張可,許秋然

(浙江省人民醫(yī)院 急診科，浙江 杭州 310014)

耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在EICU的臨床分布及耐藥性

張可Δ,許秋然

(浙江省人民醫(yī)院 急診科，浙江 杭州 310014)

目的 探討耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)的臨床分布及其耐藥性的影響。方法 選取在2011年1月～2015年12月期間，浙江省人民醫(yī)院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的重癥患者為觀察對(duì)象，對(duì)分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進(jìn)行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機(jī)理研究；并進(jìn)一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率與利奈唑胺使用量之間的關(guān)系。結(jié)果 在研究期間，共計(jì)有49例患者根據(jù)臨床標(biāo)本分離出耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌株系，其中表皮葡萄球菌有40株(81.6%)，人葡萄球菌有9株(18.4%)；藥敏試驗(yàn)表明耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林的耐藥性達(dá)到了90%以上，對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、紅霉素的耐藥性在60%以上；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22區(qū)域出現(xiàn)突變的概率分別是87.5%、80%、50%和0；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發(fā)病率之間存在顯著的相關(guān)性(R=0.293，P<0.05)。結(jié)論 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)多種常見抗生素具有耐藥性，說明該類細(xì)菌的耐藥性問題已相當(dāng)嚴(yán)峻；同時(shí)利奈唑胺耐藥性形成機(jī)理并不單一，細(xì)菌在G2576T、L4、L5和L22區(qū)域出現(xiàn)基因突變均可能形成利奈唑胺耐藥性；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發(fā)病率之間存在顯著的相關(guān)性。

利奈唑胺耐藥性；凝固酶陰性葡萄球菌；急診重癥監(jiān)護(hù)病房

為了探討耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)的臨床分布及對(duì)其耐藥性進(jìn)行研究，本文對(duì)2011年1月～2015年12月期間從浙江省人民醫(yī)院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進(jìn)行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機(jī)理研究；并進(jìn)一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率與利奈唑胺使用量之間的關(guān)系?，F(xiàn)將研究成果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在2011年1月～2015年12月期間于浙江省人民醫(yī)院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者(血液分布42例，尿分布6例，腹水1例)作為研究對(duì)象。其中男40例(81.6%)，女9例(18.4%)，年齡39～82歲，平均年齡(60.8±14.7)歲，住院時(shí)間19～63 d，平均(45.0±10.2)d；患者主要來源于急診科(21例，42.9%)和內(nèi)科(12例，24.5%)；入住急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)的原因有呼吸衰竭(20例，40.8%)、休克(9例，18.3%)、多發(fā)傷(7例，14.3%)、中風(fēng)(5例，10.2%)和其它(8例，16.3%)；在進(jìn)行抗利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離研究的前1個(gè)月內(nèi)，大部分患者都進(jìn)行了一種或多種抗生素治療，主要有利奈唑胺(43例，87.8%)，β-內(nèi)酰胺類抗生素(42例，85.7%)、碳青霉烯類抗生素(27例，55.1%)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法：按照傳統(tǒng)微生物菌種分離和鑒定技術(shù)分離和鑒定所得的49種耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌菌株。根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行藥敏試驗(yàn)測(cè)定[6]，分別評(píng)估了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林、紅霉素等10種常用抗生素的耐藥性。此外，還通過cfr基因的PCR試驗(yàn)擴(kuò)增了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌rRNA 23S位點(diǎn)的V區(qū)域以及在核糖核蛋白L3、L4和L22區(qū)域的突變序列，并使用了DNASTAR軟件進(jìn)行了擴(kuò)增序列的排序和分析。

1.2.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)中的NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACCP)對(duì)于患者感染的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)級(jí)：膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克。同時(shí)，對(duì)微生物學(xué)反應(yīng)定義如下：根治型(在治療末期培養(yǎng)結(jié)果為陰性)、持續(xù)型(在治療期間培養(yǎng)結(jié)果為陽性)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用絕對(duì)頻率和百分比進(jìn)行定性變量描述，采用Kolmogorov-Smirnov(K-S)檢驗(yàn)正態(tài)分布情況。組別之間的差異性檢驗(yàn)采用Student’s t(T)法連續(xù)變量。當(dāng)結(jié)果數(shù)據(jù)稀少的情況采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分類鑒定結(jié)果 經(jīng)過分離培養(yǎng)49株耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分類鑒定結(jié)果顯示：表皮葡萄球菌40株(81.6%)，人葡萄球菌9株(18.4%)。

2.2 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 通過對(duì)49株耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在常用的10種抗生素中，耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林的耐藥性達(dá)到了90%以上；對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、紅霉素的耐藥性在60%以上；對(duì)萬古霉素、利福平的耐藥性在30%以上，對(duì)頭孢呋辛、克林霉素的耐藥性較低，見表1。由表1可知，目前耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)多種常用抗生素具有普遍的耐藥性，該類細(xì)菌的耐藥性問題已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)峻。

表1 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性研究Tab.1 The drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci to common antibiotics

2.3 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性形成機(jī)理研究 在耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離菌株中，共計(jì)有35.2%(6/17)的cfr基因表達(dá)為陽性。對(duì)2014年得到的8種耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)研究，見表2。通過對(duì)rRNA 23S位點(diǎn)V區(qū)域上的基因進(jìn)行排序和分析，發(fā)現(xiàn)共有7株菌株(87.5%)中存在G2576T突變，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L3位置發(fā)生突變。同時(shí)，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L4位置發(fā)生突變。沒有菌株在核糖核蛋白L22位置發(fā)生突變，其中WT為野生型。

表2 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性形成機(jī)理研究

從40株耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株中選取7株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)的圖形分析，見圖1。從圖1中可知，第1、2、3、4、6、7號(hào)菌株相互間具有同源性，第5號(hào)菌株與其余6株菌株不具有同源性。這表明大多數(shù)的耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株之間具有遺傳學(xué)相關(guān)性。

