魏　　強(qiáng)　董建方李文彬　趙培然　丁菲菲　李連之（聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，聊城　5059）（山東工程技師學(xué)院材料科學(xué)系，聊城　507）

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兩個(gè)組氨酸希夫堿鎳(Ⅱ)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和DNA相互作用及SOD活性

魏強(qiáng)1董建方2李文彬1趙培然1丁菲菲1李連之＊，1
（1聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，聊城252059）
（2山東工程技師學(xué)院材料科學(xué)系，聊城252027）

摘要：合成了2個(gè)新的L-組氨酸水楊醛希夫堿混配體鎳(Ⅱ)配合物，［Ni（Sal-L-His）（Phen）］·H2O（1）（Sal-L-His=L-組氨酸水楊醛希夫堿，Phen=菲咯啉）和［Ni（Sal-L-His）（Bipy）］2·2CH3OH·3H2O（2）（Bipy=2，2′-聯(lián)吡啶）。X射線單晶衍射測(cè)定表明，1為單核配合物，屬于單斜晶系，P21/c空間群，晶胞參數(shù)為：a=1.586 31（13）nm，b=1.215 11（11）nm，c=1.211 30（9）nm，β=106.581（2）°，V=2.237 7（3）nm3Z=4。2為雙核配合物，屬于正交晶系，C2221空間群，晶胞參數(shù)為：a=1.415 30（13）nm，b=1.717 71（15）nm，c=2.256 02（19）nm，V 5.484 6（8）nm3，Z=4。紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測(cè)定等研究表明，2個(gè)配合物與小牛胸腺DNA（CT-DNA）均以插入方式相結(jié)合。運(yùn)用NBT光照還原法測(cè)定了配合物的超氧化物歧化酶（SOD）活性，求得IC50（1）=51.5 μmol·L-1，IC50（2）=58. μmol·L-1。

關(guān)鍵詞：鎳配合物；L-組氨酸；希夫堿；晶體結(jié)構(gòu)；DNA；SOD

山東省自然科學(xué)基金（No.Y2004B02）和聊城大學(xué)大學(xué)生科技文化創(chuàng)新基金（No.SF2014042）資助項(xiàng)目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：lilianzhi1963@163.com；會(huì)員登記號(hào)：S06N1205M1202。

0引言

希夫堿過(guò)渡金屬配合物具有抗腫瘤、抗菌、抗癌等多種生物活性［1］。近年來(lái)，氨基酸希夫堿過(guò)渡金屬配合物由于其多方面的性質(zhì)特別是在醫(yī)藥學(xué)中的潛在應(yīng)用引起人們的極大興趣［2］。鎳作為一種生命必需元素，存在于生物體的系列酶中，比如脲酶、鎳鐵氫化酶、超氧化物歧化酶等［3-4］。它具有促進(jìn)紅細(xì)胞再生，刺激生血功能的作用，在維持大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、膜穩(wěn)定性和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)方面也起到重要作用。鑒于鎳所特有的生物活性，近來(lái)鎳及其化合物越來(lái)越受到廣大科研工作者的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道許多鎳的配合物表現(xiàn)出良好的抗菌、抗癌、抗氧化以及DNA結(jié)合和DNA切割活性［5-6］。

