崔野鄭義申玉芹侯旭婁譯心孫新華

1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，長(zhǎng)春 130021

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MT01/PEN復(fù)合物對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG63表達(dá)骨保護(hù)蛋白和核因子κB受體活化因子配體的影響

崔野1，2鄭義3申玉芹3侯旭1婁譯心1孫新華1

1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，長(zhǎng)春 130021

［摘要］目的 應(yīng)用聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物（PEN）載體裝載寡脫氧核苷酸MT01，制備MT01/PEN復(fù)合物，檢測(cè)該復(fù)合物對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG63表達(dá)骨保護(hù)蛋白（OPG）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的影響。方法制備3種不同配比的MT01/PEN（質(zhì)量比分別為1∶2、1∶4、1∶6）復(fù)合物，以全硫代化修飾MT01（MT01-s）和未修飾的MT01作陽(yáng)性對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和real-time聚合酶鏈反應(yīng)法分別檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組上清液及細(xì)胞內(nèi)OPG和RANKL的表達(dá)水平。結(jié)果 經(jīng)MT01/PEN復(fù)合物轉(zhuǎn)染后，上清液及細(xì)胞內(nèi)OPG表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；多數(shù)組中RANKL表達(dá)水平降低，而OPG/RANKL比值呈升高趨勢(shì)（P＜0.05）；不同質(zhì)量配比的MT01/PEN均對(duì)MG63細(xì)胞的成骨具有影響，其中質(zhì)量比為1∶6時(shí)作用最明顯。結(jié)論 應(yīng)用PEN作為基因載體裝載MT01可增強(qiáng)MT01對(duì)MG63細(xì)胞的促成骨作用。

［關(guān)鍵詞］人成骨樣細(xì)胞MG63； 寡脫氧核苷酸MT01； 聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物； 骨保護(hù)蛋白； 核因子κB受體活化因子配體

寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotides，ODN）是一類單鏈DNA分子［1］。研究［2-4］發(fā)現(xiàn)，一種依據(jù)人線粒體DNA設(shè)計(jì)合成命名為MT01的ODN具有促進(jìn)成骨細(xì)胞骨向分化的作用，并可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［5］；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［6］發(fā)現(xiàn)，MT01對(duì)大鼠正畸牙移動(dòng)具有抑制作用。

未經(jīng)修飾的ODN易被核酸酶降解， 細(xì)胞攝取率低。為了增強(qiáng)ODN的穩(wěn)定性，多采用硫代修飾的手段對(duì)其進(jìn)行化學(xué)處理，但ODN表面的負(fù)電荷影響修飾效果且化學(xué)修飾具有毒副作用［1］。近年來(lái)，納米技術(shù)的發(fā)展為解決ODN的傳遞問(wèn)題提供了新策略。聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物（N-isopropylacrylamidemodified polyethylenimines，PEN）是聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）的衍生物，具有毒性低且裝載效率高等優(yōu)勢(shì)［7］。研究［8］證實(shí)，PEN能夠有效裝載MT01，構(gòu)建MT01/PEN傳輸體系。本研究擬通過(guò)檢測(cè)MT01/PEN復(fù)合物對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG63中骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）表達(dá)水平的影響，探討MT01/PEN傳輸體系在增強(qiáng)MT01成骨方面的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

人成骨樣細(xì)胞MG63（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；MT01及全硫代修飾物MT01-s（5’-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3’，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室設(shè)計(jì)，大連TaKaRa公司合成），PEN（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（PAA公司，奧地利）；OPG/RANKL酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（RD公司，美國(guó)），組織細(xì)胞總RNA抽提試劑盒（廣州Magen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（成都福際生物技術(shù)有限公司），real-time 聚合酶鏈反應(yīng)（poly-merase chain reaction，PCR）試劑盒（大連TaKaRa公司）。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司，美國(guó)），酶標(biāo)檢測(cè)儀（Rayto公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 MG63細(xì)胞培養(yǎng) 選用狀態(tài)良好，融合度為80%～90%的MG63細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，加高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS），在37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.2 合成MT01/PEN載體復(fù)合物 將MT01和PEN分別用無(wú)菌PBS（pH值為7.4）溶解并稀釋至0.1 g·L-1，分別按溶質(zhì)質(zhì)量比1∶2、1∶4、1∶6混合均勻，室溫靜置組裝30 min，待用。

