閆彩虹++周家憲++王志強(qiáng)

摘要：通過(guò)建立檢測(cè)豬糞便中伊維菌素含量的HPLC方法，研究伊維菌素在豬糞便中的排泄規(guī)律，并在實(shí)驗(yàn)室條件下研究光照、溫度和微生物因素對(duì)豬糞中伊維菌素降解的影響。結(jié)果表明，健康育肥豬分別混飼給予30、100、200 mg/kg 的伊維菌素后，可在混飼給藥后1 d的豬糞便中檢測(cè)到伊維菌素，豬糞中伊維菌素排泄量在采食后3.5 d達(dá)到最高峰，峰濃度分別為13.58、30.11、52.16 mg/kg，并于144、168、168 h時(shí)檢測(cè)不到伊維菌素。在伊維菌素初始濃度分別為20、40、80 mg/kg的豬糞中，避光條件下，其平均半衰期為126.64 d，而光照條件下的平均半衰期僅為55.16 d。相同伊維菌素濃度的豬糞在15、25、35 ℃時(shí)的半衰期隨溫度升高有縮短趨勢(shì)，而50 ℃時(shí)半衰期較15 ℃時(shí)延長(zhǎng)。在未滅菌、滅菌及滅菌后添加伊維菌素高效降解菌的情況下，3組的平均半衰期分別為62.9、113.2、33.1 d。由此可見(jiàn)，應(yīng)重視伊維菌素原形進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，必要時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)其休藥期，另外還可以通過(guò)加強(qiáng)光照、堆肥和添加一定濃度的高效降解菌來(lái)加速豬糞中伊維菌素的降解，減少環(huán)境中藥物的殘留。

關(guān)鍵詞：豬糞；伊維菌素；排泄；降解

中圖分類(lèi)號(hào)： S828.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0305-03

伊維菌素是一種廣譜、高效、安全和用量小的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，其應(yīng)用非常廣泛。2003年伊維菌素被注冊(cè)用于治療人圓線蟲(chóng)病，在日本伊維菌素被用于控制老人的疥瘡?fù)话l(fā)癥[1]。養(yǎng)豬場(chǎng)通過(guò)飼喂含伊維菌素的飼料或使用伊維菌素注射液抗豬體內(nèi)外寄生蟲(chóng)。藥物大部分以原形形式隨畜禽糞便排出體外，這些含有伊維菌素的糞便直接或以施肥方式進(jìn)入土壤或水體，導(dǎo)致環(huán)境中伊維菌素殘留及其耐藥菌株的增加。因此，豬場(chǎng)對(duì)豬糞的處理方式直接影響藥物的環(huán)境殘留及生態(tài)效應(yīng)。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)相繼報(bào)道阿維菌素類(lèi)藥物在一些動(dòng)物及水產(chǎn)品體內(nèi)殘留消除規(guī)律的研究工作，如阿維菌素在綿羊糞[2]，多拉菌素在犬[3]、豬糞[4]、綿羊糞[2]中殘留消除規(guī)律，但到目前為止，伊維菌素在豬糞中的殘留消除規(guī)律的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)在建立豬糞中伊維菌素HPLC檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，研究商品肉豬飼喂含不同劑量伊維菌素的飼料后豬糞中伊維菌素濃度的變化規(guī)律，為伊維菌素藥代動(dòng)力學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)方面的研究提供參考。另外，在外界環(huán)境中，光照、溫度和微生物等因素都會(huì)影響化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定性及環(huán)境殘留，因此本試驗(yàn)擬在實(shí)驗(yàn)室條件下研究光照、溫度和微生物因素對(duì)豬糞中伊維菌素降解規(guī)律的影響，為研究畜禽排泄物作為肥料的安全性及可能對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物35日齡體質(zhì)量、健康狀況相近的商品豬40頭，購(gòu)自揚(yáng)州市邗江區(qū)富得養(yǎng)豬場(chǎng)，平均體質(zhì)量（30±1）kg。試驗(yàn)前預(yù)飼1周，預(yù)飼料中不添加任何獸藥。

