周敏，曾仁勇，劉園園，李長清，曹海軍Δ?，何澤超Δ?

(1.四川大學 化學工程學院，四川 成都 610065；2.中國醫(yī)學科學院輸血研究所，四川 成都 610052)

新型凝膠純化凝血酶原復合物的工藝探討

周敏1，曾仁勇2，劉園園2，李長清2，曹海軍2Δ?，何澤超1Δ?

(1.四川大學 化學工程學院，四川 成都 610065；2.中國醫(yī)學科學院輸血研究所，四川 成都 610052)

目的 探索新型凝膠Capto DEAE離子交換柱層析純化凝血酶原復合物的工藝條件。 方法 健康人混血漿經(jīng)離心去除冷沉淀后，采用DEAE-Sephadex A-50凝膠進行吸附，經(jīng)洗滌、洗脫得到洗脫液；將得到的洗脫液超濾脫鹽后，再通過Capto DEAE凝膠柱純化，制備凝血酶原復合物(prothrombin complex concentrates，PCC)。測定PCC中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及抗凝蛋白C的活性并計算收率；采用Bradford法測定PCC蛋白濃度，再根據(jù)測定的4種凝血因子和蛋白C的活性，計算有效成分的比活；以此分析所選工藝條件下Capto凝膠對PCC的純化效果。結(jié)果 不同實驗方案下，所得制品中FⅡ、FⅨ、FⅩ收率和純度均較高，且該3種凝血因子均衡度較好；但FⅦ 收率和純度均較低；其中A方案下PCC收率和純度較好，即Capto DEAE 凝膠體系平衡液、洗滌液、洗脫液中檸檬酸鈉、NaCl、pH分別為0.020～0.028 mol/L、0.10～0.15 mol/L、6.9～7.2；0.012～0.020 mol/L、0.10～0.15 mol/L、6.9～7.2；0.005～0.012 mol/L、2.4 mol/L、7.2～7.5時，F(xiàn)Ⅸ收率為(74.40±10.89)%，比活為(3.31±0.31)IU/mg，抗凝蛋白C的收率和比活均較高。結(jié)論 采用DEAE-Sephadex A-50批式吸附及Capto DEAE柱層析相結(jié)合的新方法制備PCC ，在所選擇條件下，PCC制品的純度為2.17～3.31 IU/mg，遠優(yōu)于傳統(tǒng)工藝制得的產(chǎn)品，此為高品質(zhì)PCC的制備提供了新的方法。