核酸是生物體的重要組成成份，它對(duì)生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、變異等現(xiàn)象起著決定作用，一直是現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要研究領(lǐng)域。DNA作為生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，是許多藥物的主要作用靶點(diǎn)。在分子水平上研究藥物或者配合物小分子與DNA等生物大分子的相互作用，是當(dāng)前生命科學(xué)、藥物化學(xué)的重要課題之一。這對(duì)于研究致癌化合物的致癌機(jī)理和抗癌藥物的藥理和毒性以及設(shè)計(jì)合成新型藥物方面都有很大意義［7-8］。超氧陰離子自由基（O2-·）是生物體內(nèi)有氧代謝的產(chǎn)物，也是對(duì)生命體系毒性很高的物種［9］，導(dǎo)致包括脂類物質(zhì)的超氧化、DNA損傷、老化、癌癥和許多其他疾病。超氧化物歧化酶（SOD）能有效清除O2-·，在抗輻射損傷、減緩衰老以及預(yù)防癌癥等方面有其獨(dú)特作用［10］。天然SOD生產(chǎn)成本高，且壽命短、易失活，分子量大不易通過(guò)細(xì)胞膜，在應(yīng)用上受到一定限制。因此，人工合成穩(wěn)定、無(wú)毒、分子量小的活性化合物來(lái)替代天然SOD具有重要意義［11］。鑒于此，我們合成了2種新的氨基酸希夫堿鎳(Ⅱ)配合物，測(cè)定了其晶體結(jié)構(gòu)，利用紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測(cè)量等方法，研究了這兩個(gè)配合物與小牛胸腺DNA （CT-DNA）的作用，還利用氮藍(lán)四唑（NBT）光照還原法測(cè)定了配合物的模擬SOD的性質(zhì)。

Scheme 1　Structure of the Schiff base ligand

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

水楊醛購(gòu)自阿法埃莎化學(xué)技術(shù)有限公司，L-組氨酸購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，氮藍(lán)四唑（NBT）購(gòu)自AMRESCO，核黃素購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，N，N-四甲基乙二胺購(gòu)自SIGMA ALDRICH，小牛胸腺DNA（CT-DNA），溴化乙錠（EB）和三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購(gòu)自華美生物工程有限公司。CT-DNA儲(chǔ)存溶液用10 mmol·L-1Tris-HCl/ 10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖溶液配制，經(jīng)UV光譜測(cè)定A260/A280＞1.8，CT-DNA的濃度通過(guò)測(cè)量其在260 nm處的吸光度，然后根據(jù)其摩爾吸光系數(shù)ε260=6 600 L·mol-1·cm-1來(lái)確定［12］。其它試劑如四水合醋酸鎳、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、菲咯啉、2，2′-聯(lián)吡啶等均為分析純?cè)噭?/p>

Bruker Smart-1000 CCD型衍射儀，Nicolet 5700 FT-IR型紅外光譜儀 （KBr壓片），UV-2500 PC型紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)（Shimadzu，日本），LS55型熒光光譜儀（Perkin Elmer，美國(guó)），JASCO J-810型圓二色光譜儀（Japan），烏氏粘度計(jì)。

1.2配合物1和2的合成

取0.155 2 g（1.0 mmol）L-組氨酸和0.056 1 g （1.0 mmol）KOH于圓底燒瓶中，加入10 mL甲醇，加熱攪拌至完全溶解后，滴加110 μL（1.0 mmol）水楊醛的甲醇溶液（4 mL）。60℃下攪拌回流1 h后，再滴加0.249 8 g（1.0 mmol）四水合醋酸鎳的甲醇溶液（4 mL），繼續(xù)回流反應(yīng)2 h。最后，再逐滴加入含0.198 0 g（1.0 mmol）菲咯啉（1）或0.156 2 g（1.0 mmol）2，2′-聯(lián)吡啶（2）的甲醇溶液（4 mL）。加熱回流反應(yīng)3 h，室溫冷卻過(guò)濾，濾液在室溫下靜置數(shù)天，得到塊狀單晶。配合物1為棕色塊狀單晶，產(chǎn)率約為60%。元素分析按 C25H21N5NiO4計(jì)算的理論值 （%）：C 58.40；H4.12；N13.62；實(shí)驗(yàn)值（%）：C58.36；H4.08%；N 13.58。配合物1的IR（cm-1）：3 421（s，νO-H）；1 622（s，νC=N）；1 592（s，νCOO）；546（w，νNi=O）；494（w，νNi-N）。配合物2為淺棕色塊狀單晶，產(chǎn)率約為58%。元素分析按C48H52N10Ni2O11計(jì)算的理論值 （%）：C 54.27；H 4.93；N，13.18。實(shí)驗(yàn)值（%）：C 54.31；H 4.91；N 13.15。配合物2的IR（cm-1）：3 424（s，νO-H）；1 624（s，νC=N）；1 593（s，νCOO）；545（s，νNi=O）；496（m，νNi-N）。

