韋鵬飛，申炎龍，葉 霞，鄭先波，譚 彬，李繼東，馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

轉(zhuǎn)抗菌肽D基因中華獼猴桃的鑒定及抗病性相關(guān)酶活性研究

韋鵬飛，申炎龍，葉 霞，鄭先波，譚 彬，李繼東，馮建燦*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

以轉(zhuǎn)抗菌肽D基因的中華獼猴桃抗性芽為材料，通過誘導(dǎo)生根和移栽獲得獼猴桃盆栽苗。對盆栽苗進行PCR和RT-PCR鑒定表明，抗菌肽D基因已經(jīng)整合到獼猴桃基因組中，并進行了轉(zhuǎn)錄。對盆栽苗葉片中的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性分析結(jié)果表明，在噴施獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌(1.2×107～1.2×108，OD600值為0.2)的條件下，轉(zhuǎn)基因植株的CAT和POD活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯降低，PAL活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯升高。

中華獼猴桃； 抗菌肽D； 過氧化氫酶； 過氧化物酶； 苯丙氨酸解氨酶

獼猴桃(Actinidiachinensis)隸屬獼猴桃科獼猴桃屬，富含維生素C、膳食纖維、多種礦物營養(yǎng)，并具有清腸健胃等功效，已得到廣泛的青睞，成為重要的水果種類之一。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病，是一種毀滅性細(xì)菌病害，對世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅。該病主要危害獼猴桃的主干、枝蔓、新梢和葉片，極易造成植株死亡[1-2]，該病1980年在日本首次發(fā)現(xiàn)[3]，1983年后在美國等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[4]，1987年病原菌被鑒定為丁香假單孢桿菌獼猴桃致病性變種[3]。目前尚無有效方法抑制獼猴桃潰瘍病害的發(fā)生，而采取基因工程技術(shù)、定向改造生物基因結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)抗病性強的品種是避免潰瘍病帶來損失的有效方法之一。抗菌肽(antibacterial peptides)是一種小分子多肽物質(zhì)，因為發(fā)現(xiàn)其對微生物，如細(xì)菌[5]、真菌[6]、抗原蟲[7]等具有抑制作用，因此又將其稱為抗微生物多肽(antimicrobial peptides)。目前，已有相關(guān)的研究將抗菌肽轉(zhuǎn)入到植物中，如黃大年等[8]應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化法將含有抗菌肽B基因的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入水稻未成熟胚，獲得了一些轉(zhuǎn)基因水稻植株，轉(zhuǎn)基因水稻植株增強了對水稻白葉枯病和細(xì)條病的抗性。田長恩等[9]用花粉管通道法將柞蠶抗菌肽D基因?qū)敕眩@得了轉(zhuǎn)基因植株，部分轉(zhuǎn)基因植株的子一代具有較強的抗青枯病能力。

為了增強中華獼猴桃的抗性，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟林良種選育與栽培實驗室已通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗菌肽D基因?qū)氲街腥A獼猴桃植株中，獲得了大量的抗性芽[10]。為了進一步檢測目的基因是否在獼猴桃基因組中進行轉(zhuǎn)錄表達，并表現(xiàn)抗獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病特性，分別利用PCR和RT-PCR的方法對抗性植株進行分子鑒定；對移栽到溫室的獼猴桃幼苗噴施獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌，分析噴施菌液前后獼猴桃相關(guān)酶活性的變化，研究轉(zhuǎn)基因植株的抗性變化，為獲得抗病新種質(zhì)打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以課題組獲得的轉(zhuǎn)抗菌肽D 基因的3個中華獼猴桃株系(L1、L2、L3)及未轉(zhuǎn)基因的中華獼猴桃植株(對照)為供試材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 生根培養(yǎng)及移栽 將2 cm左右的莖段(帶葉片)接種到分別含有0.6、1.0 mg/L NAA，0.6、1.0 mg/L IBA的基本培養(yǎng)基中(處理1—4)；使用1.0 g/L 的 IBA處理15 s，然后使用濾紙吸附多余的溶液后接種于基本培養(yǎng)基中(處理5)?；九囵B(yǎng)基為MS+0.3 mg/L GA3+6 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。每個處理接種20個莖段，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和生根率，以愈傷組織直徑大于0.5 cm為統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)。

