哈力旦·依克熱木，蘆靜，周安定，曾潮武，曹俊梅，梁曉東，劉聯(lián)正，范貴強(qiáng)，張新忠，黃天榮，高永紅，吳新元

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊　830091)

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新疆部分小麥材料籽粒硬度基因等位變異的分子鑒定及其分布

哈力旦·依克熱木，蘆靜，周安定，曾潮武，曹俊梅，梁曉東，劉聯(lián)正，范貴強(qiáng)，張新忠，黃天榮，高永紅，吳新元

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊830091)

摘要：【目的】明確小麥籽粒硬度基因Puroindoline基因的等位變異組成與分布，比較新疆當(dāng)?shù)匦←湶牧吓c外引小麥材料硬度基因之間的差別，為改良新疆小麥品種奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坑肞ina-D1b、Pinb-D1b和候補(bǔ)基因非Pinb-D1b等位基因的分子標(biāo)記，對(duì)新疆種植小麥材料的籽粒硬度基因PINA和PINB的分布情況進(jìn)行分子鑒定?！窘Y(jié)果】在鑒定的263份材料中，含Pina-D1b基因的為19.77%，含Pinb-D1b的為29.28%，含互補(bǔ)基因非Pinb-D1b為70.72%；Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型在冬春小麥材料中分布不盡相同，Pina-D1b突變基因類型中，春小麥與冬小麥分別為52.68%與1.76%；在Pinb-D1b突變基因類型中，為12.9%與38.23%；Pina-D1b突變基因在新疆當(dāng)?shù)夭牧?、其他國?nèi)材料和國外材料中的頻率分別為28.57%、1.89%和33.96%，而Pinb-D1b基因類型的分布，不同來源材料出現(xiàn)的頻率差異不明顯?！窘Y(jié)論】新疆小麥材料中含有突變類型Pina-D1b基因與Pinb-D1b基因的分布。Pina-D1b、Pinb-D1b和候補(bǔ)基因非Pinb-D1b基因標(biāo)記引物，可作為小麥籽粒硬度基因鑒定的有效工具，提高小麥品質(zhì)的選擇效率。

關(guān)鍵詞：新疆小麥；Puroindoline基因；分子標(biāo)記；等位變異

0引 言

【研究意義】小麥籽粒硬度是影響小麥品質(zhì)的重要性狀，對(duì)磨粉和加工品質(zhì)有較大的影響，也是國內(nèi)外小麥?zhǔn)袌鲈Z分級(jí)和定價(jià)的重要依據(jù)。因此，研究新疆小麥材料的籽粒硬度基因(puroindoline)類型的組成與分布對(duì)新疆麥區(qū)的品質(zhì)改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，Puroindoline蛋白包括puroindoline a(PINA)和Puroindoline b(PINB)蛋白，是決定小麥籽粒硬度的主要因素，小麥籽粒硬度的差異是有Pina 和 Pinb基因的不同變異類型造成的，在普通小麥中Pina不表達(dá)或Pinb基因位點(diǎn)發(fā)生突變都可能會(huì)導(dǎo)致小麥胚乳質(zhì)地變硬，對(duì)磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)有正向作用[1-2]。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種puroindoline基因型，目前Pina位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)11種基因型，而Pinb位點(diǎn)則有20種基因型[3-6]，其中Pinb-Dlb基因型在大多數(shù)國家和地區(qū)的硬質(zhì)麥中占主導(dǎo)地位[5]。Chen等[8]研究表明控制小麥籽粒硬度的主效基因Pina 和Pinb位于5DS上，可解釋總變異的63.2%[8]，Pinb-D1b基因型比Pina-Dlb出粉率高、灰分低、具有更好的磨粉品質(zhì)，同時(shí)前者的饅頭、面條和面包加工品質(zhì)也均略為優(yōu)于Pina-Dlb和野生型。隨著對(duì)puroindoline基因研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者相繼開發(fā)了鑒定puroindoline基因型分子標(biāo)記[5，7]，加快了小麥籽粒硬度的研究進(jìn)程。新疆為冬春麥兼種區(qū)，以白粒硬質(zhì)、中強(qiáng)筋小麥品種作為選育目標(biāo)。新疆育種工作者對(duì)于新疆小麥材料籽粒硬度和puroindoline基因等位變異組成類型與分布尚不清楚，在小麥育種過程中，存在著一定的盲目性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆在小麥籽粒硬度的遺傳多樣性研究基礎(chǔ)較為薄弱。研究通過對(duì)新疆小麥育成品種與資源材料籽粒硬度主效基因Pinb-DIa和Pinb-DIb進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，發(fā)掘該地區(qū)的優(yōu)異種質(zhì)資源和基因資源，為新疆麥區(qū)小麥籽粒硬度改良提供信息?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究利用已開發(fā)籽粒硬度分子標(biāo)記，對(duì)263份新疆小麥材料進(jìn)行硬度基因型鑒定，明確新疆小麥材料硬度主效基因的變異類型，為新疆小麥品質(zhì)改良提供有用的信息，為有效利用Pina和Pinb不同類型品種資源提供理論依據(jù)。利用Pina和Pinb的分子標(biāo)記，分析puroindoline蛋白在新疆小麥資源的分布，對(duì)新疆小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

