許榮華，姜陸，寧雪飛，李冠

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊　830046)

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甜瓜T-DNA插入突變體的構建

許榮華，姜陸，寧雪飛，李冠

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830046)

摘要：【目的】構建激活標簽載體并將其轉入甜瓜中，獲得甜瓜T-DNA插入突變體，為甜瓜功能基因組學的研究奠定基礎?！痉椒ā坑肞CR法擴增目的DNA片段，經(jīng)EcoRI和SacI順序酶切，將目的片段連接到pCAMBIA2301載體上，構建含4×35s Enhancer DNA片段的激活標簽載體。以甜瓜品種 ‘伽師’為材料，利用農(nóng)桿菌介導的轉化體系轉化甜瓜愈傷組織，獲得甜瓜T-DNA插入突變體。【結果】獲得4株T0代甜瓜轉化幼苗，通過Kan篩選和PCR鑒定甜瓜轉化幼苗的DNA中是否含有目的基因，證明其中3株甜瓜轉化幼苗為轉基因植株。【結論】獲得了突變植株，為甜瓜重要性狀基因發(fā)掘奠定基礎。

關鍵詞：甜瓜；激活標簽；T-DNA插入突變體

0引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL．)是全球的10大水果之一[1]，也是葫蘆科基因組學研究的模式種。新疆作為厚皮甜瓜的次生起源中心之一,甜瓜品種類型之多、品質(zhì)之佳、分布之廣、栽培面積之大均居全國首位，有許多品質(zhì)優(yōu)良的甜瓜種質(zhì)資源,然而各品種均存在抗病性差、不耐弱光等問題[2]。盡管2012年甜瓜基因組測序的完成獲得了大量甜瓜基因組序列的數(shù)據(jù)[3]，但是DNA或者蛋白質(zhì)本身不能為基因的各項生物學功能提供足夠的信息。研究基因功能最直接的方法之一是破壞基因的表達并分析由此帶來的表型變化。由于除了能破壞插入位點基因的表達，插入的片段還能在分析突變體時用作分子標記，轉座子和農(nóng)桿菌T-DNA插入突變已經(jīng)成為最廣泛應用的方法。由于T-DNA插入拷貝數(shù)低，平均每一個轉化植株只含1.5個拷貝，而且能在后代穩(wěn)定遺傳，農(nóng)桿菌T-DNA插入突變已經(jīng)成為研究功能基因組學應用最廣泛的方法大規(guī)模構建甜瓜突變體，對表型特異突變體進行篩選與分析，明確相關基因的功能為甜瓜優(yōu)良基因資源的利用奠定了基礎。【前人研究進展】1992年，Hayashi等[4]創(chuàng)造出來激活標簽(Activation tagging)技術，構建了帶有四個串聯(lián)花椰菜病毒35S啟動子是增強子序列的T-DNA載體，轉入植物中獲得基因過表達的突變體。激活標簽技術在基因功能組學研究中發(fā)揮著重要的作用，激活標簽法構建突變體已應用到擬南芥[5]，水稻[6]，棉花[7],油菜[8]，番茄[9],矮牽牛[10]等植物基因功能研究中,并取得較好成果。運用激活標簽法,已從擬南芥中分離出lep、sturdy等30多種新的基因,并對ft、myb、yucca等基因進行了詳細的功能研究。其中ft基因編碼的蛋白產(chǎn)物是成花激素，是擬南芥誘導開花途徑中的重要基因；MYB轉錄因子基因編碼的MYB轉錄因子參與植物次級代謝過程，在木質(zhì)部合成和分化過程中起重要調(diào)控作用；與生長素含量有關的yucca基因編碼黃素類單加氧酶，YUCCA酶是色胺途徑中形成吲哚-3-乙醛肟的關鍵酶，YUCCA基因過表達導致吲哚-3-乙醛肟過剩，生長素含量上升，表現(xiàn)為高激素顯性[11-15]。而且Tani等發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的激活標簽載體不僅可用于研究植物的生長發(fā)育，也可用于發(fā)現(xiàn)抗病基因[16]?！颈狙芯壳腥它c】目前國內(nèi)外主要采用EMS化學誘變的方法獲得甜瓜突變體,結合高通量測序的方法點突變進行檢測[17]。而插入突變的方法在甜瓜構建突變體研究中并未見相關報道。通過T-DNA激活標簽法獲得甜瓜突變體，可實現(xiàn)對甜瓜基因功能的深入研究?！緮M解決的關鍵問題】構建激活標簽載體并轉化甜瓜愈傷組織，獲得再生植株，為甜瓜重要性狀基因的發(fā)掘奠定基礎，為分子標記輔助改良甜瓜品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1植物材料

甜瓜品種為卡拉克賽(又名伽師瓜)，種子購自于新疆哈密瓜種業(yè)有限責任公司。該品種的特點是晚熟(生育期110～119 d)、耐貯藏和耐運輸，高產(chǎn)，品質(zhì)中等，致命弱點是抗病性差。

