張衛(wèi)中　辛棟軼　張丹婷　廖南生

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白介素-6反式信號通路抑制劑改善大鼠急性胰腺炎肺損傷

張衛(wèi)中辛棟軼張丹婷廖南生

318020浙江臺州，臺州市第一人民醫(yī)院普外科

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥，約20%～30%患者可發(fā)展成為以胰腺局部壞死和臟器功能衰竭為特征的重癥急性胰腺炎(SAP)。急性肺損傷(acute pancreatitis associated acute lung injury，APALI)是其最常見的并發(fā)癥，患者可出現(xiàn)低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征等臨床表現(xiàn)[1]。研究表明，白細胞介素6(IL-6)在APALI的發(fā)病機制中起重要作用。IL-6根據其跨膜信號傳遞形式不同在炎癥中的作用也不同，其信號傳遞通路主要分為兩種，即經典信號通路和反式信號通路[2]。目前眾多研究集中在經典信號通路，很少涉及到IL-6反式信號通路。本研究采用人工合成的特異性抑制劑(sgp130Fc)阻斷該信號通路，闡明其在大鼠APALI發(fā)病中的保護作用。

一、材料及方法

1．動物模型建立及分組：健康SD雄性大鼠72只，體重(247±35)g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按隨機表法將大鼠分為假手術組、ANP組、干預組，每組24只。大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)模型按照本課題組建立的經膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備[3]。假手術組注射等容積生理鹽水；干預組大鼠在制模前30 min腹腔注射sgp130Fc(江蘇弗泰生物科技提供)100 μg/kg體重(1 mg凍干粉溶于10 ml蒸餾水)。于造模后3、12、24 h分批處死大鼠，每個時間點8只。

2．肺組織髓過氧化物酶(MPO)檢測：取肺組織0.1 g，置冰生理鹽水中洗凈后制備組織勻漿，4℃ 2 300 r/min離心30 min，取上清液0.1 ml加0.167 mol/L鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物以及0.0005%過氧化氫混合液2.9 ml，在恒溫紫外分光光度計460 nm處連續(xù)記錄A460值1 min，以A460值·g-1·min-1表示MPO的活性[4]。

3．肺組織含水量測定：取相同部位的肺組織100 mg，置70℃電熱干燥箱內烘烤24 h，稱干重，以肺組織濕/干比重[(肺濕重-肺干重)/肺干重]表示肺組織含水量。

4．肺微血管通透性檢測：造模后12 h通過左股靜脈注射FITC-標記的血清蛋白5.0 mg/kg體重(Sigma Chemical公司)，12 h后抽血，離心分離血清，-80℃保存；同時氣管內插入18號血管導管，用4 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗肺泡腔，收集肺泡灌洗液(Balf)，重復3次。用熒光分光計分別測量血清和Balf的FITC熒光，激發(fā)光494 nm，發(fā)射光520 nm。以Balf與血清FITC的熒光率比值表示肺微血管滲透性。

5．大鼠肺組織病理學檢測：取剩余肺組織置液氮中保存。融化后常規(guī)行病理學檢查。參考Kusske等[5]和Mayer等[6]標準進行肺臟病理評分。

二、結果

1．肺組織MPO活性變化：假手術組大鼠肺組織MOP活性為(0.56±0.04)A460值·g-1·min-1；ANP 3、12、24 h組分別為(2.21±0.52)、(4.71±0.32)、(7.84±0.11)A460值·g-1·min-1，均顯著高于假手術組，且隨時間延長而增加；干預3、12、24 h組分別為(1.86±0.17)、(2.54±0.27)、(5.74±0.19)A460值·g-1·min-1，干預12、24 h組肺MOP活性均顯著低于ANP同時間點組，但仍顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

2. 肺組織含水量的變化：假手術組大鼠肺含水量為1.57±0.14，ANP 3、12、24 h組分別為3.79±0.21、3.93±0.14、4.11±0.07，均顯著高于假手術組，且隨時間延長而增加；干預3、12、24 h組大鼠肺組織含水量分別為3.47±0.15、3.19±0.11、3.75±0.14，干預組12、24 h組肺含水量均顯著低于ANP同時間點組，但仍顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