凝血酶原復合物；Capto DEAE凝膠；離子交換柱層析

人凝血酶原復合物(prothrombin complex concentrates，PCC)是從健康人混合血漿分離制備的血液制品，主要含依賴維生素K合成的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ[1-2]。PCC制品在20世紀70年代用于臨床，廣泛用于治療乙型血友病[3]、有抗凝血因子Ⅷ的甲型血友病[4]、維生素K缺乏引起的凝血因子水平低下導致的出血癥[5]、以及替代新鮮冰凍血漿逆轉(zhuǎn)維生素拮抗劑或香豆素類抗凝劑過量導致的各種出血性疾病[6-9]。目前國內(nèi)外生產(chǎn)PCC主要采用DEAE-Sephadex A-50吸附進行大規(guī)模制備[10-12]。我國現(xiàn)生產(chǎn)PCC的傳統(tǒng)工藝均采用DEAE-Sephadex A-50凝膠進行兩步批式吸附，該方法使用的吸附介質(zhì)DEAE-Sephadex A-50凝膠經(jīng)平衡后，機械強度差、易破碎[13]，不適用于柱層析技術(shù)[2]；另外DEAE-Sephadex A-50凝膠在重復應用中存在補加量難估計、不易控制等一系列問題[13]，從而導致制品質(zhì)量不易控制。本實驗研究中，對PCC的傳統(tǒng)工藝進行了改進，采用DEAE-Sephadex A-50凝膠吸附和Capto DEAE凝膠柱層析相結(jié)合的方法制備PCC，旨在探索使用Capto DEAE新型凝膠制備PCC的工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)PCC提供新的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：健康人混合血漿(四川省三臺10人混血漿)；DEAE-SephadeⅩ A-50凝膠(GE公司，批號：10091423)；Capto DEAE離子交換介質(zhì)(GE公司)；凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性檢測試劑盒(SIEMENS公司，批號：503630C、500749B、504107D、504009A)；Super-Bradford蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，批號：00111510)；正常質(zhì)控血漿(SIEMENS公司，批號：507704A)；PC缺乏乏漿(HYPHEM BioMed 公司，批號：31302-1 PK：2)；PC檢測試劑盒(HYPHEM BioMed 公司，批號：32901-PK：2)；蛋白weight Marker(Fermentas公司，批號：1671920)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器：精密天平(xS205，METTLER TOLEDO公司)；大容量高速低溫冷凍離心機(RC3BP+，Thermo公司)；pH儀(FE20，METTLER TOLEDO公司)；電導儀(FE30，METTLER TOLEDO公司)；AKTA explorer 100層析系統(tǒng)(GE Healthcare)；全自動凝血儀(CA-1500，Sysmex公司)；蛋白垂直電泳儀(Mini-Protean，Bio-Rad公司)；酶標儀(SpectraMax M2e，Molecular Devices公司)；凝膠成像儀(ImageQuant 350，GE公司)；純水儀(Milli-Q Advantage，Millipore公司)；恒溫水浴箱(HH-W600，金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 PCC的初步純化：按照傳統(tǒng)的批式吸附方法，使用DEAE-Sephadex A-50凝膠吸附新鮮冰凍人血漿制備出PCC粗液。參照文獻[1]，設(shè)定DEAE-Sephadex A-50凝膠平衡體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個可變因素分別為0.02～0.028 mol/L；0.10～0.15 mol/L；6.9～7.2；參照文獻[14]，設(shè)定洗滌體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個可變因素分別為0.012～0.02 mol/L、0.02～0.028 mol/L；0.10～0.15 mol/L； 6.6～6.9、7.2～7.5；參照文獻[15]，設(shè)定洗脫體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個可變因素分別為0.012～0.02 mol/L、0.005～0.012 mol/L；2.4 mol/L；6.6～6.9、7.2～7.5。見表1。

表1 4種實驗方案條件設(shè)計表Tab.1 Four kinds of experimental conditions

將制備出的PCC進行超濾處理，降低電導至10～12 ms/cm。再用于Capto DEAE離子交換柱層析進一步純化。

1.2.2 新型凝膠Capto DEAE純化PCC 采用AKTA explorer100層析系統(tǒng)，根據(jù)曹海軍等[2]對DEAE-Sephadex A-50的實驗研究，設(shè)置Capto DEAE凝膠的平衡體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個因素分別為0.02～0.028 mol/L；0.06～0.10 mol/L；6.6～6.9、6.9～7.2；洗滌體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個可變因素分別為0.012～0.02 mol/L；0.10～0.15 mol/L；6.9～7.2；設(shè)定洗脫體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個可變因素分別為0.005～0.012 mol/L、0.012～0.02 mol/L；2.4 mol/L；6.6～6.9、7.2～7.5；具體實驗條件見表1。

AKTA explorer100層析過程中，平衡、吸附、洗滌、洗脫過程流速分別為：3.5 cm/min、1.5 cm/min、2.5 cm/min、1.5 cm/min；具體操作參照AKTA explorer 100說明書。

1.2.3 凝血因子活性測定 凝固法(一期法)測定FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性，正常參比血漿做1/5～1/80梯度稀釋；硫酸魚精蛋白中和去冷沉淀原料混漿所含肝素，比例為10 μg硫酸魚精蛋白中和1IU肝素；洗脫液1/12稀釋；將處理好的待測樣品和試劑分別置于全自動凝血儀中，檢測凝血因子活性。具體操作見說明書。

1.2.4 蛋白C活性測定 發(fā)色底物法[16]測定PC活性，正常參比血漿1/5～1/80梯度稀釋；去冷沉淀原料血漿1/3稀釋；洗脫液1/10稀釋；將處理好的樣品先后與體外激活劑、發(fā)色底物試劑混合，用50%冰醋酸終止反應后，用酶標儀在405 nm處讀數(shù)。具體操作見說明書。

1.2.5 總蛋白含量測定 考馬斯亮藍法檢測PCC收集液的總蛋白含量，牛血清白蛋白為標準蛋白，洗脫液1/3稀釋，原料血漿1/60稀釋。將處理好的A-G BSA標準品和待測樣品分別加入標記好的96孔板微孔中，然后加入檢測試劑，充分混勻后用酶標儀測定595 nm處吸光值。具體操作見說明書。