1材料與方法

1.1材 料

試驗(yàn)所用小麥材料來自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所小麥課題組，共263份(新疆春小麥品種93份 ，國外引進(jìn)冬小麥品種29份，新疆冬小麥品種43份，國內(nèi)冬小麥品種98份)。涵蓋新疆小麥(冬小麥和春小麥)的主栽品種。

1.2方 法

1.2.1基因組DNA提取

取小麥幼嫩葉片1～2 g充分研磨后分別放入2.0 mL離心管；加入1.0 mL CTAB提取液(20 g CTAB，1M Tris-HCl(pH 8.0)100 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)100 mL，5 M NaCl 280 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌后加 β-巰基乙醇至10 mM)，置于65℃水浴30 min，水浴過程中混勻數(shù)次；然后在4℃下12 000 r/m離心15 min；移上清至一新的2.0 mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿(1∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/m，離心15 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/m，離心10 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱30 min；4℃下12 000 r/m，離心15 min，去上清，加0.5 mL 乙醇(70%)，靜置5 min；4℃下12 000 r/m，離心5 min，去乙醇(70%)，室溫干燥后，溶于400 μL的1×TE中備用，用于基因位點(diǎn)檢測。

1.2.2特異性分子標(biāo)記

利用Chen等[7]開發(fā)的Pina-D1b標(biāo)記，引物序列(5’-3’), F-AATACCACATGGTTCTAGATACT，R-GCAATACAAAGGACCTCTAGAT；Giroux等[79]開發(fā)的非Pinb-D1b標(biāo)記F-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA，R-CTCATGCTCACAGCCGCC；與Pinb-D1b標(biāo)記F-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA， R- CTCATGCTCACAGCCGCT。

PCR體系20 μL，含模板80 ng DNA 1 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.4 μL，上、下游引物(5 μmol / L)各1.0 μL，dNTP 0.3 μL，10×PCR緩沖液2 μL，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性130 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用緩沖體系1×TAE溶液，180～200 V電壓電泳25 min，0.5%溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色10 min，蒸餾水漂洗后在GelDoc XR System成像系統(tǒng)上用紫外燈掃描成像并存入計(jì)算機(jī)，分析特異性條帶。

2結(jié)果與分析

2.1Pina-D1b基因的鑒定

Pina-D1b標(biāo)記為顯性標(biāo)記，利用Pina-D1b標(biāo)記，檢測PINA位點(diǎn)，擴(kuò)增可獲得一條為776 bp的片段，說明攜帶Pina-D1b基因，無擴(kuò)增片段說明不攜帶Pina-D1b基因。對(duì)263份供試材料進(jìn)行檢測，有52份材料擴(kuò)增出此片段，表明這52份材料屬于Pina-D1b基因型，為19.77%。說明在這批材料含有突變類型Pina-Dlb基因并不多，其它材料均無此條帶出現(xiàn)，則不含有Pina-Dlb基因類型。圖1

注：M：DL 2000，1： CY-127，2：CY-143，3：CY-104，4：新春6號(hào)，5：新春37號(hào)，6：新春2號(hào)

圖1特異性PCR標(biāo)記Pina-D1b對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR products amplified by the specific PCR markerPina-D1bin the materials tested