1.1.2菌種和質(zhì)粒

E．coliDH5α，農(nóng)桿菌菌株Gv3101為實驗室保存；pCAMBIA2301質(zhì)粒為實驗室保存；pBinGlyRed3-35S質(zhì)粒(含4×35s Enhancer)由華中農(nóng)業(yè)大學的張椿雨先生所贈。

1.1.3工具酶和主要試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoRI和SacI)、T4DNA連接酶、Taq酶、DNA marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自上海寶生物工程公司；卡那霉素(Kanamycin)、頭孢(Cephalosporins)、利福平(Rifampicin)，其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方 法

1.2.1PCR引物設計

根據(jù)pBinGlyRed3-35s質(zhì)粒所含的4×35s Enhancer DNA序列，設計含有EcoRI(下劃線部分)上有引物：5’-GGAATTCCGCAGCGTATGGAT-3’和SacI(下劃線部分)下游引物：5’-CGAGCTCGATATAGAGGAAGGGTCT-3’。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2激活標簽載體的構建

以pBinGlyRed3-35s為模板進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性4 min ,94℃變性45 s,56℃退火45 s,72℃延伸90 s，共35個循環(huán), 72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR 產(chǎn)物檢測、測序。利用EcoRI和SacI順序酶切目的片段和pCAMBIA2301，切膠回收，16℃過夜連接，在T4DNA連接酶作用下構建激活標簽載體pCAMBIA2301-35s，熱激法將激活標簽載體轉化到大腸桿菌E．coli中，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定、測序。

1.2.3農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細胞及轉化

制備農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細胞，利用凍融法[18]將構建好的激活標簽載體轉入農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細胞中，并保存于 -80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4農(nóng)桿菌介導甜瓜轉化及培養(yǎng)

取無菌培養(yǎng)條件下萌發(fā)的甜瓜子葉,切取子葉中段，接種于預培養(yǎng)基(MSB+1.0mg/L 6-BA)上預培養(yǎng)3～5 d；取出外植體置于含有農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.5～0.7)的YEB液體培養(yǎng)中浸泡10 min,用無菌濾紙吸干外植體表面過多菌液,置于培養(yǎng)基(MSB+1.0 mg/L 6-BA)上暗培養(yǎng) 3～5 d；用200 mg/LCef水洗外植體后轉接到篩選分化培養(yǎng)基(MSB+1 mg/L 6-BA+500 mg/L Cef+50 mg/L Kan)上培養(yǎng)；待芽長至2 cm左右,切取小芽,轉入伸長培養(yǎng)基(MSB+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3+500 mg/L Cef+50 mg/L Kan)；最后置于生根培養(yǎng)基中(MSB+MSB+0.01 mg/L NAA)中生根。

1.2.5轉化苗PCR鑒定

DNA提取參照陸璐等[19]CTAB 法進行,以轉化苗DNA為模板，用4×35s Enhancer基因序列擴增的引物按照如下程序擴增：94℃預變性4 min后，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.14×35 s Enhancer基因克隆

以pBinGlyRed3-35s為模板，設計帶有酶切位點(EcoRI，SacI)的引物，PCR擴增4×35 s Enhancer DNA片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測與預期大小相符。將擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因測序，測序表明PCR擴增目的基因序列正確。圖1

M：DL2000 marker；CK：陰性對照；1，2：4×35s Enhancer PCR結果

M：DL2000 marker；CK：negative control；1，2：PCR products of 4×35s Enhancer

圖1帶有酶切位點的4×35s Enhancer PCR擴增

Fig.1 The amplification of 4×35s Enhancer with the two restricted sites ofEcoRI andSacI

2.2激活標簽載體的構建

用EcoRI和SacI順序酶切目的片段和pCAMBIA2301，切膠回收并過夜連接，后轉化到DH5α中，挑取具Kan抗性的陽性克隆，試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和SacI順序酶切鑒定酶切鑒定和測序驗證表明激活標簽載體pCAMBIA2301-35s構建成功，該載體含有4×35s EnhancerDNA片段。構建好的激活標簽載體經(jīng)凍融法轉化到農(nóng)桿菌Gv3101中，在篩選培養(yǎng)基(含Kan和Rif)上培養(yǎng)，挑取克隆在含有Kan和Rif的YEB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48 h，菌落PCR檢測，結果顯示有目的片段，表明已得到含有4×35s Enhancer DNA片段的Gv3101工程菌，可以用于愈傷組織的侵染。圖2，3

M：DL15000 marker；1:pCAMBIA2301；2：4×35s Enhancer；3：EcoRI和SacI順序酶切結果

M：DL15000 marker；1: pCAMBIA2301；-：4×35s Enhancer；3：EcoRI andSacI enzyme digestion

圖2重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s的EcoRI和SacI順序酶切鑒定

Fig.2Recombinant plasmid pCAMBIA2301-35s byEcoRI

M：DL2000 marker；+:陽性對照；-：陰性對照；1-8：菌落PCR

M：DL2000 marker；+:positivecontrol；-：negative control；1-8：PCR product of 8 transformedAgrobacteriumclons