1.3晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

選取尺寸為0.34 mm×0.30 mm×0.22 mm的配合物1和0.13 mm×0.11 mm×0.05 mm的配合物2的單晶，置于Bruker Smart-1000 CCD型單晶衍射儀上，以石墨單色化的Mo Kα（λ=0.071 073 nm）輻射為光源，以φ-ω掃描方式收集衍射點(diǎn)。選取I＞2σ（I）的可觀察點(diǎn)（1為2 150個(gè)，2為2 226個(gè)）用于結(jié)構(gòu)解析和修正。衍射數(shù)據(jù)用SAINT程序進(jìn)行還原［13］，并用SADABS程序?qū)ρ苌鋸?qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行吸收校正［14］。單晶結(jié)構(gòu)由直接法以SHELXS程序獲得。結(jié)構(gòu)解析和精修均采用SHELXTL-97軟件完成［15］。非氫原子的坐標(biāo)在差值Fourier合成中確定，并對(duì)其坐標(biāo)及各向異性熱參數(shù)進(jìn)行了全矩陣最小二乘法修正。氫原子采用理論加氫得到。配合物的主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。

CCDC：1038774，1；1420088，2。

1.4配合物與DNA的相互作用

1.4.1紫外可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定

用10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖液配制一系列試樣。固定配合物的濃度為15 μmol·L-1，逐漸增大CT-DNA的濃度，反應(yīng)體系于室溫放置1 h。配制等濃度的緩沖溶液或DNA緩沖溶液作為參比，設(shè)定波長(zhǎng)范圍200～500 nm，測(cè)定不同DNA濃度下配合物的紫外可見(jiàn)吸收光譜。

1.4.2配合物對(duì)DNA-EB體系熒光光譜的影響

用10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖液配制一系列試樣。固定CT-DNA濃度為15 μmol·L-1，EB濃度為3 μmol·L-1，配合物的濃度逐漸增加，反應(yīng)體系于室溫放置1 h后測(cè)定熒光光譜狹縫寬度：10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm；發(fā)射波長(zhǎng)范圍為540～680nm，掃描速度：300nm·min-1。

表1　配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1　Crystallographic data for the two complexes

1.4.3圓二色光譜測(cè)定

用10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖液配制一系列試樣。固定CT-DNA的濃度為100 μmol·L-1，配合物的濃度逐漸增加，反應(yīng)體系于室溫放置1 h，測(cè)定DNA的圓二色光譜（扣除緩沖液和配合物的光譜）。掃描范圍為220～320 nm，掃描速度為200 nm·min-1，路徑長(zhǎng)度1 cm，響應(yīng)時(shí)間為1 s。1.4.4粘度測(cè)定

用10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖液配制一系列試樣。固定CT-DNA的濃度為100 μmol·L-1，逐漸增加配合物濃度，設(shè)r=ccomplex/ cDNA，使r分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08。試樣在（30± 0.1）℃下水浴中恒溫30 min后，測(cè)定溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間t。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。相對(duì)粘度η=（t-t0）/t0，以（η/η0）1/3對(duì)r作圖，t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時(shí)間，η0為r=0時(shí)DNA溶液的相對(duì)粘度。在相同條件下，測(cè)定EB和甲基綠（MG）對(duì)DNA溶液相對(duì)粘度的影響。