1.1.2豬糞采集健康豬的新鮮糞樣，經(jīng)檢測(cè)不含伊維菌素，用于豬糞中伊維菌素降解規(guī)律研究。

1.1.3試劑與儀器伊維菌素原料藥，含量97.3%，浙江升華拜克生物股份有限公司產(chǎn)品。乙腈、甲醇均為色譜純，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。高效液相色譜儀（配LC-10ATVP泵、SPD-10ATVP紫外檢測(cè)器），日本島津公司產(chǎn)品；ODS-2HYPERSIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）不銹鋼色譜柱，菲羅門(mén)科技產(chǎn)品；Agilent SPE固相萃取小柱（500 mg/3 mL），美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

1.2豬糞中伊維菌素濃度的測(cè)定

樣品前處理：取1.0 g豬糞，加入10 mL乙腈，渦旋混合 2 min，超聲萃取10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清于另一干凈離心管中，沉淀再加入5 mL乙腈，按上述方法重復(fù)提取1次。混合2次的上清液，在上清液中加入15 mL乙腈飽和的正己烷溶液，混勻后4 ℃靜置20 min，棄去分層后的上層正己烷液，取下層液體過(guò)固相萃取小柱。固相萃取小柱先用 1 mL 甲醇激活，1 mL水平衡，然后再將下層液體過(guò)柱。加30%甲醇水溶液清洗小柱，再用93%甲醇水溶液洗脫。洗脫液13 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液過(guò)濾后待測(cè)。

色譜條件：流動(dòng)相甲醇 ∶水=93 ∶7（體積比），流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1伊維菌素在豬糞便中的排泄規(guī)律將40頭豬隨機(jī)分為4組，每組10頭。各組給藥情況如下：第1組空白組，即不添加任何獸藥，第2～4組分別以含30、100、200 mg/kg伊維菌素的全價(jià)飼料飼喂1次。各組豬給藥之前采集空白新鮮糞便1次，并在給藥后12、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168、192 h分別收集新鮮糞樣，按上述方法處理后檢測(cè)。

1.3.2光照對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響取9 cm玻璃平皿若干，各稱取20 g經(jīng)通氣滅菌的空白豬糞于平皿中，分別加入系列濃度的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)液后混勻，使伊維菌素濃度分別為20、40、80 mg/kg。制得的樣品分2批，第1批分3組，25 ℃避光放置；第2批3組樣品于光照培養(yǎng)箱中25 ℃，光照度6 500 lx，光暗比12 h ∶12 h放置。取樣時(shí)間為0、1、2、4、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50 d。

1.3.3溫度對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響非滅菌的空白豬糞中分別添加伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液，使伊維菌素濃度分別為20、40、80 mg/kg，然后置于恒溫15、25、35、50 ℃避光條件下培養(yǎng)。取樣時(shí)間同“1.3.2”節(jié)。

1.3.4微生物對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響試驗(yàn)分A、B、C 3組，每個(gè)平皿稱取20 g空白豬糞，A組不進(jìn)行滅菌處理，B、C 2組進(jìn)行高溫通氣滅菌處理，A、B、C 3組分別加入系列濃度伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)液混勻，使每組樣品中伊維菌素濃度分別為20、40、80 mg/kg，C組各平皿加入一定濃度伊維菌素高效降解菌混勻，而A、B 2組則加入與菌液等量的無(wú)菌超純水，最終制得未滅菌組、滅菌組和滅菌后加降解菌組3組樣品。所有樣品25 ℃避光培養(yǎng)。取樣時(shí)間同“1.3.2”節(jié)。

所添加的高效降解菌來(lái)自于筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選出的對(duì)伊維菌素具有高效降解性的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。