1.2.3 轉(zhuǎn)染MT01/PEN載體復(fù)合物至MG63細(xì)胞 取孵育24 h的MG63細(xì)胞，棄液，PBS溶液沖洗2次，分別取PEN（0.1 g·L-1）60 μL、MT01（0.1 g·L-1）10 μL、MT01-s（0.1 g·L-1）10 μL、MT01/PEN載體復(fù)合物（溶質(zhì)質(zhì)量比1∶2、1∶4、1∶6）30、50、70 μL及PBS（空白對(duì)照），補(bǔ)齊至70 μL后分別加入6孔板中，加高糖DMEM培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS）補(bǔ)至2 mL（各孔MT01終質(zhì)量濃度0.5 μg·mL-1），與MG63細(xì)胞共同孵育4 h，棄液，加高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS），繼續(xù)孵育24、48和72 h。各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3復(fù)孔。

1.2.4 檢測(cè)OPG和RANKL蛋白的表達(dá)水平 應(yīng)用ELISA試劑盒，分別檢測(cè)培養(yǎng)24、48和72 h的MG63細(xì)胞中OPG和RANKL蛋白的表達(dá)情況，加樣如下（設(shè)3復(fù)孔）：空白對(duì)照孔，不加任何試劑；標(biāo)準(zhǔn)品孔，加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶50 μL；待測(cè)樣品孔，加入各實(shí)驗(yàn)組上清液40 μL、抗OPG或RANKL抗體10 μL、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶50 μL。450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，依據(jù)樣品A值計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的質(zhì)量濃度。

1.2.5 檢測(cè)OPG和RANKL mRNA的表達(dá)水平 吸棄6孔板中上清液，PBS沖洗，每孔加入300 μL胰酶消化，高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）終止后離心收集細(xì)胞。采用HiPure Total RNA試劑盒提取各組細(xì)胞內(nèi)的總RNA，通過(guò)NanoDrop 2000分光光度計(jì)對(duì)總RNA樣品質(zhì)量濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：RNA樣品量充足，OD260/OD280值在1.8～2.1之間。采用RT EasyTMⅡ試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用real-time PCR試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72 h的MG63細(xì)胞內(nèi)OPG和RANKL的mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MT01/PEN復(fù)合物對(duì)MG63細(xì)胞上清液中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響

MG63細(xì)胞上清液中OPG蛋白的表達(dá)水平見(jiàn)圖1。PEN組OPG蛋白表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。培養(yǎng)24 h時(shí)，MT01-s組、MT01/PEN復(fù)合物1∶4和1∶6組的OPG蛋白表達(dá)水平較高，明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），而MT01/PEN復(fù)合物1∶4和1∶6組亦高于MT01-s組（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h時(shí)，MT01-s組、MT01/PEN復(fù)合物1∶2組OPG蛋白表達(dá)水平較高，明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；培養(yǎng)72 h時(shí)，MT01/PEN復(fù)合物1∶6組的OPG蛋白表達(dá)量降低，低于空白對(duì)照組（P＜0.01）。

圖 1 轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24、48、72 h后各組上清液中OPG蛋白的表達(dá)水平Fig 1 OPG protein expression levels of MG63 transfected for 24，48， 72 h in various groups

MG63細(xì)胞上清液中RANKL蛋白的表達(dá)水平見(jiàn)圖2。培養(yǎng)24 h時(shí)，MT01-s組和MT01/PEN復(fù)合物1∶6組的RANKL蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低（P＜0.05），其中MT01/PEN復(fù)合物1∶6組明顯低于MT01-s組（P＜0.01）。培養(yǎng)48 h時(shí)，MT01/PEN復(fù)合物1∶2組的表達(dá)量降低，明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01）。培養(yǎng)72 h時(shí)，MT01組，MT01-s組，MT01/PEN復(fù)合物1∶2、1∶4、1∶6組的表達(dá)均低于空白對(duì)照組（P＜0.01），其中MT01/PEN復(fù)合物1∶2組低于MT01-s組（P＜0.05）。PEN組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖 2 轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24、48、72 h后各組上清液中RANKL蛋白的表達(dá)水平Fig 2 RANKL protein expression levels of MG63 transfected for 24， 48， 72 h in various groups