1.5SOD活性測(cè)試

采用NBT光照還原法測(cè)定配合物的SOD活性［16］。用pH=7.8的10.0 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液配制1.0×10-4mol·L-1NBT，6.2×10-6mol·L-1核黃素和8.3×10-4mol·L-1N，N-四甲基乙二胺和配合物（濃度為1.0×10-6～9.0×10-6mol·L-1）溶液。室溫下，用恒定光強(qiáng)的冷光燈照射，每光照1 min用紫外可見(jiàn)吸收光譜儀測(cè)定其在560 nm處的吸光度，測(cè)定時(shí)間為10 min。

圖1　配合物1和2的分子結(jié)構(gòu)（橢球率30%）Fig.1　Molecular structures of complex 1 and complex 2 with thermal ellipsoids at 30%probability

表2　配合物的主要鍵長(zhǎng)和鍵角Table 2　Selected bond lengths（nm）and angles（°）for the complexes

2　結(jié)果與討論

2.1晶體結(jié)構(gòu)解析

配合物的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，主要鍵長(zhǎng)和鍵角見(jiàn)表2。在配合物1的分子結(jié)構(gòu)中，Ni(Ⅱ)離子與組氨酸水楊醛希夫堿配體中的酚羥基氧原子O2，亞氨基氮原子N1，咪唑環(huán)上的氮原子N2，菲咯啉配體中的2個(gè)氮原子（N4和N5）和水分子的氧原子O1配位，形成一個(gè)六配位的變形八面體結(jié)構(gòu)。N1，N2，N5和O2原子位于八面體的赤道平面上，O1和N4原子位于八面體的軸向位置，Ni(Ⅱ)離子幾乎與赤道平面共面，其偏離基本平面位置距離只有0.000 07（2）nm，O1-Ni1-N4形成的鍵角為166.79（17）°，表明配位原子圍繞Ni(Ⅱ)形成一畸變的八面體。另外菲咯啉平面分子與Ni(Ⅱ)離子配位后，形成一個(gè)五元環(huán)，其平面與赤道平面之間形成的二面角為84.69（12）°，幾乎垂直于赤道平面。值得注意的是，在由氨基酸希夫堿配體參與形成的配合物中，羧基氧原子往往參與金屬離子的配位［17-18］，而在該配合物中羧基氧原子未參與配位，而是組氨酸咪唑環(huán)上的氮原子配位。這可能是由于咪唑環(huán)上的氮原子配位更加利于配合物的穩(wěn)定，這種配位形成一個(gè)六元環(huán)，若是羧基氧原子配位則形成五元環(huán)，其張力要比六元環(huán)大些。在配合物1的晶體中，分子間氫鍵O1-H1D…O3ii和N3-H1…O3i，以及分子內(nèi)氫鍵O1-H1C…O4將配合物分子連接形成一個(gè)二維平面結(jié)構(gòu)（圖2）。其鍵長(zhǎng)和鍵角見(jiàn)表3。

