周芹 孫睿男 朱震坤

山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·山東省口腔組織再生重點實驗室，濟南 250012

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熱休克蛋白27在煙草煙霧提取物介導(dǎo)的牙齦成纖維細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化

周芹 孫睿男 朱震坤

山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·山東省口腔組織再生重點實驗室，濟南 250012

［摘要］目的 觀察在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)煙草煙霧提取物（CSE）干預(yù)下，熱休克蛋白（HSP）27在人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）損傷過程中的表達(dá)。方法 取原代培養(yǎng)并經(jīng)過鑒定的3～8代HGFs，采用細(xì)胞劃痕試驗檢測不同刺激質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%）的CSE對HGFs體外遷移的影響，并采用Western blot方法檢測HSP27 在HGFs中的表達(dá)。結(jié)果 CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，細(xì)胞的遷移能力越弱；HSP27在正常HGFs中呈弱陽性表達(dá)，在CSE刺激后的HGFs中呈強陽性表達(dá)，且隨CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，HSP27的相對表達(dá)量有逐漸增高的趨勢，與細(xì)胞遷移能力相反。結(jié)論 HSP27在CSE介導(dǎo)的HGFs損傷中表達(dá)升高，在CSE介導(dǎo)的上皮損傷中有重要作用。

［關(guān)鍵詞］煙草煙霧提取物； 熱休克蛋白27； 人牙齦成纖維細(xì)胞； 上皮損傷

大量臨床和流行病學(xué)資料表明，吸煙是牙周病發(fā)生發(fā)展及愈合過程中的高危因素。煙草煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）是燃燒煙草中的主要成分。有研究［1］表明，CSE可抑制人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）的生長及黏附，而HGFs可通過分泌大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動、增殖、分化以及產(chǎn)生基質(zhì)成分，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一組結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白家族，具有重要的分子伴侶功能：幫助蛋白質(zhì)折疊及移位，防止蛋白質(zhì)聚集，幫助變性蛋白質(zhì)解聚及復(fù)性，促進(jìn)嚴(yán)重受損蛋白質(zhì)的降解，在應(yīng)激作用下可以改變細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激因素的損害。HSP27是該家族的重要成員之一，與腫瘤及細(xì)胞炎癥等的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系［2］，并與上皮創(chuàng)傷愈合、纖維細(xì)胞遷移及黏附存在相關(guān)性。

本實驗通過測定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CSE作用下HGFs 中HSP27的表達(dá)變化，研究HSP27在牙齦組織損傷和愈合中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

α-MEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、雙抗（青霉素100 μg·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1）均購自美國Gibco公司，Ⅰ型膠原酶、Dispase酶均購自美國Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司，HSP27多克隆抗體購自美國CST公司。免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、鼠抗人波形蛋白抗體、鼠抗人角蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白定量試劑盒、β-actin兔多克隆抗體、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司）。

微量分光光度計（Biochrom公司，英國），水平電泳槽、電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；酶標(biāo)儀（上海雷勃分析儀器公司）；倒置相差顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 煙草煙霧提取物的制備 具體提取方法參照文獻(xiàn)［3］并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。香煙為某品牌烤煙型香煙，焦油量14 mg，煙氣中煙堿含量1.0 mg。試驗時取1支香煙和1個三通管，去除濾嘴，將煙嘴插入1 mL槍頭中再與三通管的一通連接，一通與10 mL的注射器連接，另一通與4 mL培養(yǎng)基連接，通過三通的抽氣作用，使煙草燃燒，產(chǎn)生香煙煙霧。模擬人吸煙情況，控制煙霧流量為0.3 L·min-1左右，使香煙燃燒速度接近人的吸煙速度。通過內(nèi)含4 mL無血清α-MEM的吸收瓶來吸收煙霧，制成一定含量的CSE（每毫升0.25支，即1 mL CSE相當(dāng)于含有0.25支香煙的煙霧成分），靜置2 h，將pH值調(diào)整至7.4。采用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾得到100%CSE原液，將其分別稀釋至0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%，所得溶液在30 min內(nèi)用于實驗或于-70 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HGFs原代培養(yǎng) 牙齦組織取材于2013年1—6月于山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診就診患者的因臨床導(dǎo)萌術(shù)切下的牙齦或因種植微創(chuàng)手術(shù)環(huán)切的牙齦（采用2%利多卡因進(jìn)行阻滯麻醉后），切取牙齦后立即浸入含2倍雙抗的α-MEM液中。切除上皮組織，α-MEM液沖洗5～7次，剪成1 mm×1 mm× 1 mm左右的小塊，轉(zhuǎn)移組織塊至15 mL離心管中，加入1 mLⅠ型膠原酶和Dispase酶的混合消化液（Ⅰ型膠原酶3 g·L-1，Dispase酶4 g·L-1，體積比1∶1），37 ℃下消化15 min，每5 min搖晃離心管以使組織塊分散。隨后加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為20%的FBS，中和消化液，1 000 r·min離心5 min后，傾去上清液，加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，吹散組織塊，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用牙科探針將組織塊在瓶壁上擺放均勻，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)。待組織塊貼壁1～2 h后，補加3 mL原代細(xì)胞培養(yǎng)液（體積分?jǐn)?shù)20% FBS+α-MEM）。1～2周左右可見細(xì)胞貼滿瓶底，取第3～8代細(xì)胞用于實驗。