圖1 耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株P(guān)FGE分析結(jié)果Fig.1 The PFGE result of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci

2.4 利奈唑胺使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率之間的關(guān)系研究 在研究期間，耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌患病數(shù)和利奈唑胺的使用量均逐漸下降，見圖2、圖3。從圖2、圖3可知：在2011年分離出11例，2012年17例，2013年14例，2014年3例，2015年4例，總共分離出49例耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌。在研究期間，利奈唑胺臨床用率平均為12.2 DDDs/100住院天數(shù)。各年利奈唑胺臨床用率(DDDs/100住院天數(shù))分別為14.4(2010年)、13.8(2011年)、14.0(2012年)、11.6(2013年)、11.4(2014年)和8.1(2015年)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：在研究期間，利奈唑胺的使用量有顯著下降(R=-0.378，P<0.05)。利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發(fā)病率之間存在顯著的相關(guān)性(R=0.293，P<0.05)。

圖2 研究期間每年耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌患病數(shù)Fig.2 The prevalent cases of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in each year during research period

圖3 研究期間每年利奈唑胺使用情況Fig.3 The usage of linezolid in each year during research period

3 討論

利奈唑胺是一種人工合成的唑烷酮類抗生素，在臨床上普遍應(yīng)用于治療革蘭陽性(G+)球菌引起的各種感染。盡管迄今為止，葡萄球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥比例依然很低。但國(guó)內(nèi)外最新研究成果[7～8]表明：近年來，耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率在不斷攀升。因此，有必要對(duì)耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性展開研究。同時(shí)，雖然目前利奈唑胺的抗菌作用機(jī)制已經(jīng)明確：利奈唑胺是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，通過與細(xì)菌核糖體RNA的23S位點(diǎn)相結(jié)合，阻止70S起始復(fù)合物的合成，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[9]，但關(guān)于凝固酶陰性葡萄球菌耐利奈唑胺抗藥性形成機(jī)理研究還十分不足。夏夢(mèng)巖等[10]認(rèn)為凝固酶陰性葡萄球菌具有耐利奈唑胺抗藥性的主要原因是在rRNA的23S位點(diǎn)V區(qū)域發(fā)生了基因改變(主要為G2576T突變)，其次也可能為核糖核蛋白L3/L4位置發(fā)生基因突變。而Gu等[11]認(rèn)為利奈唑胺耐藥性形成機(jī)理也可能在于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒載體核糖體甲基轉(zhuǎn)移酶基因(cfr gene)。此外，利奈唑胺使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率之間存在聯(lián)系。Sanchez García等[12]認(rèn)為利奈唑胺在臨床應(yīng)用中的增長(zhǎng)在一定程度上導(dǎo)致了耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌的出現(xiàn)。

本文通過選取本院2011年1月～2015年12月定植或感染耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者為觀察對(duì)象，對(duì)分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進(jìn)行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機(jī)理研究；并進(jìn)一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發(fā)病率與利奈唑胺使用量之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，具有耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌主要由表皮葡萄球菌和人葡萄球菌突變形成；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)多種常用抗生素具有普遍的耐藥性，說明該類細(xì)菌的耐藥性問題已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)峻；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22區(qū)域出現(xiàn)突變的概率分別是87.5%、80%、50%和0，這說明利奈唑胺耐藥性形成機(jī)理并不單一；研究還發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發(fā)病率之間存在顯著的相關(guān)性，利奈唑胺的使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的發(fā)病率大體上呈正相關(guān)。

綜上所述，目前研究表明耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌已經(jīng)出現(xiàn)在急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)中的危重患者當(dāng)中。研究表明，利奈唑胺臨床用量較低時(shí)能有有效降低耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的發(fā)病率。因此，臨床上應(yīng)更加重視利奈唑胺的合理使用，盡量減少細(xì)菌對(duì)該類藥物產(chǎn)生耐藥性。

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(編校：王儼儼)

Clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in EICU

ZHANG KeΔ, XU Qiu-ran

(Department of Emergency, Zhejiang People Hospital, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo explore the clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci (CoNS) in intensive care unit (EICU).MethodsAn observational study was conducted in critically ill patients colonized or infected by linezolid-resistant CoNS in our hospital between from January 2011 to December 2015.The epidemiological and clinical features, and the mechanism of resistance to linezolid.The association between the incidence of linezolid-resistant CoNS strains and the consumption of linezolid in the study period were evaluated.ResultsDuring the study period, 49 patients had a linezolid-resistant CoNS strain isolated from clinical sample.Forty (81.6%) isolates were identified asS.epidermidisand nine wereS.hominis.The result of susceptibility testing indicated that linezolid-resistan CoNS had more than 90% resistant to penicillin, levofloxacin and ampicillin.Meanwhile, linezolid-resistan CoNS also had more than 60% resistant to tetracycline, amoxicillin and erythromycin.Molecular analysis confirmed the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 in 87.5%, 80%, 50%and 0, respectively, of the strains tested.Beside, a modest significant correlation was observed between the decrease in linezolid consumption and the lower incidence of resistant isolates.ConclusionLinezolid-resistant CoNS has resistant to many kinds of antibiotic.Meanwhile, molecular analysis confirms the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 of the strains tested, which confirms that different mechanisms of resistance to linezolid could coexist.Beside, a significant correlation is found between linezolid consumption and the incidence of linezolid-resistant CoNS strains.

linezolid-resistant; coagulase-negative staphylococci; emergency intensive care unit

張可，通信作者，本科，主治醫(yī)師，研究方向：急診內(nèi)科，E-mail: 2832212851@qq.com。

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.62