1.2.6 SDS-PAGE 非還原性SDS-PAGE分析制備出的PCC的純度，并與國內(nèi)某公司已上市的PCC制品進行對比。PCC洗脫液1/3稀釋，國內(nèi)PCC制品(300 IU)1/360稀釋，至所檢測PCC樣品中FⅨ活性均約為0.9 IU/mL。參照文獻[17]方法，濃縮膠4%、分離膠10%進行非還原性SDS-PAGE；電泳過程中，濃縮膠電壓設(shè)置80 V，分離膠電壓設(shè)置為120 V。電泳后，凝膠用考馬斯亮藍R-250染色30 min、甲醇/乙酸混合物脫色1 h。

1.2.7 不同實驗條件對凝血因子收率及比活影響分析 依據(jù)1.4和1.6測定結(jié)果，計算上述4種凝血因子的收率及比活。統(tǒng)計3次試驗結(jié)果，依據(jù)平均值(n=3)，直接分析不同實驗條件對4種凝血因子收率及比活的影響趨勢。

2 結(jié)果

2.1 Capto DEAE柱層析 4種實驗方案下，層析圖譜均相似，3個峰依次為背景雜質(zhì)峰、洗滌峰及洗脫峰(目標蛋白峰)。圖1顯示，洗滌過程中洗去部分雜蛋白；洗脫峰均為單一峰。

圖1 4種實驗方案下Capto DEAE凝膠柱層析紫外檢測圖譜Fig.1 Capto DEAE-gel ion-exchange chromatograms of 4 kinds of experimental conditions

2.2 不同實驗方案下4種凝血因子的收率及比活 不同實驗條件下，4種凝血因子收率變化有明顯規(guī)律，從實驗方案A至D，4種凝血因子的收率均呈遞減的趨勢，其中FⅨ收率分別為：(74.40±10.89)%、(71.59±5.45)%、(61.57±2.46)%、(49.20±3.73)%；FⅦ、FⅨ、FⅩ比活在A、B、C實驗方案下遞減，其中FⅨ分別為：(3.31±0.31)、(2.68±0.55)、(2.17±0.15)IU/mg，而在D實驗條件下，均稍有升高，其中FⅨ(2.96±0.41)IU/mg。同一實驗條件下，F(xiàn)Ⅸ收率最高，F(xiàn)Ⅶ收率最低。方差分析顯示4種實驗方案下，F(xiàn)Ⅸ的收率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=6.188，P=0.018)，而比活比較差異無統(tǒng)計學意義(F=3.172，P=0.085)。見圖2。

圖2 4種實驗方案下凝血因子的收率及比活±s)Fig.2 The yield and specific activity of coagulation factors ±s)

2.3 不同實驗方案對蛋白C活性的影響 圖3顯示，不同實驗條件下，蛋白C收率變化規(guī)律不明顯，其中A、C實驗方案下，蛋白C的收率較高，分別為(46.31±10.43)%、(44.95±8.49)%，D實驗方案下收率最低為(32.57±8.86)%；蛋白C的比活在A、B、C實驗方案下遞減，分別為(0.86±0.22)、 (0.67±0.21)、(0.57±0.08)IU/mg，而在D實驗方案條件下，蛋白C比活稍有升高，為(0.62±0.19)IU/mg；4種實驗方案下蛋白C的收率(F=1.088，P=0.408)和比活(F=0.978，P=0.450)比較差異均無統(tǒng)計學意義。

圖3 4種實驗方案下蛋白C收率及比活±s)Fig.3 The yield and specific activity of protein ±s)

2.4 SDS-PAGE 4種實驗方案下，制品PCC所含蛋白種類基本一致(圖4條帶2、3、4、5)，蛋白條帶集中于分子量為49～198 kDa區(qū)間內(nèi)，表明本實驗制備的PCC不僅包含有效的凝血因子和抗凝蛋白(分子量為50～72 kDa)，還包含高分子量的雜蛋白，這與國內(nèi)某公司PCC制品電泳條帶相似(條帶6)；在分子量49 kDa以下，本實驗制備的PCC制品無明顯蛋白條帶出現(xiàn)，而國內(nèi)某公司PCC制品則顯示出較多的低分子量蛋白條帶，表明本實驗所探討實驗方案下制取的PCC制品所含的雜蛋白較少、純度更高。