續(xù)表2

圖2　配合物1和2的二維結(jié)構(gòu)Fig.2　2D structure of complex 1 and 2

在配合物2的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)單元中，包含1個(gè)希夫堿和菲咯啉混配體雙核Ni(Ⅱ)配合物主體分子，2個(gè)甲醇和3個(gè)水溶劑分子。配合物2主體分子為希夫堿配體上咪唑環(huán)橋連的具有中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)的雙核配合物。由于分子結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性，這里僅討論對(duì)稱單元中的一部分。配合物的分子結(jié)構(gòu)中，Ni(Ⅱ)離子與組氨酸水楊醛希夫堿配體中的酚羥基氧原子O3、亞氨基氮原子N1、羧基氧原子O1、2，2′-聯(lián)吡啶配體上的2個(gè)氮原子N4和N5以及咪唑環(huán)上的氮原子N2i配位，形成一個(gè)六配位的變形八面體結(jié)構(gòu)N1，N4，O1和O3原子位于八面體的赤道平面上N2i和N5原子位于八面體的軸向位置。赤道平面上的鍵角∠N1-Ni1-O3（91.7（2）°），∠N1-Ni1-O1（80.7（2）°）∠O3-Ni1-N4（92.5（2）°）和∠O1-Ni1-N4（95.1（2）°）之和為360.0°，表明Ni(Ⅱ)離子幾乎與赤道平面共面，其偏離基本平面位置距離為0.008 19（3）nm，N2i-Ni1 N5形成的鍵角為170.2（3）°，表明配位原子圍繞Ni(Ⅱ)離子形成一畸變的八面體。另外聯(lián)吡啶平面分子與Ni(Ⅱ)離子配位形成一個(gè)五元環(huán)，其基本平面與赤道平面之間形成的二面角為87.02（18）°，幾乎垂直于赤道平面。希夫堿配體圍繞Ni(Ⅱ)離子形成Ni1 O1-C1-C2-N1五元環(huán)和 Ni1-O3-C9-C8-C7-N1六元環(huán)，兩環(huán)基本平面所形成的二面角為9.20（31）°，它們的形成增加了配合物的穩(wěn)定性。在配合物2的晶體中，溶劑甲醇分子通過(guò)氫鍵O4-H4…O3iii與主體分子連接。溶劑水分子通過(guò)N3-H3…O5ii、O5-H5D …O2v、O6-H6D…O2vii及O6-H6C…O2vi等與主體分子形成氫鍵作用。另外，2個(gè)溶劑水分子之間通過(guò)O5-H5C…O6iv形成氫鍵作用。這些氫鍵相互作用將配合物分子連接形成二維平面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2），其鍵長(zhǎng)和鍵角見(jiàn)表3。

表3　配合物1和2的氫鍵鍵長(zhǎng)和鍵角Table 3　Hydrogen bond lengths（nm）and angles（°）for complex 1 and 2

2.2配合物與DNA作用

2.2.1紫外可見(jiàn)吸收光譜

電子吸收光譜法是研究配合物與DNA相互作用的常用方法。當(dāng)金屬配合物與DNA結(jié)合后，其配體所處的環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致配合物的吸收光譜的強(qiáng)度和波長(zhǎng)發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō)，若金屬配合物與DNA之間的相互作用為靜電或溝面作用方式時(shí)，它們的紫外光譜不會(huì)發(fā)生明顯的變化。但加入DNA后，若配合物的電子吸收光譜的吸收峰位紅移，強(qiáng)度減小，可認(rèn)為是配合物與DNA發(fā)生插入作用的證據(jù)之一［19］。因?yàn)椴迦肱潴w與DNA堿基對(duì)可發(fā)生π電子堆積，插入配體的π*空軌道與堿基的π軌道發(fā)生偶合，使能量降低，導(dǎo)致π→π*躍遷能量減小，從而產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；同時(shí)，偶合后的π*軌道因部分填充電子使π→π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)［20］。

圖3為不同濃度CT-DNA存在下配合物的紫外吸收光譜圖。從圖中可以看出，隨著DNA濃度的增大，配合物1在268 nm處的吸收發(fā)生了明顯的減色效應(yīng)且稍有紅移，這說(shuō)明配合物與DNA的作用方式是插入作用。同樣配合物2也產(chǎn)生了相似現(xiàn)象。為了定量衡量配合物與DNA結(jié)合的強(qiáng)弱，可利用公式cDNA/（εa-εf）=cDNA/（εb-εf）+1/［Kb（εb-εf）］求得結(jié)合常數(shù)Kb［21］，其中εa為配合物的表觀摩爾吸光系數(shù)，εb，εf分別為鍵合和自由配合物的摩爾吸光系數(shù)。將-cDNA/（εa-εf）對(duì)cDNA作圖（圖3），求得結(jié)合常數(shù)Kb（1）＝2.41×104L·mol-1，Kb（2）＝1.89×104L·mol-1。作為與DNA結(jié)合的典型的插入試劑EB，它與DNA的結(jié)合常數(shù)為3.3×105L·mol-1［22］，與之相比，這兩個(gè)配合物比EB插入劑的結(jié)合常數(shù)小，這說(shuō)明該配合物與DNA的插入作用較弱，這可能是因?yàn)榕浜衔餅榛兊陌嗣骟w構(gòu)型，其平面性沒(méi)有EB的好。