將OPG/RANKL的比值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖3。24 h時(shí)，MT01組，MT01-s組，MT01/PEN復(fù)合物1∶4和1∶6組的OPG/RANKL值較空白對(duì)照組升高，其中MT01/PEN復(fù)合物1∶6組明顯高于MT01-s組（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)，MT01-s組、MT01/ PEN復(fù)合物1∶2和1∶4組OPG/RANKL值較空白對(duì)照組明顯升高，其中MT01/PEN復(fù)合物1∶2組在培養(yǎng)48 h時(shí)明顯高于MT01-s組（P＜0.05）。PEN組OPG/RANKL值在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。

圖 3 各組OPG/RANKL值Fig 3 OPG/RANKL values in various groups

2.2 MT01/PEN復(fù)合物對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)OPG和RANKL mRNA表達(dá)的影響

MG63細(xì)胞內(nèi)OPG mRNA表達(dá)水平見(jiàn)圖4。與空白對(duì)照組和MT01-s組相比，MT01/PEN復(fù)合物1∶2、1∶4、1∶6組在培養(yǎng)48、72 h時(shí)，除1∶2組在48 h 的OPG mRNA表達(dá)水平低于MT01-s組外，其余組別均升高（P＜0.05），且隨復(fù)合物中PEN配比增高，OPG mRNA表達(dá)呈增強(qiáng)趨勢(shì)；而PEN組在各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖 4 轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞內(nèi)OPG mRNA的表達(dá)水平Fig 4 OPG mRNA expression levels of MG63 transfected for 24，48， 72 h in various groups

MG63細(xì)胞內(nèi)RANKL mRNA表達(dá)水平見(jiàn)圖5。

圖 5 轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞內(nèi)RANKL mRNA的表達(dá)水平Fig 5 RANKL mRNA expression levels of MG63 transfected for 24， 48， 72 h in various groups

由圖5可見(jiàn)，在培養(yǎng)48 h時(shí)，與空白對(duì)照組和MT01-s組相比，MT01/PEN復(fù)合物1∶2組表達(dá)較低，而1∶4和1∶6組表達(dá)較高。在培養(yǎng)72 h時(shí)，MT01/ PEN復(fù)合物1∶2和1∶6組的表達(dá)量較空白對(duì)照組和MT01-s組降低（P＜0.05）。PEN組在各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員，由成骨細(xì)胞分泌，作為可溶型誘餌受體，可競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合［9-10］。RANKL是一種Ⅱ型跨膜蛋白，有可溶型和細(xì)胞膜整合型兩種形式，前者表達(dá)于成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞，后者見(jiàn)于T細(xì)胞［11］。本實(shí)驗(yàn)首先針對(duì)上清液中可溶型RANKL進(jìn)行ELISA檢測(cè)，評(píng)價(jià)MG63細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)水平。成骨細(xì)胞所表達(dá)的OPG與RANKL的比值決定其對(duì)破骨前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力，其比例協(xié)調(diào)是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵［12］。未成熟的成骨細(xì)胞主導(dǎo)破骨形成，RANKL與OPG的比值高，隨著成骨細(xì)胞的分化成熟，比值逐漸減小，而較成熟的成骨細(xì)胞擁有成骨表型，失去對(duì)破骨細(xì)胞的分化和激活作用［11，13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEN組中OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平在3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化，而隨著MT01/PEN復(fù)合物中載體PEN配比的增高，OPG/RANKL值出現(xiàn)變化的時(shí)間點(diǎn)提前，表明其促成骨作用依次增強(qiáng)。此外MT01-s也表現(xiàn)出了促進(jìn)成骨的作用，這與本課題組前期研究［3］證實(shí)MT01具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用相一致。