圖4 不同實驗方案所制備PCC的SDS-PAGE 條帶1：蛋白marker ；條帶2：方案A制備PCC；條帶3：方案B制備PCC；條帶4：方案C制備PCC；條帶5：方案D制備PCC；條帶6：國內(nèi)某公司PCC制品Fig.4 SDS-PAGE analysis for four kinds of eluentLanes 1:protein weight marker; Lanes 2: eluet from A experimental condition;Lanes 3:eluet from B experimental condition ; Lanes 4: eluet from C experimental condition ; Lanes 5: eluet from D experimental condition; Lanes 6: PCC from a domestic company

3 討論

目前國內(nèi)外PCC多使用DEAE-Sephadex A-50批式吸附制備，但國內(nèi)現(xiàn)有的成型PCC制品中，與凝血因子Ⅸ相比，凝血因子Ⅱ、Ⅹ含量相對較高，PCC中凝血因子活性含量的不均衡增加了其產(chǎn)品的致栓性[18]。隨著血漿蛋白分離技術(shù)的發(fā)展，近幾年也有利用擴張床吸附(expanded bed adosorption, EBA)技術(shù)制備PCC[13]的報道，但仍處于實驗室探索階段，而使用Capto DEAE新型凝膠制備PCC還未見相關(guān)研究報道。由于目前沒有關(guān)于Capto DEAE生產(chǎn)PCC的研究報道，而Capto DEAE凝膠與DEAE-Sephadex A-50凝膠在結(jié)構(gòu)上有相似之處，Capto DEAE凝膠是在Capto基質(zhì)(一種高流動性的瓊脂糖基質(zhì))上引入二乙基氨基乙基的新型弱陰離子交換劑，DEAE-Sephadex A-50凝膠則是在交聯(lián)葡聚糖上引入二乙基氨基乙基的弱堿性陰離子交換劑[19]。所以根據(jù)曹海軍等[14-15]對DEAE-Sephadex A-50凝膠制備PCC的大量工藝研究，我們選取了其中較優(yōu)的制備條件，設(shè)計了A、B、C、D四種實驗方案來探索Capto DEAE凝膠制備PCC的工藝條件。

通過本實驗的探索，本研究發(fā)現(xiàn)，A到D 4種實驗方案下，4種凝血因子的收率依次遞減，且4種方案中FⅨ的收率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)Ⅶ、FⅨ、FⅩ比活在A、B、C實驗方案下遞減，而在D實驗條件下，均稍有升高，但其中FⅨ比活比較差異無統(tǒng)計學意義。A、C實驗方案下蛋白C的收率和比活均較高，在D方案下最低，4種實驗方案下蛋白C的收率和比活比較差異均無統(tǒng)計學意義?？傮w而言，方案A最佳。

采用此實驗方法制備PCC，在4種實驗方案下，檢測出制備的PCC純度均比國內(nèi)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的PCC高。在較好的實驗方案A下，F(xiàn)Ⅸ的收率達到(74.40±10.89)% 、比活為(3.31±0.31)IU/mg，其比活明顯高于國內(nèi)廠家制備的PCC制品比活(0.51～1.04 IU/mg)[20]。本研究認為這表明此實驗方法制備PCC對其純度有所提高，且Capto DEAE對FⅨ的吸附能力較好，可以顯著提高FⅨ收率。

同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，在所有實驗方案下，F(xiàn)Ⅶ的含量(0.25～0.30 IU/1 IU FⅨ)均低于國內(nèi)傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)出的PCC(0.93～2.19 IU/1 IU FⅨ)[21]，本研究認為一方面可能是Capto DEAE凝膠的處理及分離條件有待進一步優(yōu)化。本實驗選擇的Capto DEAE凝膠處理條件，參照曹海軍等[14-15]對DEAE-Sephadex A-50凝膠制備PCC的工藝條件。雖然Capto DEAE凝膠和DEAE-Sephadex A-50凝膠都屬于弱陰離子交換劑、配體都是二乙基氨基乙基，在結(jié)構(gòu)上有相似之處，但2種凝膠的基質(zhì)不同，DEAE-Sephadex A-50凝膠基質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖，而Capto DEAE凝膠基質(zhì)是一種高流動性的瓊脂糖。基質(zhì)不同、凝膠的分離特性有區(qū)別，故處理DEAE-Sephadex A-50凝膠的最優(yōu)條件并不一定適合用來處理Capto DEAE；另一方面可能是因為Capto DEAE凝膠本身對FⅦ的吸附能力不強，從而使制得的PCC制品中FⅦ水平較低；其確切原因有待進一步探討。