2.2.2熒光光譜

溴化乙錠（EB）是研究藥物分子與DNA作用的經(jīng)典的嵌入式熒光探針，它自身的熒光很弱，但是與DNA作用后，其生色團(tuán)嵌入DNA分子的堿基對(duì)中使熒光強(qiáng)度大大增加［23］。當(dāng)有其它也能與DNA發(fā)生插入作用的配合物存在時(shí)，會(huì)將EB從EB-DNA復(fù)合物中擠出，從而使EB-DNA的熒光強(qiáng)度顯著降低。因此，通過(guò)測(cè)定體系熒光的降低程度，可以推斷配合物與DNA的相互作用方式。

圖3　不同濃度CT-DNA存在下配合物1和2的紫外可見(jiàn)吸收光譜以及-cDNA/（εa-εf）對(duì)cDNA作圖Fig.3　Absorption spectra of complex 1 and 2 in the absence and presence of CT-DNA，and the plot of-cDNA/（εa-εf）vs cDNA

圖4　不同濃度配合物存在時(shí)EB-DNA體系的熒光光譜和I0/I對(duì)r作圖Fig.4　Fluorescence spectra of EB-DNA system in the absence and presence of complex 1 and 2，and plot of I0/I vs r

圖4為配合物與EB競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的熒光光譜圖。由圖4可見(jiàn)，EB-DNA體系在595 nm處的熒光強(qiáng)度隨著2個(gè)配合物濃度的增加而顯著降低，這說(shuō)明配合物發(fā)生了類似于EB的插入作用，從而將EB從結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)。為定量研究這2個(gè)配合物對(duì)EB-DNA體系的熒光猝滅程度，可根據(jù)Stern-Volmer方程求得熒光猝滅常數(shù)Ksq［24］：I0/I=1＋Ksqr，其中I0為未加入配合物時(shí)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度，I為加入不同濃度配合物時(shí)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度，r=ccomplex/cDNA。將I0/I對(duì)r作圖，分別求得猝滅常數(shù)Ksq（1）=0.85，Ksq（2）=0.72。由此看出，配合物1的作用要強(qiáng)于配合物2，這可能是菲咯啉的平面性比2，2′-聯(lián)吡啶的要好，可以更好地嵌入到DNA的堿基對(duì)中。這與吸收光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與所報(bào)道的鎳配合物［Ni（PzTA）2CO3］·5H2O（Ksq=0.542），［NiQ（PyTA）（H2O）2］Cl·H2O（Ksq=0.708）和［NiQ（PzTA）（H2O）2］Cl·H2O（Ksq= 0.613）［25］相比要大些，但是明顯小于［Ni（atz）（DCA）（H2O）2］·2H2O（Ksq=1.38）［26］，與這些配合物的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

2.2.3圓二色光譜

CD光譜是研究小分子與DNA相互作用并探究其對(duì)DNA構(gòu)象影響的重要手段之一。CT-DNA的CD光譜在273 nm和245 nm處有2個(gè)明顯的特征峰，273 nm處正峰是由CT-DNA堿基對(duì)的π-π堆積作用引起的，245 nm處負(fù)峰則主要對(duì)應(yīng)于雙螺旋結(jié)構(gòu)的B型構(gòu)象［27］。圖5為配合物與CT-DNA作用的圓二色光譜。由圖中可以看出，當(dāng)加入相同濃度的配合物1和2后，DNA的CD譜發(fā)生了明顯的變化，273 nm處正峰逐漸增大，而245 nm處負(fù)峰基本不變，且配合物1引起的正峰增大值比配合物2更強(qiáng)。這說(shuō)明2個(gè)配合物與DNA的作用是插入到DNA堿基對(duì)中，影響到DNA堿基對(duì)之間的π-π堆積作用使DNA的構(gòu)象發(fā)生了改變［28］，并且配合物1對(duì)其構(gòu)象的影響要強(qiáng)于配合物2。這與紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜的結(jié)論是吻合的。