1.2.3 細(xì)胞來源的鑒定 將第4代HGFs細(xì)胞消化，接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，4%甲醛固定30 min。按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明步驟行細(xì)胞角蛋白和波形絲蛋白抗原抗體反應(yīng)（稀釋度均為1∶100），按DAB顯色試劑盒說明顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇逐級脫水，吹干后樹脂封片。

1.2.4 噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］法測定CSE對HGFs增殖的作用 取6塊96孔板，分別接種第4代HGFs，細(xì)胞密度為每孔1×104個，每種細(xì)胞接種3塊板，每孔加入α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL。接種12 h，待細(xì)胞貼壁后，吸出原培養(yǎng)液，分別加入含CSE為0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%的培養(yǎng)液，每種質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)12、24、48 h后取出1個培養(yǎng)板，相繼加入MTT和DMSO，用酶標(biāo)儀測定各孔的A490值，用以確定最佳CSE刺激時間及質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度。

1.2.5 細(xì)胞劃痕試驗檢測CSE對HGFs遷移的影響 使用α-MEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基，于6孔板中接種HGFs，細(xì)胞密度為每孔1×106個，每種質(zhì)量分?jǐn)?shù)每種細(xì)胞各設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至70%～90%融合時即細(xì)胞劃痕前12～18 h，更換1%雙抗無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞饑餓12～18 h后，用200 μL槍頭于每個孔的中央部位劃一道直線，人造細(xì)胞劃痕，寬約1 mm。用PBS清洗3次，洗掉劃痕過程中的脫落細(xì)胞，同時更換含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CSE（0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%）的全營養(yǎng)培養(yǎng)基。使用倒置相差顯微鏡在放大40倍狀態(tài)下拍照，每孔細(xì)胞沿劃痕自上至下取10個視野測量點，測量劃痕寬度。將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于劃痕后0、12、24 h再次拍照測量劃痕寬度，以0 h時的細(xì)胞劃痕寬度作為參考值，計算并比較各組細(xì)胞間劃痕愈合的差異。

1.2.6 Western blot試驗檢測HSP27表達(dá) 選取第3代HGFs，按每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6孔板，待細(xì)胞長到70%～80%時，饑餓12～18 h，選用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%）的CSE刺激細(xì)胞24 h，檢測HSP27的表達(dá)變化。

CSE刺激后，首先提取細(xì)胞總蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白質(zhì)濃度，分裝后將其置于-70 ℃待用。每個樣品取30 μg蛋白質(zhì)加入等體積4×SDS上樣緩沖液中，100 ℃金屬浴煮沸5 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，100 V電壓轉(zhuǎn)移聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜55 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2～4 h或4 ℃過夜，加入1∶1 000稀釋HSP27一抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，加1∶2 000稀釋生物素標(biāo)記二抗（北京康為世紀(jì)生物有限公司），37 ℃孵育1 h后TBST洗膜，滴加超敏曝光液曝光，在暗室中顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用重復(fù)測量方差分析比較不同時間點和不同組間各劃痕寬度減少量的差異，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)HGFs的形態(tài)學(xué)觀察見圖1。HGFs均呈長梭形或星形，細(xì)胞突細(xì)長，細(xì)胞體豐滿，細(xì)胞質(zhì)均勻，中央有圓形或橢圓形的細(xì)胞核，核仁清晰，一般有1～3個細(xì)胞呈放射狀漩渦狀排列。

圖 1 HGFs的形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡 × 200Fig 1 Morphology of HGFs inverted phase contrast microscope × 200

2.2 免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果

免疫組織化學(xué)實驗均顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性（圖2），證實細(xì)胞為中胚層組織來源而非上皮來源。

圖 2 HGFs中波形絲蛋白（左）與角蛋白（右）染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡 × 400Fig 2 Staining results of Vimentin （left） and keratin （right） of HGFs light microscope × 400