2結(jié)果與分析

2.1伊維菌素在豬糞便中的排泄規(guī)律

將HPLC分析所得的伊維菌素色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算出試驗(yàn)組豬飼喂含伊維菌素的飼料后不同時(shí)間點(diǎn)豬糞中伊維菌素的濃度值（表1），對(duì)照組均未檢測(cè)出藥物。100 mg/kg和200 mg/kg試驗(yàn)組豬在采食含伊維菌素的飼料后12 h，即能從豬糞便中檢測(cè)出伊維菌素；30 mg/kg組在采食后24 h可檢測(cè)出伊維菌素。84 h后3個(gè)添加劑量組均出現(xiàn)峰濃度，分別為13.58、30.11、52.16 mg/kg，并分別在144、168、168 h時(shí)各組豬糞中均檢測(cè)不到伊維菌素。

2.2光照對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響

25 ℃恒溫培養(yǎng)50 d，光照組和避光組豬糞中伊維菌素的濃度出現(xiàn)差異，將豬糞中伊維菌素濃度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)進(jìn)行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)各樣品的變化趨勢(shì)均符合C=C0e-kt的動(dòng)力學(xué)方程，其中t1/2=ln（2/k）。由表2可知，無(wú)論在光照還是避光條件下，高濃度組的半衰期均高于低濃度組的半衰期，說(shuō)明藥物濃度越高，降解越慢。另外在不同光照條件下，光照組豬糞中伊維菌素的平均半衰期為55.16 d，而避光組豬糞中伊維菌素的平均半衰期為126.64 d，說(shuō)明光照因素對(duì)豬糞中伊維菌素的降解起著非常重要的作用。

2.3溫度對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響

各濃度樣品不同溫度條件下培養(yǎng)50 d，豬糞中伊維菌素的濃度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)均符合動(dòng)力學(xué)方程C=C0e-kt，t1/2=ln（2/k）（表3）。15、25、35 ℃條件下相同濃度樣品伊維菌素的半衰期隨溫度升高相應(yīng)縮短，但50 ℃時(shí)半衰期較15 ℃時(shí)延長(zhǎng)。說(shuō)明溫度過(guò)高會(huì)抑制伊維菌素在豬糞中的降解，即在一定范圍內(nèi)環(huán)境溫度的升高可以促進(jìn)豬糞中伊維菌素的降解。

2.4微生物對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響

微生物條件不同（未滅菌、滅菌、滅菌后添加降解菌）的3組樣品25 ℃避光培養(yǎng)50 d，豬糞中伊維菌素的濃度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)均符合動(dòng)力學(xué)方程C=C0e-kt，t1/2=ln（2/k）。由表4可知，未滅菌組、滅菌組和滅菌后加降解菌組的平均半衰期分別為62.9、113.2、33.1 d。說(shuō)明微生物活性對(duì)藥物的降解影響很大，豬糞中本身存在的微生物有助于伊維菌素的降解，同時(shí)在滅菌豬糞中添加伊維菌素降解菌亦可促進(jìn)伊維菌素的降解。

3討論與結(jié)論

3.1伊維菌素在豬糞便中的排泄規(guī)律

吳中興等報(bào)道伊維菌素在狗、牛、羊、豬及大鼠體內(nèi)，無(wú)論是皮下注射、胃內(nèi)給藥還是口服途徑均能很快吸收；藥物主要經(jīng)糞便排泄，僅約2%從尿排出[5]。從本試驗(yàn)結(jié)果可看出，豬采食含伊維菌素的飼料后一定時(shí)間內(nèi)會(huì)有相應(yīng)量的伊維菌素隨糞便排出體外，殘留于豬糞中的藥物濃度隨藥物添加濃度增加而增加。這說(shuō)明伊維菌素在豬體內(nèi)代謝很少，大部分以原形形式通過(guò)糞便排出體外。這些含有伊維菌素的糞便直接或以施肥方式進(jìn)入周?chē)耐寥?、地表水和地下水中，必須注意其進(jìn)入環(huán)境后的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究表明，豬糞和豬場(chǎng)污水中含有大量獸藥原形及其代謝產(chǎn)物的殘留。Zhao等調(diào)查了中國(guó)8個(gè)省份的大型飼養(yǎng)場(chǎng)糞便中抗生素殘留情況，結(jié)果顯示在豬糞、牛糞和雞糞中都有四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留[6]。

