王銳麗,葉兆偉,薛業(yè)敏

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.南京師范大學(xué) 金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

重組酶Xar的表達(dá)純化及性質(zhì)研究

王銳麗1,葉兆偉1,薛業(yè)敏2

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.南京師范大學(xué) 金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

為獲得高效的半纖維素類飼料酶制劑，將含嗜熱厭氧乙醇菌α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶(Xar)基因的重組質(zhì)粒pET-20b-xar導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行高效表達(dá)，將表達(dá)的重組酶進(jìn)行熱處理和Ni2+親和層析純化，并對(duì)純化的重組酶Xar的性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，以對(duì)硝基苯酚-α-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)為底物，重組酶Xar的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別是75～80 ℃和6.0，米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速度(Vmax)分別為2.42 mmol/L、20.7 μmol/(min·mg)；以對(duì)硝基苯酚-β-木糖苷(pNPX)為底物，重組酶Xar的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為93 ℃和5.8～6.2，Km、Vmax值分別為0.60 mmol/L、43.8 μmol/(min·mg)。將重組酶Xar置于80 ℃保溫1 h，木糖苷酶的相對(duì)活性仍為56.4%，在pH值4.2～8.2條件下仍保持較高的穩(wěn)定性。當(dāng)木糖濃度達(dá)到400 mmol/L時(shí)，木糖苷酶的相對(duì)活性仍有97.9%。Mn2+對(duì)重組酶Xar有明顯的激活作用，而Cu2+和Zn2+對(duì)其有明顯的抑制作用?？梢?，重組酶Xar具有良好的熱穩(wěn)定性。

木糖苷酶； 耐熱性； 純化； 酶學(xué)性質(zhì)

我國是農(nóng)業(yè)大國，秸稈和玉米芯等是畜牧業(yè)植物性飼料的主要來源。反芻動(dòng)物由于瘤胃中微生物體系可以分泌功能各異的酶，對(duì)秸稈和玉米芯的利用率可達(dá)到60%～80%，但單胃動(dòng)物對(duì)秸稈和玉米芯的利用率很低[1-2]。在生產(chǎn)中通常將多種半纖維素酶，如β-1,4-木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶等制成復(fù)合酶，作為飼料酶制劑添加到飼料中，以降低飼料中多糖的黏度，促進(jìn)動(dòng)物腸道對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪的消化吸收，提高飼料的利用率，進(jìn)而減少飼料的投放量，降低成本。目前已發(fā)現(xiàn)多種微生物來源的飼用半纖維素酶[3]，相關(guān)研究主要集中在產(chǎn)酶菌株篩選與馴化、酶學(xué)性質(zhì)以及酶的純化等方面[4]，但在飼料業(yè)中仍缺少在高溫和酸性環(huán)境條件下性質(zhì)穩(wěn)定和活性高的酶源[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱厭氧乙醇菌(Thermoanaerobacterethanolicus)是多種極耐熱半纖維素酶類的重要來源，雙功能α-L-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶就是其中的一種[6-8]。本研究將含嗜熱厭氧乙醇菌的α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pET-20b-xar導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，表達(dá)重組酶Xar，同時(shí)對(duì)重組酶Xar的性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)飼料中的添加劑酶提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：嗜熱厭氧乙醇菌(T.ethanolicus)JW200由美國佐治亞大學(xué)微生物系分離，大腸桿菌DH10B 購于普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

試劑：對(duì)硝基苯酚-ɑ-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)和對(duì)硝基苯酚-β-木糖苷(pNPX)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組酶的表達(dá)及純化 將含T.ethanolicusJW200的α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶(Xar)基因的重組質(zhì)粒pET-20b-xar轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)SOC培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，涂布至含氨芐青霉素(Amp)的LB抗性平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑選單菌落接入含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 200 r/min轉(zhuǎn)速37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量接入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí),加終濃度為0.8 mmol/L的 IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，離心收集細(xì)胞。

用 Rapid Affinity Purification試劑盒中的 Bin-ding Buffer懸浮細(xì)胞，高壓破碎，離心20 min，取上清液于80 ℃下熱處理20 min，離心得粗酶液。粗酶液再經(jīng)Ni2+親和層析純化，純化后的酶液采用SDS-PAGE檢測(cè)純度。

1.2.2 酶活性的測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶活性，根據(jù)底物pNPAF/pNPX釋放確定硝基苯酚(pNP)的量[9]。1個(gè)酶活性單位(U)定義：在一定反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmolpNP的酶量。

1.2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 以pNPX和pNAF為底物，測(cè)定重組酶Xar的酶學(xué)性質(zhì)及最適反應(yīng)溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH值及其穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：將重組酶液pH值調(diào)節(jié)為6.2，溫度設(shè)為30～95 ℃間隔5 ℃，反應(yīng)5 min后以pNPAF/pNPX為底物測(cè)定重組酶Xar的活性，以最高酶活性為100%，計(jì)算酶相對(duì)活性。

溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：將重組酶置于最適pH值條件下，在65～95 ℃每隔5 ℃保溫1 h，然后加底物于最適溫度和pH值條件下測(cè)定其活性，以保存于冰浴中(未保溫)的酶活性為100%，制作重組酶溫度穩(wěn)定性曲線。

最適pH值的測(cè)定：將重組酶液置于不同pH值下，在最適溫度下測(cè)定其活性，以最高酶活性為100%，計(jì)算酶相對(duì)活性。

pH值穩(wěn)定性的測(cè)定：將重組酶置于20 μL不同pH值(3.8～8.2)的100 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑(PIB)緩沖液中，于37 ℃下保溫1 h，冷卻后補(bǔ)加相應(yīng)的底物和緩沖液達(dá)到200 μL，再于最適條件測(cè)定其活性，以保存于冰浴中(未保溫)的酶活性為100%，制作重組酶pH值穩(wěn)定性曲線。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：用pH值6.2的PIB緩沖液分別配制不同濃度的pNPX和pNPAF作為底物，分別于最適反應(yīng)條件測(cè)定重組酶的木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性。采用Lineweaver-Burk作圖法，計(jì)算重組酶的米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速度(Vmax)、轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat)和轉(zhuǎn)換效率(Kcat/Km)值。

1.2.4 終產(chǎn)物木糖和阿拉伯糖對(duì)重組酶相對(duì)活性的影響試驗(yàn) 先將緩沖液、酶和木糖(或阿拉伯糖)置于37 ℃作用30 min，再加入底物。反應(yīng)條件如下：適當(dāng)酶液+100 mmol/L PIB緩沖液+木糖(或阿拉伯糖)溶液+底物pNPX或pNPAF(終濃度1 mmol/L)，在最適溫度下反應(yīng)5 min，然后終止反應(yīng)，測(cè)定波長405 nm處的吸光值。以不加終產(chǎn)物時(shí)的酶活性為100%，計(jì)算酶相對(duì)活性。

1.2.5 金屬離子和EDTA對(duì)重組酶相對(duì)活性的影響試驗(yàn) 將酶液與不同金屬離子(終濃度1 mmol/L)或EDTA溶液(終濃度10 mmol/L)混勻后于37 ℃作用30 min，再加底物于最適條件下測(cè)定酶活性。以未加金屬離子和EDTA的酶活性為100%，計(jì)算酶相對(duì)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組酶的表達(dá)及純化

由圖1可以看出，純化后的重組酶Xar條帶在泳道中呈單一均勻分布，大小約為85 ku，與預(yù)期的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量一致。表明成功表達(dá)了重組酶Xar，且純度較高。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker； 1.熱處理后的重組酶Xar； 2.未誘導(dǎo)的pET-20b-xar； 3.純化的重組酶Xar圖1 SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組酶Xar的結(jié)果

2.2 重組酶Xar的酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別以pNPAF和pNPX為底物，測(cè)得重組酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH值、pH值和溫度的穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其結(jié)果見表1和圖2—3。

由表1可以看出，以pNPAF作為底物，測(cè)得重組酶Xar的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為75～80 ℃和6.0。以pNPX作為底物，重組酶Xar的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為93 ℃和5.8～6.2，說明重組酶Xar屬于耐高溫酶。由圖2可知，將重組酶Xar于80 ℃保溫1 h，木糖苷酶相對(duì)活性仍有56.4%，于75 ℃保溫1 h阿拉伯糖苷酶的相對(duì)活性仍為57.6%。說明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。由圖3可知，將重組酶Xar置于100 mmol/L、 pH值為4.2～8.2的緩沖液中，37 ℃保溫1 h，酶的相對(duì)活性能保持在50%以上，說明重組酶Xar具有很高的pH值穩(wěn)定性。在已報(bào)道的β-木糖苷酶中，大部分β-木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為40～60 ℃，只有少數(shù)從嗜熱細(xì)菌和耐熱真菌Thermotogathermarum、Geobacillussp.strain WSUCF1、Scytalidiumthermophilum中分離到的β-木糖苷酶具有較好的熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度[10-12]。可見，重組酶Xar具有較好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，有利于該酶在飼料添加中的使用，以及飼料添加劑的保存和運(yùn)輸。

從表1還可以看出，以pNPAF為底物時(shí)，Km值為2.42 mmol/L，Kcat/Km值為246.7 L/(mmol·s)；以pNPX為底物時(shí)，Km值為0.60 mmol/L，Kcat/Km值為118.3 L/(mmol·s)。重組酶Xar對(duì)底物pNPX的親和性好于底物pNPAF，對(duì)pNPAF的催化效率明顯高于pNPX。