2.3 CSE對HGFs增殖的影響

通過劑量和時間梯度試驗篩選出刺激HGFs適宜的CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%，適宜的刺激時間為24 h（圖3）。

圖 3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CSE對HGFs增殖的影響Fig 3 The comparison of expression amount of CSE at different concentrations

2.4 CSE刺激對HGFs遷移的影響

與空白對照組比較，CSE能明顯抑制HGFs的遷移，且隨著CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，HGFs細(xì)胞的劃痕愈合速度減慢。細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果見圖4（圖4中紅線為細(xì)胞劃痕邊緣）。培養(yǎng)12 h后，0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%CSE組HGFs的劃痕寬度減少百分比分別是46.67%±3.72%、33.32%±1.86%、25.95%± 3.09%、21.87%±0.77%、14.92%±2.02%、6.61%± 1.17%；24 h后，6組細(xì)胞劃痕寬度減少百分比分別是99.74%±0.00%、64.82%±0.79%、54.01%±0.68%、51.22%±1.51%、41.90%±2.11%、22.80%±1.54%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，培養(yǎng)12 h及24 h后6組細(xì)胞劃痕寬度減少百分比的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖 4 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果 倒置相差顯微鏡 × 40Fig 4 Wound-healing assay result inverted phase contrast microscope × 40

2.5 CSE刺激HGFs后HSP27的表達(dá)

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CSE刺激HGFs損傷24 h后，細(xì)胞中HSP27的Western blot檢測結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，HSP27的相對表達(dá)量隨著CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加。

圖 5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CSE對HSP27表達(dá)的影響Fig 5 Effect of CSE with different concentrations on the expression of HSP27

3 討論

吸煙是牙周病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。國內(nèi)外學(xué)者就吸煙對牙周病的影響已作了大量研究［4-8］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：吸煙志愿者形成牙周袋的概率是不吸煙者的4.7倍，牙周附著喪失的危險為不吸煙者的7倍，牙周細(xì)胞的凋亡增加。Tanur等［9］認(rèn)為，煙草有害成分可妨礙細(xì)胞對無病變牙根的貼附，煙草中的有害物質(zhì)可對HGFs的附著、分泌、增殖等正常生物學(xué)行為造成影響。Rota等［10］認(rèn)為，HGFs內(nèi)大量分布的微管和微絲可能是煙草中毒性物質(zhì)作用的理想靶成分。Cattaneo等［11］研究顯示，吸煙所產(chǎn)生的丙烯醛、乙醛可以明顯抑制體外培養(yǎng)HGFs的貼附和增殖。吳溪溪等［12］的研究顯示，吸煙可直接或間接損傷HGFs，抑制其增殖、合成和分泌功能，在導(dǎo)致種植體周圍炎進(jìn)而造成種植失敗的病變過程中產(chǎn)生重要的影響。Dinos等［13］發(fā)現(xiàn)，尼古丁和機械應(yīng)激可影響牙齦成纖維細(xì)胞并推遲傷口愈合。每支香煙經(jīng)過燃燒可產(chǎn)生4 000余種化合物，以往研究大多介紹了尼古丁等單一成分對細(xì)胞生長的影響，本實驗采用煙草煙霧提取物，較為全面地保留了煙草的多種成分。細(xì)胞劃痕試驗顯示，CSE對HGFs的遷移具有抑制作用，且CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，抑制作用越明顯。這與曹艷等［14］關(guān)于尼古丁抑制牙周膜成纖維細(xì)胞生長和增殖的研究結(jié)果相一致。

HSP27在人腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中都存在，作為分子伴侶而發(fā)揮作用，可以調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15-16］。已有研究［17］證實，HSP27與晶狀體中的αA-晶體蛋白及αB-晶體蛋白在氨基酸和基因水平上高度同源，在多種組織與創(chuàng)傷愈合中存在相關(guān)性，其表達(dá)規(guī)律與創(chuàng)傷時間及不同類型細(xì)胞的分布狀況有關(guān)［18］。Jain等［19］研究表明，HSP27與角膜上皮的創(chuàng)傷愈合有關(guān)。Hirano等［20］發(fā)現(xiàn)，HSP27的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)浮動的成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)格的收縮，成纖維細(xì)胞的黏附，膠原的伸長與移動，并且有一定的劑量相關(guān)性。蘭衛(wèi)東等［21］發(fā)現(xiàn)，牙髓炎早期，HSP27在牙髓成纖維細(xì)胞中呈強陽性表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示，HSP27在CSE作用下的HGFs中的表達(dá)高于正常對照組，并隨CSE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增高，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，與武文妍等［22］關(guān)于HSP27在牙周膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)的研究結(jié)果一致，也與本課題組研究的HSP27在脂多糖介導(dǎo)的牙齦成纖維細(xì)胞損傷中的表達(dá)結(jié)果一致［23］。