本研究結(jié)果還表明，30、100、200 mg/kg試驗(yàn)組豬均在采食3.5 d后的豬糞中出現(xiàn)藥物峰濃度及在第7天時(shí)各組才均檢測(cè)不到伊維菌素。按國(guó)家規(guī)定，使用伊維菌素驅(qū)蟲(chóng)，休藥期至少應(yīng)達(dá)到牛28 d、羊8 d和豬5 d之后才能屠宰上市。這說(shuō)明在試驗(yàn)用藥劑量條件下，現(xiàn)在規(guī)定的豬的休藥期（5 d）并不能完全使殘留在豬體內(nèi)的伊維菌素排泄完畢。王小慶等研究了磺胺二甲嘧啶在豬糞中的排泄規(guī)律，也發(fā)現(xiàn)在停藥后20 d仍能在豬糞中檢測(cè)到SM2，說(shuō)明目前規(guī)定的SM2的休藥期（14 d）并不能使殘留在豬體內(nèi)的SM2排泄完全[7]。因此在按要求連續(xù)給畜禽飼喂伊維菌素后，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)其休藥期，以減少伊維菌素在畜禽體內(nèi)和排泄物中的殘留。同時(shí)，由于在用藥期內(nèi)，伊維菌素在豬糞中的殘留峰濃度遠(yuǎn)高于其最小抑菌濃度，因此必須重視用藥后豬排出的含伊維菌素的糞便對(duì)環(huán)境的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。吳昊等研究伊維菌素對(duì)7種水生生物的急性毒性試驗(yàn)表明，伊維菌素對(duì)斑馬魚(yú)、食蚊魚(yú)和鯽魚(yú)魚(yú)苗表現(xiàn)出較高的毒性，對(duì)羅氏沼蝦和大型溞均屬極高毒[8]。

3.2光照、溫度和微生物對(duì)豬糞便中伊維菌素降解的影響

在規(guī)范良好的試驗(yàn)條件、準(zhǔn)確的采樣分析技術(shù)條件下，藥物在環(huán)境中的單純降解一般可以用指數(shù)負(fù)增長(zhǎng)模型C=C0e-Kt來(lái)表達(dá)[9]。因此，本試驗(yàn)采用指數(shù)負(fù)增長(zhǎng)模型來(lái)擬合伊維菌素于不同光照、溫度和微生物影響因素下在豬糞中的降解規(guī)律。研究結(jié)果表明，豬糞中伊維菌素的降解受光照和微生物的影響較明顯，一定范圍內(nèi)溫度的提高對(duì)豬糞中伊維菌素的降解有促進(jìn)作用。因此，可以通過(guò)加強(qiáng)光照、堆肥和添加一定濃度的伊維菌素高效降解菌來(lái)加速豬糞中伊維菌素的降解，減少環(huán)境中伊維菌素的殘留，為有效地處理糞便污染以及降低環(huán)境中特定藥物殘留對(duì)策提供了一定的參考。Bednar等研究表明，光照可以加快雞糞中洛克沙胂的降解[10]。因此，豬糞被清除到豬舍外后，在用作肥料使用前可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄倳瘢欣谪i糞中伊維菌素的降解。目前，處理畜禽糞便最常用的方式是堆肥法。張樹(shù)清等報(bào)道，高溫堆肥對(duì)畜禽糞便中四環(huán)素類(lèi)抗生素具有不同程度的降解效果，而且堆肥中添加特定藥物降解菌劑可加快糞便中殘留藥物的去除[11]。目前，國(guó)內(nèi)已有“農(nóng)藥殘留降解菌劑”產(chǎn)品問(wèn)世，并獲得專利。因此，可以利用微生物來(lái)減少環(huán)境中的農(nóng)藥殘留[12]。

由此可見(jiàn)，養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)重視對(duì)豬糞的處理及伊維菌素進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，必要時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)休藥期，另外還可以通過(guò)加強(qiáng)光照、堆肥和添加一定濃度的伊維菌素降解菌來(lái)加速豬糞中伊維菌素的降解，減少環(huán)境中藥物的殘留。

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