解產(chǎn)物的功能特性[J]. 肉類研究， 2011， 25（7）： 5-7.

[24] 史策， 韓烽烽， 劉鵬， 等. 鱈魚和鲅魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物功能特性及抗氧化性[J]. 肉類研究， 2013， 27（8）： 5-7.

[25] 陳志軍， 李向紅， 劉永樂， 等. 鰱魚蛋白酶法水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)[J]. 食品科學， 2012， 33（5）： 62-65.

[26] CHOBERT J M， BERTRAND-HARB C， NICOLAS M G. Solubility and emulsifying properties of caseins and whey proteins modified enzymically by trypsin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1988， 5： 883-892. DOI：10.1021/jf00083a002.

[27] LIU Q， KONG B H， XIONG Y L， et al. Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis[J]. Food Chemistry， 2010， 118（2）： 403-410. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.05.013.

[28] CARRASCO-CASTILLA J， HERNANDEZ-ALVAREZ A J， JIMENEZ-MARTINEZ C， et al. Antioxidant and metal chelating activities of peptide fractions from phaseolin and bean protein hydrolysates[J]. Food Chemistry， 2012， 135（3）： 1789-1795. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.06.016.

[29] XUE L， LUO Y， SHEN H， et al. Antioxidant activities and functional properties of grass carp （Ctenopharyngodon idellus） protein hydrolysates[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2012， 92（2）： 292-298. DOI：10.1002/jsfa.4574.

[30] 安然， 羅永康， 尤娟， 等. 草魚魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物功能特性及其抗氧化活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2011， 37（8）： 76-80. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.08.030.

[31] POWNALL T L， UDENIGWE C C， ALUKO R E. Amino acid composition and antioxidant properties of pea seed （Pisum sativum L.） enzymatic protein hydrolysate fractions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（8）： 4712-4718. DOI：10.1021/jf904456r.