移栽時使用自來水清洗根部，洗去殘留的培養(yǎng)基，然后使用0.1%的多菌靈進行殺菌處理。基質(zhì)組成為蛭石、珍珠巖、草炭(體積比為1︰1︰1)，經(jīng)過高溫滅菌處理，含水量以手握微滲出水滴為宜，移栽后不進行澆水，使用700 mL一次性透明塑料杯進行保濕處理。1個月后放置于人工氣候箱中，光周期為14 h/10 h(光/暗)，溫度為20～22 ℃。

1.2.2 盆栽苗葉片的DNA提取及目的產(chǎn)物檢測 基因組DNA的提取、PCR擴增程序和反應(yīng)體系參照文獻[10]，PCR反應(yīng)的上游引物序列：5'-GGCCCCGGGATGTGGAACCCTTTCAAG-3'，下游引物序列：5'-GCCGAGCTCTTACTTAGCCAAAGCAGT-3'，擴增的目的基因片段的長度為122 bp。

1.2.3 盆栽苗葉片的RNA提取及RT-PCR檢測 RNA分離采用試劑盒提取法(上海生工生物工程有限公司)，采用ABI公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit進行cDNA的合成。cDNA的合成使用1 μg總RNA建立20 μL的體系，將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋至200 ng/μL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR反應(yīng)引物參照文獻[10]等，內(nèi)參基因選用18S RNA，上游引物：5'-TGCCCGTTGCTCTGATGAT-3'；下游引物：5'-TTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3'，目的片段長度為189 bp。

以稀釋過的cDNA為模板，反應(yīng)體系為：1 μL cDNA模板、上下游引物(濃度5 μmol/L)各1 μL、10 μL Real Master Mix、7 μL ddH2O，共20 μL，混勻后進行擴增。擴增程序參照文獻[10]。1.2.4 酶活性的測定 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所提供，菌液濃度為1.2×107～1.2×108cfu/mL，OD600值為0.2。盆栽苗的菌液接種時使用100 mL噴壺，距離葉片20 cm左右，直接噴灑。為了分析轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的酶活性的變化，分別于噴施菌液處理前1 d和處理后20 d(潰瘍病發(fā)病周期約為15 d)各采樣1次。采樣部位為莖尖以下完全展開的第2—4片葉子，然后液氮速凍后，保存-80 ℃?zhèn)溆?。每個株系每次取6個植株的葉片，重復(fù)3次。葉片的過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性按照試劑盒說明進行測定，試劑盒購買自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS進行處理，方差分析采用T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對獼猴桃莖段生根的影響

試驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加NAA、IBA均能誘導(dǎo)莖段生根，且生根率均可達到100%。不同的生根處理產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量有很大的差異，其中處理1—4根系愈傷組織誘導(dǎo)率均達100%(圖1);而處理5使用1.0 g/L IBA處理15 s，可以產(chǎn)生大量的根系而僅有極少量愈傷組織,直徑大于0.5 cm的愈傷組織誘導(dǎo)率為0，處理5組培苗移栽后成活率達到95%，生長狀況良好(圖2)。

1、2.IBA 0.6、1.0 mg/L；3、4.NAA 0.6、1.0 mg/L；5.1.0 g/L IBA處理15 s圖1 不同處理的中華獼猴桃生根狀況

圖2 中華獼猴桃移栽45 d后的生長狀況

2.2 轉(zhuǎn)基因獼猴桃抗菌肽D基因的 PCR檢測結(jié)果

以未轉(zhuǎn)化的盆栽苗DNA為陰性對照、以含抗菌肽D基因的質(zhì)粒為陽性對照進行PCR檢測，以抗菌肽D基因兩端序列設(shè)計特異引物進行擴增，結(jié)果表明(圖3)，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因盆栽苗均擴增出122 bp的特異目的條帶。這表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源抗菌肽D基因已經(jīng)整合到獼猴桃基因組中。

M.DL2000 Marker； 1.陽性對照；2.陰性對照； 3.L1; 4.L2; 5.L3圖3 轉(zhuǎn)基因獼猴桃抗菌肽D基因的 PCR檢測結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)基因獼猴桃抗菌肽D基因的RT-PCR檢測結(jié)果

對轉(zhuǎn)基因和對照植株的RNA進行提取，RT-PCR的擴增結(jié)果表明，抗菌肽D基因已在中華獼猴桃基因組中進行轉(zhuǎn)錄(圖4)。從條帶的亮度上可以看出，目的基因的表達量是有差異的，其中L1的亮度最強，L2次之，L3的亮度最弱，而內(nèi)參基因的亮度基本一致，這表明目的基因在獼猴桃基因組中有轉(zhuǎn)錄，其中在L1株系中的轉(zhuǎn)錄量最高。