為進(jìn)一步證實(shí)在轉(zhuǎn)錄水平MT01/PEN復(fù)合物對(duì)MG63成骨作用的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，PEN組與空白對(duì)照組在mRNA表達(dá)水平上無(wú)明顯差異，而隨著復(fù)合物中PEN配比增高，OPG mRNA表達(dá)依次增強(qiáng)。另外本研究發(fā)現(xiàn)，兩種檢測(cè)方法的趨勢(shì)并非在所有時(shí)間點(diǎn)都完全吻合，原因在于OPG和RANKL在轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程中，mRNA并不總是翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的出現(xiàn)也不一定意味著都具有生物學(xué)活性，兩者合成位置不同，且存在先后順序及化學(xué)修飾的影響，這種空間和時(shí)間上的差異不能忽略［14］。雖然48 h時(shí)，RANKL mRNA在個(gè)別組呈高表達(dá)，但其與相應(yīng)組別的OPG mRAN表達(dá)趨勢(shì)相同，OPG/RANKL值仍較高，表明MG63細(xì)胞成骨作用增強(qiáng)。這與ELISA結(jié)果中表現(xiàn)出的趨勢(shì)相一致。在本課題組的前期實(shí)驗(yàn)［8］中，已完成MT01/PEN復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量比為1∶6的MT01/PEN復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率最高，而細(xì)胞毒性相對(duì)較低，這可以解釋1∶6組首先出現(xiàn)OPG 和RANKL表達(dá)水平的明顯變化，而其他組別出現(xiàn)變化的時(shí)間相對(duì)較晚的現(xiàn)象。兩種不同的檢測(cè)手段分別在基因水平和蛋白質(zhì)水平證實(shí)了MT01/PEN復(fù)合物對(duì)MG63細(xì)胞成骨作用的提高，且1∶6組對(duì)OPG 和RANKL的表達(dá)均產(chǎn)生了較強(qiáng)的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)OPG和RANKL蛋白和基因表達(dá)水平的檢測(cè)，證實(shí)MT01通過(guò)與PEN構(gòu)建傳輸體系可提高其對(duì)MG63細(xì)胞的促成骨作用。Tian等［7］利用N-異丙基丙烯酰胺通過(guò)Michael加成反應(yīng)對(duì)PEI進(jìn)行修飾，得到PEI衍生物PEN。PEN不僅保留了PEI原有的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)［15］，同時(shí)提高了轉(zhuǎn)染效率，降低了細(xì)胞毒性，是一種理想的非病毒載體。應(yīng)用PEN作為MT01載體，有助于實(shí)現(xiàn)MT01對(duì)細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染和特定功能表達(dá)，增強(qiáng)MT01促進(jìn)成骨的作用。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）

［中圖分類號(hào)］Q 51

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.007

［收稿日期］2015-08-25； ［修回日期］ 2015-11-13

［基金項(xiàng)目］白求恩前沿交叉學(xué)科創(chuàng)新基金（2013108031）

［作者簡(jiǎn)介］崔野，碩士，E-mail：279914375@qq.com

［通信作者］孫新華，教授，學(xué)士，E-mail：xinhuasun8@163.com

Effect of MT01/PEN complexes on the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor κB ligandin human osteoblast-like cell line MG63

Cui Ye1，2， Zheng Yi3， Shen Yuqin3， Hou Xu1， Lou Yixin1， Sun Xinhua1.
（1. Dept. of Orthodontics， School and Hospital of Stomatology， Jilin University， Changchun 130021， China； 2. Jilin Provincial Key Laboratory of Tooth Development and Bone Remodel， Changchun 130021， China； 3. Dept. of Periodontology， School and Hospital of Stomatology， Jilin University， Changchun 130021， China）

Supported by: Bethune Frontier Interdisciplinary Innovation Foundation （2013108031）. Correspondence: Sun Xinhua， E-mail: xinhuasun8@163.com.

［Abstract］Objective This study aims to synthesize MT01 （a kind of oligodeoxynucleotides） and N-isopropylacrylamidemodified polyethylenimines （PEN） complexes （MT01/PEN） as well as to investigate the effect of the complexes on the expression of osteoprotegerin （OPG） and the receptor activator of nuclear factor κB ligand （RANKL） in the human osteoblast-like cell line MG63. Methods MG63 cells were transfected by MT01/PEN complexes formed with three different mass ratios （1∶2， 1∶4， 1∶6） of MT01 to PEN. MT01 and MT01-s were used as positive control. Enzyme-linked immunosorbent assay and real-time polymerase chain reaction were performed to estimate the amount of OPG and RANKL released into the culture media and in MG63 at 24， 48， 72 h. Results MG63 responded to the MT01/PEN complexes by significantly upregulating the OPG on the protein and mRNA levels （P＜0.05）. The protein and mRNA levels of RANKL were lower in most of the groups with complexes， and the OPG/RANKL ratio were higher （P＜0.05）. MG63 were affected by the MT01/PEN complexes with different mass ratios， particularly when the ratio was 1∶6. Conclusion MT01 can enhance the promotion of ossification by establishing the delivery system with PEN.

［Key words］human osteoblast-like cell line MG63； oligodeoxynucleotides MT01； N-isopropylacrylamide-modified polyethylenimines； osteoprotegerin； receptor activator of nuclear factor κB ligand