表1 重組酶Xar的部分性質(zhì)比較

圖2 重組酶Xar的熱穩(wěn)定性

圖3 重組酶Xar的pH值穩(wěn)定性

2.3 終產(chǎn)物木糖和阿拉伯糖對(duì)重組酶Xar相對(duì)活性的影響

由表2可知，當(dāng)木糖濃度達(dá)到400 mmol/L時(shí)，重組酶Xar的木糖苷酶的相對(duì)活性仍有97.9%，說明重組酶Xar能耐受木糖，高于Yanai 等[13]發(fā)現(xiàn)的CandidautilisIFO 0639中β-木糖苷酶對(duì)木糖的耐受性(300 mmol/L)。當(dāng)阿拉伯糖濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，木糖苷酶的相對(duì)活性為113.2%，阿拉伯糖酶的相對(duì)活性只有53.0%殘留。在阿拉伯糖濃度達(dá)到700～2 000 mmol/L時(shí)，其對(duì)木糖苷酶活性的激活作用趨于穩(wěn)定。

2.4 金屬離子和EDTA對(duì)重組酶Xar相對(duì)活性的影響

由表3可知， Mn2+對(duì)重組酶Xar的正向影響最大，其木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性高達(dá)232%和147%。作為飼料添加劑，這種正向影響有利于抵制消化系統(tǒng)中胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性[14]。Sr2+對(duì)重組酶Xar的雙活性有一定激活作用，Cu2+和Zn2+能夠明顯抑制Xar的雙活性，Mg2+、Ni2+和EDTA對(duì)重組酶Xar的活性影響較小。

表2 終產(chǎn)物木糖和阿拉伯糖對(duì)重組酶Xar相對(duì)活性的影響

表3 金屬離子和EDTA對(duì)重組酶Xar相對(duì)活性的影響

3 結(jié)論與討論

飼用半纖維素酶在飼料添加劑中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)之一，但飼用纖維素酶在應(yīng)用中仍存在產(chǎn)量低、易失活和成本高等問題[15-20]。為獲得高效的半纖維素類飼料酶制劑，本研究成功表達(dá)重組酶Xar，并對(duì)純化的重組酶Xar的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，重組酶Xar表現(xiàn)出木糖苷酶活性和阿拉伯糖酶活性，即為雙功能性酶。具有2種活性的酶在降解半纖維素飼料方面本身就是一種優(yōu)勢(shì)，可以與其他飼用酶協(xié)同作用而降解大部分植物性飼料，簡化制料工藝和節(jié)約成本。以pNPAF為底物，重組酶Xar的最適溫度和最適pH值分別是75～80 ℃和6.0，Km與Vmax值分別為2.42 mmol/L和20.7 μmol/(min·mg)。以pNPX為底物，重組酶Xar的最適溫度和最適pH值分別為93 ℃和5.8～6.2，Km與Vmax值分別為0.60 mmol/L和43.8 μmol/(min·mg)。將重組酶Xar于80 ℃保溫1 h木糖苷酶的相對(duì)活性仍有56.4%，在pH值為 4.2～8.2時(shí)仍保持較高的穩(wěn)定性。酶的耐熱性會(huì)直接影響其飼用效果，因?yàn)轱暳现屏＿^程中酶要經(jīng)過80 ℃、30 s的熱處理?；谥亟M酶Xar良好的耐熱性及pH值穩(wěn)定性等優(yōu)良性質(zhì)，其在飼料行業(yè)具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Production and Characterization of a Recombinase Xar

WANG Ruili1,YE Zhaowei1,XUE Yemin2

(1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China; 2.Jinling College,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)

To obtain an efficient hemicellulose feed enzyme preparation,the thermostable bifunctional α-arabinosidase/xylosidase(Xar) fromThermoanaerobacterethanolicuswas over-expressed inEscherichiacoliDH10B.The expressed Xar was purified by heat treatment and immobilized metal affinity chromatography.pNP-β-D-arabinofuranoside(pNPAF)as substrate,the maximum activity was found at 75—80 ℃ and pH 6.0,KmandVmaxof Xar was 2.42 mmol/L and 20.7 μmol/(min·mg),respectively.WhilepNP-α-D-xylopyranoside(pNPX) as substrate,the maximum activity was found at 93 ℃ and pH 5.8—6.2,KmandVmaxof Xar was 0.60 mmol/L and 43.8 μmol/(min·mg),showed better specificity forpNPX.Xar was found to be stabile which kept 56.4% activity of 1 h at 80 ℃ and it was stable over a range of pH 4.2—8.2.When the xylose concentration reached 400 mmol/L,the residual activity of xylosidase was still 97.9%.Mn2+activated the enzyme,Cu2+and Zn2+showed various degrees of inhibitory effect on the enzymes.The recombinant enzyme Xar had good thermal stability.

xylosidase; thermostablity; purification; enzymatic properties

2015-08-06

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102110047)

王銳麗(1985-)，女，河南信陽人，講師，碩士，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail:wrl0376@163.com

S816.7

A

1004-3268(2016)05-0140-05