圖5　配合物對(duì)CT-DNA圓二色光譜的影響Fig.5　Effects of the two complexes on CD spectra of CT-DNA

2.2.4粘度測(cè)定

粘度測(cè)定被認(rèn)為是在缺乏晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下，確定配合物與DNA結(jié)合模式最有效的方法之一，其結(jié)果有時(shí)比光譜數(shù)據(jù)更具有說(shuō)服力［29］。配合物對(duì)DNA溶液粘度的影響有3種情況：（1）當(dāng)配合物以溝面或靜電方式與DNA作用時(shí)，對(duì)DNA雙鏈的影響較小，DNA溶液的粘度幾乎不發(fā)生改變；（2）當(dāng)配合物以部分插入方式 （或溝槽結(jié)合）進(jìn)入DNA堿基對(duì)時(shí)，使得DNA雙鏈發(fā)生扭結(jié)，降低DNA溶液的粘度；（3）當(dāng)配合物以插入方式與DNA作用時(shí)，DNA相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)變大來(lái)容納配合物小分子的插入，因而導(dǎo)致DNA雙螺旋鏈伸長(zhǎng)，使DNA溶液的粘度增大。圖6為不同化合物對(duì)DNA溶液粘度的影響。由圖6可看出，隨著配合物濃度的增加，DNA溶液的相對(duì)粘度增大，與插入劑EB所引起DNA溶液的粘度變化趨勢(shì)一致，而與溝槽結(jié)合劑甲基綠（MG）的變化趨勢(shì)相反。這說(shuō)明配合物1和2均以插入方式與CT-DNA結(jié)合，但比典型的插入劑EB要弱；且配合物1與DNA的插入作用要略強(qiáng)于配合物2。這與上述光譜研究結(jié)果是一致的。這可能是由于配合物1中配體phen的平面性好，且分子體積較小而空間位阻較小，有利于其與DNA的插入作用。

圖6　配合物、EB和MG對(duì)CT-DNA相對(duì)粘度的影響Fig.6　Effects of the complexes，EB and MG on the relative viscosity of CT-DNA

2.3SOD活性測(cè)定

氮藍(lán)四唑（NBT）光照還原法是測(cè)定物質(zhì)SOD活性的常用的方法。在光照條件下，核黃素（VB2）與四甲基乙二胺反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·），生成的O2-·使NBT還原為藍(lán)紫色化合物甲臜，甲臜在560 nm處有最大吸收，且吸光度與濃度成正比，因此通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間下吸光度A560的變化可以得到一條直線，直線斜率（K值）的大小可以反映甲臜生成的快慢。當(dāng)向該體系中加入SOD活性配合物后，其與NBT競(jìng)爭(zhēng)O2-·，從而減慢甲臜生成的速率。圖7為不同濃度的配合物對(duì)反應(yīng)體系吸光度隨時(shí)間變化曲線。由圖7可知，隨著配合物濃度的增大，直線的斜率逐漸變小，說(shuō)明濃度越大，抑制率越大。配合物對(duì)O2-·的抑制率（α）可以通過(guò)公式α=（1-k′/k）×100%求出［30］，其中k為未加配合物之前的直線斜率，k′為加入配合物后的直線斜率。以抑制率對(duì)配合物濃度作圖，可獲得抑制率為50%時(shí)的配合物濃度，即為一個(gè)活性單位IC50。IC50越小，活性越大。圖8為以抑制率α對(duì)配合物濃度作圖所得曲線，求得配合物1的IC50=51.5 μmol·L-1，配合物2的IC50= 58.1 μmol·L-1。其值與之前報(bào)道的鎳配合物［Ni（L）（HL）］（ClO4）·H2O（IC50=34.0 μmol·L-1）和［Ni（HL）（bipy）（H2O）］（NO3）（ClO4）·H2O（IC50=38.0 μmol·L-1）的IC50值相當(dāng)［31］，但與天然SOD（IC50=0.015 μmol·L-1）相比，相差較大［32］。這說(shuō)明該配合物具有一定的SOD活性。