本研究選取社會環(huán)境中常見的香煙煙霧所致牙周炎的最終途徑——氧化性損傷作用為處理因素，研究HGFs中HSP27的表達(dá)情況。正常HGFs中存在HSP27的表達(dá)，在外源性應(yīng)激條件下，CSE作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，HGFs遷移能力越弱；在CSE干預(yù)后的HGFs中呈強陽性表達(dá)，且隨干預(yù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高表達(dá)量有逐漸增高的趨勢，并與細(xì)胞遷移能力相反。該結(jié)果提示HSP27在CSE介導(dǎo)的上皮氧化損傷過程中具有重要作用。

由本實驗結(jié)果可以推斷，吸煙可以通過煙霧含有的氧自由基降低細(xì)胞中過氧化物歧化酶的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物蓄積從而直接損傷HGFs，抑制其增殖、分化、合成和分泌等功能，在牙齦炎和牙周炎發(fā)生過程中有重要的影響。推測其相關(guān)機制可能是：由于CSE直接使HGFs氧化中毒，HGFs發(fā)生應(yīng)激損傷，細(xì)胞骨架破壞，蛋白質(zhì)合成下降，影響與其接觸的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響細(xì)胞附著；CSE破壞HGFs對膠原纖維束的調(diào)節(jié)作用，增加外界物質(zhì)入侵機會；改變底物表面的電荷，干擾HGFs的黏附；CSE抑制細(xì)胞吞噬功能，造成變性膠原纖維不能及時被清除，牙周組織修復(fù)能力下降，加速牙齦炎和牙周炎的進(jìn)展。在這個過程中，細(xì)胞中HSP27產(chǎn)生增多，以幫助蛋白質(zhì)折疊及移位，防止蛋白質(zhì)聚集，幫助變性蛋白質(zhì)解聚及復(fù)性，促進(jìn)嚴(yán)重受損蛋白質(zhì)的降解。

綜上所述，在香煙提取物的刺激下，HGFs中的HSP27的表達(dá)水平呈劑量依賴性升高，提示HSP27參與了HGFs應(yīng)激條件下的保護(hù)作用，為牙周炎的防治提供了新思路。

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（本文編輯 吳愛華）

［中圖分類號］Q 51

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.004

［收稿日期］2015-08-05； ［修回日期］ 2015-11-02

［基金項目］中國博士后科學(xué)基金（2012M511524）；山東省博士后創(chuàng)新項目專項資金（2012030407）；中國博士后科學(xué)基金特別資助項目（2013T60679）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃基金（2013WSB19019）

［作者簡介］周芹，助教，碩士，E-mail：zq201213966@126.com

［通信作者］朱震坤，講師，博士，E-mail：zhenkunzhu@sdu.edu.cn

Expression of heat shock protein 27 in cigarette smoke extract-induced injury of human gingival fibroblasts

Zhou Qin，Sun Ruinan， Zhu Zhenkun.
（School of Stomatology of Shandong University， Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration， Jinan 250012， China）

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation （2012M511524）； Postdoctoral Innovation Special Foundation in Shandong Province （2012030407）； China Postdoctoral Science Foundation Special Funding （2013T60679）； Medical Science and Technology Development Plans Foundation in Shandong Province （2013WSB19019）. Correspondence: Zhu Zhenkun， E-mail: zhenkunzhu@sdu.edu.cn.

［Abstract］Objective This research aimed to observe the expression of heat shock protein 27 （HSP27） in human gingival fibroblasts （HGFs） cell injury induced by different concentrations of cigarette smoke extract （CSE）. Methods The third to eighth generations of cultured HGFs were treated with serially diluted CSE of different concentrations （0， 2.5%， 5.0%， 12.5%，25.0%， 50.0%）. Wound-healing assay was performed to determine the migration of HGFs， and Western blot was used to determine the expression of HSP27. Results The migration capability of HGFs weakened with the increase of CSE concentration. HSP27 expression was negative in normal HGFs but positive in CSE-intervened HGFs in a concentration-dependent manner. Conclusion HSP27 concentration increased in the CSE-induced injury of HGFs. This finding suggests that HSP27 plays an important role in CSE-induced epithelial injury.

［Key words］cigarette smoke extract； heat shock protein 27； human gingival fibroblasts； epithelial injury