2.2Pinb-D1b基因的鑒定

鑒定Pinb-D1b基因，利用一對(duì)非Pinb-D1b標(biāo)記與Pinb-D1b標(biāo)記互補(bǔ)引物對(duì)供試材料進(jìn)行分子檢測，顯示部分材料的PCR擴(kuò)增條帶?？梢钥闯?，用特異的Pinb-D1b引物擴(kuò)增時(shí)，有新冬7號(hào)、伊農(nóng)18號(hào)等77份材料在250 bp處出現(xiàn)條帶，表明這些材料屬于Pinb-D1b突變基因類型，為供試材料的29.28%；相反利用Pinb-D1b引物擴(kuò)增出條帶的材料未擴(kuò)增條帶，用非Pinb-D1b標(biāo)記擴(kuò)增時(shí)，則材料均發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)位置出現(xiàn)了250 bp條帶，表明材料屬于非Pinb-D1b類型。圖2

注：M：DNA Ladder 2000 1：新冬35號(hào)，2：新冬6號(hào)，3：新冬7號(hào)，4：伊農(nóng)18號(hào)

圖2特異性PCR標(biāo)記Pinb-D1b與非Pinb-D1b對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2PCR products amplified by specific PCR labeledPinb-D1band nonPinb-D1bintle tested materials

2.3冬春小麥材料Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型分布規(guī)律

在263份供試材料中，春小麥93份，冬小麥170份；Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型在冬春小麥材料中分布不盡相同，Pina-D1b基因類型中，春小麥材料遠(yuǎn)高于冬小麥，為52.68%與1.76%；表明春小麥材料中以Pina-D1b突變類型基因?yàn)橹?，而冬小麥材料中Pina-D1b突變類型基因分布比例較少；在Pinb-D1b突變基因類型中，含有Pinb-D1b突變基因類型的春小麥材料為12.9%。冬小麥材料為38.23%，可見，在冬春小麥中含有Pina-D1b與Pinb-D1b突變基因類型分布頻率差異較大。圖3

2.4不同材料來源Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型分布規(guī)律

263份供試材料中，擴(kuò)增出776 bp的含有Pina-D1b突變基因的材料只有52份，在新疆當(dāng)?shù)夭牧?、其他國?nèi)材料和國外材料中的頻率分別為28.57%、1.89%和33.96%。不同來源品種(系)有一定差異，其他國內(nèi)材料遠(yuǎn)低于新疆當(dāng)?shù)夭牧?、國外材料。?duì)于Pinb-D1b基因類型的分布，不同來源的材料出現(xiàn)的頻率差異不明顯。新疆材料、國內(nèi)材料與國外材料的分布頻率分別為24.49%、29.24%和31.48%。表1

圖3　新疆冬春小麥材料中Pina-D1b與Pinb-D1b基因分布頻率比較

表1供試材料籽粒硬度puroindoline相關(guān)基因標(biāo)記的分布頻率

Table 1Allelic frequencies for puroindoline genes in the materials tested by molecular markers

來源Origin材料數(shù)AccessionnumberPina-D1b(%)Pinb-D1b(%)非Pinb-D1b(%)新疆當(dāng)?shù)仄贩NXinjianglocalcultivars4928.5724.4975.51其他國內(nèi)品種OtherChinesecultivars1061.8929.2470.76國外品種Overseacultivars10833.9631.4868.52合計(jì)Total26319.7729.2870.72

3討 論

籽粒硬度作為重要的小麥品質(zhì)性狀己成為國內(nèi)外育種家進(jìn)行品質(zhì)改良的重要指標(biāo)之一，利用雙引物對(duì)Pinb-D1b類型的基因型鑒定[10]，并利用新開發(fā)的Pina-N標(biāo)記進(jìn)行Pina-D1b類型的基因型鑒定[11]，快速準(zhǔn)確地鑒定小麥籽粒硬度的基因類型，可有效加速小麥硬度選擇的效率。Pinb-D1b、Pina-D1b類型是我國目前小麥品種中最常見的puroindoline基因型，有研究表明，Pinb-D1b類型的磨粉、面包烘焙品質(zhì)以及面條和饅頭的加工品質(zhì)均優(yōu)于Pina-D1b類型[12-13]。研究利用這三對(duì)引物對(duì)種新疆種植的小麥材料進(jìn)行基因型分析；含有Pinb-D1b基因型的材料為29.28%；表明新疆在小麥新材料選育中對(duì)籽粒硬度性狀的選擇重視不夠，導(dǎo)致其中含有非Pinb-D1b基因類型的材料較多。同時(shí)，在新疆春小麥材料以Pina-D1b基因類型為主導(dǎo)地位為52.68%，冬小麥材料中含Pinb-D1b類型遠(yuǎn)多于春小麥，總體來說Pinb-D1b基因類型在新疆小麥材料中占的比例較低，國外引進(jìn)小麥材料相對(duì)較高，而基因?qū)π←溩蚜Ｓ捕犬a(chǎn)生很大影響，借助puroindoline基因鑒定，有助于改良和提高新疆小麥材料的硬度基因類型，從而改善小麥面粉及制品的磨粉品質(zhì)、出粉率、與加工品質(zhì)、灰粉率等因素。