圖7　配合物的濃度對(duì)反應(yīng)體系的吸光度（A560）-時(shí)間關(guān)系的影響Fig.7　Effect of complex concentration on the plot of absorbance of the reaction system vs time

圖8　配合物對(duì)O2-·的抑制率隨濃度變化曲線Fig.8　Change of inhibition rate of the complex to O2-· with various concentrations

3　結(jié)論

合成了L-組氨酸水楊醛希夫堿與菲咯啉或2，2′-聯(lián)吡啶混配體的2個(gè)鎳(Ⅱ)配合物，通過(guò)IR進(jìn)行了表征，利用X射線單晶衍射測(cè)定了其晶體結(jié)構(gòu)。利用紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測(cè)定等研究了配合物與CT-DNA的相互作用，結(jié)果表明配合物均以插入方式與CT-DNA作用，而配合物1對(duì)DNA的作用要強(qiáng)于配合物2，這是由于菲咯啉的平面性比2，2′-聯(lián)吡啶的要好，可以更好的插入到DNA的堿基對(duì)中。NBT光照還原法測(cè)定表明2種配合物都具有一定的SOD活性。這些結(jié)果可為研究氨基酸希夫堿鎳配合物的結(jié)構(gòu)和生物活性及作用機(jī)理提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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中圖分類號(hào)：O614.81+3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4861（2016）05-0789-10

DOI：10.11862/CJIC.2016.117

收稿日期：2015-12-12。收修改稿日期：2016-03-24。

Syntheses，Crystal Structures，DNA Interactions and SOD Activities of Two Nickel(Ⅱ)Complexes with L-Histidine Schiff Base

WEI Qiang1DONG Jian-Fang2LI Wen-Bin1ZHAO Pei-Ran1DING Fei-Fei1LI Lian-Zhi＊，1
（1School of Chemistry and Chemical Engineering，Liaocheng University，Liaocheng，Shandong 252059，China）
（2Department of Material Science，Shandong Polytechnic Technician College，Liaocheng，Shandong 252027，China）

Abstract：Two new nickel(Ⅱ)complexes，［Ni（Sal-L-His）（Phen）］·H2O（1）（Sal-L-His=the Schiff base derived from salicylaldehyde and L-Histidine，Phen=1，10-phenanthroline），and［Ni（Sal-L-His）（Bipy）］2·2CH3OH·3H2O（2）（Bipy= 2，2′-Bipyridine），have been synthesized.Their crystal structures have been determined by single crystal X-ra diffraction analysis.It showed that 1 is a mononuclear complex and belongs to monoclinic crystal system，P21/ space group with the cell parameters:a=1.586 31（13）nm，b=1.215 11（11）nm，c=1.211 30（9）nm，β=106.581（2）° V=2.237 7（3）nm3，Z=4；2 is a binuclear complex and belongs to orthorhombic crystal system，C2221space group with the cell parameters:a=1.415 30（13）nm，b=1.717 71（15）nm，c=2.256 02（19）nm，V=5.484 6（8）nm3，Z=4 The results of UV absorption，fluorescence，circular dichroism（CD）spectra and viscosity measurement indicated that the two complexes bind to CT-DNA in an same intercalative mode.SOD-like activities of the complexes were determined by the modified photoreduction of NBT.The value of IC50（1）is 51.5 μmol·L-1and IC50（2）is 58.1 μmol· L-1.CCDC:1038774，1；1420088，2.

Keywords：nickel(Ⅱ)complex；L-histidine Schiff base；crystal structure；DNA；SOD activity