圖3Gv3101工程菌菌落PCR擴增

Fig.3PCR product of transformedAgrobacteriumclons

2.3農(nóng)桿菌介導甜瓜轉化及培養(yǎng)

在無菌條件下培養(yǎng)卡拉克塞種子3～5 d獲得無菌苗，切取子葉中段接種于預培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后接種于MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3～5 d，共培養(yǎng)后的外植體置于篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，21 d左右外植體長出從生芽，切取外植體上的從生芽并接種到不定芽伸長培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得再生苗，待再生苗長至3～5 cm時，自其基部切下并轉接到生根培養(yǎng)基，生根。圖4

A：伽師瓜幼苗；B：預培養(yǎng)的外植體；C：農(nóng)桿菌侵染外植體；D：抗性愈傷組織預分化；E：轉化植株幼苗；F：轉化植株的生根練苗

A：Jiashi melon seeding；B：explants of pre-culture；C：Agrobacteriumtumef aciens infected explants ；D：pre-differentiation of resistant callus；E：seeding of transgenic plants；F：rooting and strengthening of transformed plantlets

圖4甜瓜遺傳轉化過程

Fig.4The process of genetic transformation in melon

2.4轉基因甜瓜苗的PCR鑒定

研究共獲得3株正常生長的陽性植株，用目的基因的引物對篩選出的T0代轉基因甜瓜幼苗進行PCR擴增檢測。結果表明，有3 株轉化苗可擴增出與目的片段大小一致的目的條帶，初步表明4×35s Enhancer DNA片段已轉入甜瓜基因組中。圖5

M：DL2000 marker；-：陰性對照；1-4：4株轉化苗PCR結果

M：DL2000 marker；-：negative control；1-4：PCR product of 4 transgenic melons

圖5轉基因植株PCR擴增結果

Fig.5The PCR results of the transgenic plants

3討 論

根癌農(nóng)桿菌介導甜瓜的轉化和組織培養(yǎng)過程中必須保證全程無其他雜菌，因此需要做好種子消毒工作。甜瓜種子帶有內(nèi)生菌，消毒不徹底會使再生苗受到污染而不能使用，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)放置時間較久的種子帶有的內(nèi)生菌較多，因此，應選擇當年獲得的種子作為合適的實驗材料[20]。

激活標簽法是引入增強子或強啟動子，通過改變臨近基因的表達模式與表達水平，使其過量表達或異時空表達，而產(chǎn)生功能獲得型突變，從而對該基因進行分離和鑒定的方法[21]。構建含4×35s Enhancer的激活標簽載體，并插入到植物基因組中，附近的基因表達活性可能大大增強，這可用于擬南芥，甜瓜等植物突變體庫的創(chuàng)建和篩選。激活標簽法在植物基因的分離、鑒定和植物基因功能的研究中發(fā)揮重要的作用。

4結 論

克隆了4×35s Enhancer目的片段，通過EcoRI和SacI順序酶切目的片段和載體pCAMBIA2301后，成功構建了激活標簽載體pCAMBIA2301-35s，用于甜瓜的遺傳轉化。通過農(nóng)桿菌侵染甜瓜愈傷組織，進行甜瓜的遺傳轉化，獲得甜瓜T-DNA插入突變體，經(jīng)PCR檢測，初步證明4×35s Enhancer已導入甜瓜基因組中。待甜瓜轉基因幼苗成長并在當代產(chǎn)生顯性突變，后通過基因定位技術確定基因的位置，確定該基因的功能，為發(fā)掘和利用甜瓜優(yōu)良基因奠定基礎。

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Fund project:Supported by national college students innovation and entrepreneurship training project and NSFC (Grant No.3126025)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.010

收稿日期(Received)：2016-02-26

基金項目:國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實訓項目；國家自然科學基金項目(3126025)

作者簡介:許榮華(1994-)，女，重慶人，本科，研究方向為植物生理生化與分子生物學，(E-mail)952138547@qq.com 通訊作者(Cotresponding author):李冠(1949-)，男，湖北人，教授，博士生導師，研究方向為植物生理生化與分子生物學,(E-mail)guanli@xju.edu.cn

中圖分類號：S652

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)06-1048-06

The Construction of T-DNA Insertional Mutants in Melons

XU Rong-hua, JIANG Lu, NING Xue-fei, LI Guan

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：【Objective】 In order to gain the T-DNA insertional mutants in melons and provide references for further research on the functional genetics of melons, the activation tagging carrier was constructed and transformed into melons.【Method】The target DNA was amplified from Saussurea involucrate Kar. & Kir by PCR, after EcoR I and Sac I digestion, the target enhancer was sub-cloned to pCAMBIA2301 vector. The activation tagging carrier was constructed. And the vector was transformed into the callus of Jiashi melons by using Agrobacterium tumefaciens. T-DNA insertional mutants were obtained.【Result】There were three regenerative plants that were transgenic plants identified by Kanamycin(Kan)screening and PCR.【Conclusion】The T-DNA insertional mutants were obtained, and the transgenic melons are likely to be used for the discovery of melon important trait gene.

Key words:melon； activation tagging；T-DNA insertional mutants