M.DL2000；1—5分別為陽性對照、陰性對照、L1、L2、L3的D基因；6—9分別為陰性對照、L1、L2、L3的內(nèi)參基因圖4 轉(zhuǎn)基因獼猴桃抗菌肽D基因的RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 噴施菌液前后轉(zhuǎn)基因獼猴桃CAT、POD、PAL活性的變化

2.4.1 CAT活性 由圖5可以看出，在噴施菌液前，3個轉(zhuǎn)基因株系CAT活性與對照相比無顯著差異，其中轉(zhuǎn)基因株系L1和L2 CAT活性比對照略高，而L3比對照略低。在噴施菌液后20 d，盆栽苗未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，但是CAT活性發(fā)生變化，其中對照植株和L3的CAT活性上升，而L1和L2的CAT活性略有下降，但是所有轉(zhuǎn)基因植株的CAT活性均比對照低。

同一時間不同小寫字母表示不同株系間差異顯著(P<0.05),下同圖5 轉(zhuǎn)基因獼猴桃植株和對照的CAT活性比較

2.4.2 POD活性 從圖6可以看出，在噴施菌液前，轉(zhuǎn)基因株系和對照的POD活性雖有差別，但差異不顯著。噴施菌液后20 d，所有株系的POD活性均有所降低，但3個轉(zhuǎn)基因株系下降的幅度較對照植株大。其中，L1、L2、L3的POD活性分別比處理前1 d下降50.3%、78.2%、56.2%，而對照僅下降18.0%。所有轉(zhuǎn)基因株系 POD活性均低于對照。

圖6 轉(zhuǎn)基因獼猴桃植株和對照的POD活性比較

2.4.3 PAL活性 由圖7可以看出，噴施菌液前轉(zhuǎn)基因株系和對照的PAL活性差異不顯著，但在噴施菌液后20 d，3個轉(zhuǎn)基因株系的PAL活性均比對照植株顯著增加。同時，3個轉(zhuǎn)基因株系和對照的PAL活性均比菌液處理前升高，其中對照的PAL活性增加63.4%，轉(zhuǎn)基因株系L1、L2、L3分別增加135.0%、311.4%、60.3%。

圖7 轉(zhuǎn)基因獼猴桃植株和對照的PAL活性比較

3 結(jié)論與討論

CAT是一種酶類活性氧清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的H2O2，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。石志軍等[11]研究指出，健康獼猴桃的葉片CAT活性與病情指數(shù)有很高的相關(guān)性。本研究的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系L1和L2的CAT活性比對照高，預(yù)示著轉(zhuǎn)基因株系L1和L2的抗病性有提高的可能性。接種菌液后20 d，3個轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性卻均比對照低。所以轉(zhuǎn)抗菌肽D的獼猴桃植株的抗病性是否能有效提高，還需進一步病菌接種驗證。

POD是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，是以H2O2為電子受體催化底物氧化的酶。對于POD活性在植物抗病性方面的作用，有研究認(rèn)為POD活性與植物的抗病性具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，例如1991年田秀明等[12]對抗病性不同的棉種和品種的幼苗葉片內(nèi)POD活性進行比較，結(jié)果表明，抗病性強的植株酶活性低。但是也有研究表明，植物的抗病性與葉片的POD活性呈正相關(guān)，如Joseph等[13]連續(xù)3 a對4個大豆品種和5個品系的根部、莖部的病害調(diào)查及對其葉片POD活性的分析表明，發(fā)病輕的POD活性較高，而發(fā)病重的POD活性較低。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性在細(xì)菌性潰瘍病病原菌接種前后總體上均比對照低，可能暗示著POD活性與抗病性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

植物體內(nèi)的PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，其活性和植物抗病性有著密切關(guān)系[14]，根據(jù)有關(guān)PAL與抗病性關(guān)系的研究報道[15-16]，植物在受到各種病原菌感染后,可以觀察到PAL活性升高，PAL活性的變化與抗病性呈正相關(guān)性。本試驗結(jié)果顯示，抗菌肽D基因可以有效地提高細(xì)菌性潰瘍病病原菌感染后轉(zhuǎn)基因植株的PAL活性。

[1] 李泉廠，陳金煥，王西紅.不同藥劑防治獼猴桃潰瘍病效果研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013(11)：130-131.