4結(jié) 論

通過對(duì)新疆小麥材料籽粒硬度基因型進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)在新疆小麥材料中以不含Pina-Dlb基因類型和非Pinb-D1b類型為主；在新疆春小麥材料中以Pina-D1b(PINA缺失)基因類型為主導(dǎo)地位，冬小麥材料中含Pinb-D1b類型遠(yuǎn)多于春小麥；Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型在冬春小麥材料中分布頻率差異較大；在未來的育種中，應(yīng)充分利用含Pinb-Dlb基因型的材料，用相關(guān)標(biāo)記早代進(jìn)行跟蹤輔助篩選，從基因水平改善小麥品質(zhì)。

新疆在小麥品質(zhì)改良未利用籽粒硬度基因型來進(jìn)行選育，明確了新疆小麥材料籽粒硬度Pina-D1b與Pinb-D1b基因類型分布特點(diǎn)，為新疆小麥品質(zhì)遺傳改良和推廣提供一定的理論依據(jù)。

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Fund project:The basic research funds of the Autonomous Region Public Welfare Research Institute (KY2014029); The special funds for major research and technology development plan projects of Xinjiang Uyghur Aotonomouse Region (201230116-1)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.001

收稿日期(Received)：2016-01-08

基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(KY2014029)；新疆維吾爾自治區(qū)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃重大專項(xiàng)(201230116-1)

作者簡介:哈力旦·依克熱木(1985-)，女，新疆人，研究方向?yàn)樾←溣N，(E-mail)halida9@163.com 通訊作者(Cotresponding author):蘆靜(1963-)，女，甘肅人，研究員，研究方向?yàn)樾←溒焚|(zhì)育種，(E-mail)lujing-321@163.com 吳新元(1962-)，男，河北人，研究員，研究方向?yàn)樾←溸z傳育種，(E-mail)xinyuanwu@126.com

中圖分類號(hào)：S512；S503.53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)06-0981-06

Distribution and Molecular Identification of Kernel Hardness Gene Alleles in Part of Wheat Germplasms of Xinjiang

Halidan Yikeremu，LU Jing，ZHOU An-ding，ZENG Chao-wu，CAO Jun-mei，LIANG Xiao-dong，Liu Liang-zhen，F(xiàn)AN Gui-qiang，ZHANG Xin-zhong，HUANG Tian-rong，GAO Yong-hong，WU Xin-yuan

(ResearcgInstituteofGrainCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

Abstract：【Objective】 The study is to research the allelic composition and distribution of kernel hardness gene(Puroindoline gene)and difference of kernel hardness gene between local wheat materials of Xinjiang and introduced wheat materials in the hope of laying the foundation for improvement of wheat variety in Xinjiang.【Method】Using molecular markers Pina-D1b, Pinb-D1b, and non-Pinb-D1b of complemental gene to identify distribution of kernel hardness gene PINA and PINB in cultivated wheat germplasms of Xinjiang.【Result】The results showed that 19.77% of materials had allele Pina-D1b, 29.28% of materials had allele Pinb-D1b and 70.72% of materials had allele non-Pinb-D1b in 263 germplasm; the alleles Pina-D1b and Pinb-D1b had a different distribution in winter and spring wheat germplasm, and spring and winter wheat materials respectively were 52.68% and 1.76% in mutant gene type Pina-D1b and 12.9% and 38.23% in mutant gene type Pinb-D1b; the distribution frequency of local materials of Xinjiang, other domestic materials and foreign materials were respectively 28.57%, 1.89% and 33.96% in mutant gene type Pina-D1b; but in mutant gene type Pinb-D1b, the distribution frequency did not have obvious difference.【Conclusion】The study concluded that wheat materials in Xinjiang had mutant gene type Pina-D1b and Pinb-D1b and using molecular markers Pina-D1b, Pinb-D1b, and non-Pinb-D1b of complemental gene could be acted as effective way to identify kernel hardness of wheat for enhancing efficiency of selection in wheat quality breeding.

Key words:Wheat in Xinjiang; puroindoline gene; molecular markers; alleles