另一方面，本研究所制備的PCC盡管FⅦ含量較低，但其Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ 3種凝血因子均衡度明顯優(yōu)于目前國內(nèi)制品(FⅡ：1.44～3.62IU/1IU FⅨ；FⅩ：1.27～4.11IU/1IU FⅨ)[21]。國際上有已上市的3-factor PCC(低七因子凝血酶原復合物)制品[20]，本研究所探討的實驗條件是否為此制品的制備提供新的方法，有待進一步深入研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)本實驗制備出的PCC中蛋白C的含量相對較高，表明Capto DEAE凝膠對抗凝蛋白的吸附較強，從而使得蛋白C收率較高。

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(編校：王儼儼)

撤稿聲明

經(jīng)核實，原刊載于本刊2015年2月第2期名為“開口箭對S-180細胞和實體瘤的抑制作用研究”一文，第一作者為青海省第五人民醫(yī)院戚利坤，盜用南京醫(yī)科大學洪鳴教授國家自然科學基金號，且文章內(nèi)容存在嚴重學術(shù)不端行為。因此，本編輯部本著對作者、讀者負責的態(tài)度，對此文進行撤稿處理，并在本刊官網(wǎng)、知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫等撤除該稿件。

特此聲明！

Preparation technology of new gel-purified prothrombin complexes concentrates

ZHOU Min1, ZENG Ren-yong2, LIU Yuan-yuan2, LI Chang-qing2,CAO Hai-jun2Δ?, HE Ze-chao1Δ?

(1.College of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China; 2.Institute of Blood Transfusion,Chinese Academy of Medical Science, Chengdu 610052, China)

ObjectiveTo study the process conditions for new gel Capto DEAE ion exchange chromatography to purify prothrombin complexes concentrates.MethodsAfter removal of cryoprecipitate by centrifugation, healthy human plasma was mixed with DEAE-Sephadex A-50 gel. After that, the gel were washed and eluted to obtain eluate; then, the eluate, after being ultrafiltered, was loaded on a column packed with Capto DEAE-gel for chromatography to prepare PCC which was later determined for activities of coagulation factors Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ and anticoagulation protein C, with their yield calculated. Besides, the protein concentration of PCC was determined using the Bradford method, based on which the specific activity of the four coagulation factors and protein C were calculated. According to the results, purification effect of Capto DEAE-gel on the PCC was analyzed.ResultsUnder different experimental conditions, the yield and purity of the coagulation factors FⅡ,FⅨ and FⅩ were high, and the equilibrum degree of the three factors was good; however, the yield and purity of coagulation factor FⅦ were very low. When the three variables (sodium citrate, NaCl and pH) in balanced solution, washing solution and elution were 0.020-0.028 mol/L, 0.10-0.15 mol/L and 6.9-7.2；0.012-0.020 mol/L, 0.10-0.15 mol/L and 6.9-7.2；0.005-0.012 mol/L, 2.4 mol/L and 7.2-7.5 , respectively,the yield and purity of PCC prepared from Capto DEAE-gel were good. Under this condition, yield of factor Ⅸ was (74.40±10.89)% and purity of factor Ⅸ was (3.31±0.31) IU/mL. Under different experimental conditions, yield and specific activity of anticoagulant protein C were higher.ConclusionThe purity of four coagulation factors and anticoagulation protein C of PCC prepared by the new method that combined the batch adsorption with DEAE-sephadex A-50 was combined with column chromatography packed with Capto DEAE-gel are higher than those prepared by the routine procedure. Furthermore, the PCC are better than these products obtained by traditional process, whose purity are 2.17-3.31IU/mg. Therefore, these studies will lay the groundwork for exploring novel preparation process of producing PCC.

prothrombin complex concentrate; Capto DEAE-gel; ion-exchange column chromatography

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.058

四川省科技支撐計劃(2014SZ0123)

周敏，女，碩士，研究方向：生物工程，E-mail：ZM_wendy@126.com；曹海軍，通信作者，男，碩士，副主任技師，研究方向：血液生化與分子生物學研究，E-mail：chjr007@163.com；何澤超，共同通信作者，男，博士，副教授，研究方向：生化產(chǎn)品分離、污染物的生物凈化，E-mail：hezechao@scu.edu.cn。

Q819；TQ464.8；R457.1+4

A