[2] 王永蘭，杜永章，施正偉.獼猴桃潰瘍病發(fā)生特點及綜合防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(23)：188.

[3] Takikawa Y,Serizawa S,Ichikawa T,etal.Pseudomonassyringaepv.actinidiaepv.nov:The causal bacterium of canker of kiwifruit in Japan [J].Japanese Journal of Phytopathology,1989,55(4):437-444.

[4] Dan C O.Pseudomonas canker of kiwifruit[J].Plant Disease,1983,67(11):1283-1284.

[5] Vizioli J,Salzet M.Antimicrobial peptides from animals:Focus on invertebrates[J].Trends in Pharmacological Sciences,2002,23(11):494-496.

[6] Iijima R,Kurata S,Natori S.Purification,characterization,and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph ofSarcophagaperegrina(flesh fly) larvae[J].Journal of Biological Chemistry,1993,268(16):12055-12061.

[7] Boman H G,Wade D,Boman I A,etal.Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids[J].Febs Letters,1989,259(1):103-106.

[8] 黃大年，朱冰，楊煒，等.抗菌肽B基因?qū)胨炯稗D(zhuǎn)基因植株的鑒定[J].中國科學(xué)(C輯)，1997，27(1)：55-62.

[9] 田長恩，王正詢，陳韜，等.抗菌肽D基因?qū)敕鸭稗D(zhuǎn)基因植株的鑒定[J].遺傳，2000，22(2)：86-89.

[10] 尚霄麗.獼猴桃、棗高效再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[11] 石志軍，張慧琴，肖金平，等.不同獼猴桃品種對潰瘍病抗性的評價[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，26(3)：752-759.

[12] 田秀明，杜利鋒.棉花對枯、黃萎病的抗性與過氧化物酶活性的關(guān)系[J].植物病理學(xué)報，1991，21(2)：94,381.

[13] Joseph L M,Tan T K,Man W S.Antifungal effects of hydrogen peroxide and peroxidase on spore germination and mycelial growth ofPseudocercosporaspecies[J].Canadian Journal of Botany,2011,76(12):2119-2124.

[14] 歐陽光察，薛應(yīng)龍.植物苯丙烷類代謝的生理意義及其調(diào)控[J].植物生理學(xué)通訊，1988(3)：9-16.

[15] 張俊華，崔崇士.不同抗性南瓜品種感染Phytophthoracapsici病菌后幾種酶活性測定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，34(2)：124-128.

[16] 劉亞光，李海英，楊慶凱.大豆品種的抗病性與葉片內(nèi)苯丙氨酸解氨酶活性關(guān)系的研究[J].大豆科學(xué)，2002，21(3)：195-198.

Identification of TransgenicActinidiachinensisPlants with Antibacterial Peptide D Gene and Analysis of Disease-resistant Related Enzyme Activities

WEI Pengfei,SHEN Yanlong,YE Xia,ZHENG Xianbo,TAN Bin,LI Jidong,FENG Jiancan*

(Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In the present study,the transgenicActinidiachinensisshoots with antibacterial peptide D gene was used as materials,and manyActinidiachinensisplants via root induction and transplanting in greenhouse were obtained.The PCR and RT-PCR analysis results of transgenic kiwifruit plants indicated that antibacterial peptide D had been integrated in theActinidiachinensisgenome and transcribed.The activity analysis of catalase(CAT),peroxidase(POD),and phenylalanine ammonialyase(PAL) showed that in response to canker bacteria treatment,enzyme activities of CAT and POD in transgenic plants were greatly reduced,and PAL enzyme activity was enhanced compared with the controls.

Actinidiachinensis; antibacterial peptide D; catalase; peroxidase; phenylalanine ammonialyase

2016-01-20

河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系大宗水果產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新團隊項目(S2014-11-G02)；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目(14IRTSTHN011)

韋鵬飛(1988-)，男，河南臨潁人，在讀碩士研究生，研究方向：經(jīng)濟林栽培與生理。E-mail：444192771@qq.com

*通訊作者：馮建燦 (1963-)，男，河南新密人，教授，博士，主要從事經(jīng)濟林栽培與生理研究。E-mail:jcfeng@henau.edu.cn

S663.4

A

1004-3268(2016)05-0130-05