3．肺微血管通透性變化：假手術組、ANP 24 h組、干預24 h組肺微血管通透性分別為9.48±0.26、20.89±0.34、11.66±0.13，ANP組肺微血管通透性顯著高于假手術組，干預組較ANP組顯著減輕，但仍顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

4．肺組織病理學改變：假手術組肺組織無明顯的病理改變；ANP組大鼠肺泡壁明顯增厚、間質充血、白細胞浸潤，隨時間延長而加重；干預組大鼠肺組織的病理改變明顯減輕(圖1)。假手術組，ANP 3、12、24 h組，干預3、12、24 h組大鼠肺組織病理評分分別為(0.55±0.52)、(2.25±0.47)、(5.26±0.84)、(5.31±0.69)、(2.14±0.2)、(3.36±0.59)、(3.28±0.71)分，ANP組、干預組均顯著高于假手術組，干預12、24 h組又顯著低于ANP同時間點組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

圖1假手術組(1A，HE×100)、ANP組(1B，HE×200)、干預組(1C，HE×200)肺組織病理改變

討論IL-6信號通路有兩種，一是經典信號通路，該通路中IL-6與細胞膜上的IL-6受體(IL-6R)結合后經受體關聯(lián)的gpl30向胞內傳遞次級信號，但IL-6R僅僅在肝細胞、部分上皮細胞和白細胞膜上表達。在反式信號通路上， IL-6與游離于細胞外液中的sIL-6R結合成復合體，然后再結合至膜表面的gpl30亞單位，進而完成信號傳遞[7-8]。因為gp130蛋白幾乎在所有的細胞中表達，故該信號通路更加廣泛。

gpl30為分子量130 000的糖蛋白，共有14個潛在N-糖基化位點。在生理情況下，gpl30不能直接與配基IL-6結合，當IL-6與IL-6R結合使IL-6R的構象發(fā)生變化后迅速與兩個gpl30分子結合，形成高親和力的結合位點，而可溶性gp130(sgpl30)可抑制sIL-6R/IL-6復合物的活性[8]。人工合成的sgpl30為IgG1-Fc融合蛋白的形式(sgp130Fc)，具備與自然狀態(tài)下sgp130相同的功能，即特異性抑制IL-6反式信號通路的發(fā)生而對經典信號通路無任何抑制作用。

IL-6在AP患者中明顯升高，且與AP的嚴重程度密切相關，也是最早發(fā)現(xiàn)并確認與SAP并發(fā)肺損傷有密切關系的炎性遞質[9]。炎癥發(fā)生時，循環(huán)系統(tǒng)必須提供足夠數(shù)量的sIL-6R與IL-6結合形成復合體，否則反式信號通路將無法實現(xiàn)。本課題組曾報道[3]，ANP大鼠血sIL-6R水平顯著高于假手術組，說明ANP時sIL-6R數(shù)量明顯升高，可與IL-6充分結合介導反式信號通路。外源性應用sgp130Fc與sIL-6R/IL-6復合體結合后，導致sIL-6R和IL-6R數(shù)量明顯下降。

本研究預先應用sgp130干預ANP大鼠，結果顯示，干預后大鼠的肺組織病理學評分、MPO活性及微血管通透性均較ANP組明顯改善，推測其是通過抑制IL-6反式信號通路實現(xiàn)的。

參考文獻

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[2]Zhang H, Neuh?fer P, Song L, et al. IL-6 trans-signaling promotes pancreatitis-associated lung injury and lethality[J]. J Clin Invest, 2013, 123(3):1019-1031. DOI: 10.1172/JCI64931.

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(本文編輯：呂芳萍)

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.014

基金項目：2014年臺州市科技計劃資助項目(14SF06)

通信作者：張衛(wèi)中，Email：zhangweizhong11@hotmail.com

(收稿日期：2015-12-15)