王婷婷　何愛(ài)娟　劉豫　曹誼林　唐勝建　周廣東

·論著·

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增體系研究

王婷婷何愛(ài)娟劉豫曹誼林唐勝建周廣東

【摘要】目的比較三種不同培養(yǎng)體系對(duì)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）增殖能力、表面標(biāo)志和分化潛能的影響，探索hBMSCs適合的培養(yǎng)體系。方法獲取hBMSCs，分別用DMEM、DMEM+堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和無(wú)動(dòng)物組份的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free，MSCM-acf）進(jìn)行培養(yǎng)，反復(fù)傳代至第6代，分別計(jì)數(shù)每種培養(yǎng)體系每個(gè)代次的細(xì)胞得率。取第4～6代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)各組第6代細(xì)胞分別向成軟骨、成脂和成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化。結(jié)果培養(yǎng)至第2代后，MSCM-acf培養(yǎng)體系細(xì)胞得率顯著大于其他兩組；流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，MSCM-acf培養(yǎng)體系表面陽(yáng)性標(biāo)志CD73、CD90和CD105均大于99%，總的陰性標(biāo)志表達(dá)小于2%，優(yōu)于其他兩組，尤其是DMEM+bFGF培養(yǎng)體系；三組均保留了多向分化潛能，添加bFGF的培養(yǎng)體系成軟骨分化明顯優(yōu)于其他兩組，MSCM-acf培養(yǎng)體系成脂和成骨分化優(yōu)于其他兩組。結(jié)論MSCM-acf培養(yǎng)體系可以實(shí)現(xiàn)hBMSCs干性維持下的大量擴(kuò)增，是hBMSCs較為理想的培養(yǎng)體系。

【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系細(xì)胞表面標(biāo)志分化潛能

人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）取材創(chuàng)傷小，可以進(jìn)行體外擴(kuò)增，不易變異，且具有多向分化潛能，抗原性小，修復(fù)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程非常有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[1]。但是，hBMSCs體外大量擴(kuò)增易發(fā)生老化及自發(fā)分化[2]，其干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物受不同培養(yǎng)體系的影響也會(huì)發(fā)生很大變化，進(jìn)而影響其干性及多向分化潛能[3-4]。因此，實(shí)現(xiàn)干性維持前提下的大量擴(kuò)增，是hBMSCs研究及臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題[5]。

目前，已報(bào)道的不同培養(yǎng)體系對(duì)hBMSCs擴(kuò)增培養(yǎng)和分化潛能有很大影響[6]。常用的hBMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增體系主要是基于DMEM添加胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)體系，受胎牛血清復(fù)雜成分的影響[7]，易出現(xiàn)自發(fā)分化，喪失干性及多向分化潛能，且多次傳代擴(kuò)增后增殖能力顯著下降。此外，由于胎牛血清中異種蛋白的存在，使其在臨床應(yīng)用中存在局限性[8]。研究證實(shí)，在培養(yǎng)體系中添加bFGF可實(shí)現(xiàn)hBMSCs大量擴(kuò)增，并保留其一定的干性及多向分化潛能。但也有研究表明，bFGF對(duì)hBMSCs干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志有顯著影響，如顯著降低CD90和CD105的表達(dá)[4]，而且含bFGF的培養(yǎng)體系仍有胎牛血清成分。

無(wú)血清培養(yǎng)體系組成明確，不含胎牛血清成分，無(wú)異種蛋白影響，培養(yǎng)體系不同批次成分穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清培養(yǎng)體系MSCM-acf可促進(jìn)hBMSCs的大量擴(kuò)增，但對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)志和分化潛能的影響尚無(wú)系統(tǒng)的研究。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討MSCM-acf無(wú)血清培養(yǎng)體系在細(xì)胞得率、表面標(biāo)志的表達(dá)水平和分化潛能方面是否具有明顯優(yōu)勢(shì)。

1　材料和方法

1.1臨床資料、試劑與儀器

骨髓取自上海第六人民醫(yī)院行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者，共9例，每例5 mL?；颊咂骄挲g（50±5）歲。所有患者對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

DMEM，0.25%胰酶（Gibco公司，美國(guó)）；胎牛血清，磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國(guó)）；bFGF，Human MSC Analysis Kit，流式細(xì)胞儀（B&D公司，美國(guó)）MSCM-acf（ScienCell，美國(guó)）；油紅O染液、甲苯胺藍(lán)染液、茜素紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組1：DMEM培養(yǎng)體系 （含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL）；對(duì)照組2：DMEM+ bFGF培養(yǎng)體系（含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL，bFGF 5 ng/mL）；實(shí)驗(yàn)組：MSCM-acf培養(yǎng)體系。

1.2.2hBMSCs培養(yǎng)

標(biāo)本離心管中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液40 mL，混勻制成細(xì)胞懸液，1 900 r/min離心8 min，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，振蕩，細(xì)胞重懸，接種于100 mm培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，5 d后首次換液，待細(xì)胞80%融合時(shí)，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)，分別用三種培養(yǎng)液重懸，按0.5×106個(gè)有核細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿。2～3 d可達(dá)到80% ～90%的融合度，再次傳代培養(yǎng)。每次傳代時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并計(jì)數(shù)細(xì)胞得率。

1.2.3流式細(xì)胞檢測(cè)hBMSCs表面標(biāo)志

分別取三個(gè)培養(yǎng)體系的第4～6代hBMSCs，0.25%胰酶消化，離心，用緩沖液重懸，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106cells/mL，按照Human MSC Analysis Kit說(shuō)明，取100 μL細(xì)胞懸液分別與CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、CD11b和HLA-DR單克隆抗體室溫避光孵育30 min，緩沖液洗滌3遍，每種樣品重懸成300 μL，待上機(jī)。

1.2.4hBMSCs的誘導(dǎo)分化

分別取三個(gè)培養(yǎng)體系的第6代細(xì)胞，向成軟骨、成脂和成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化。3周后分別用甲苯胺藍(lán)、油紅O和茜素紅染色。

2　結(jié)果

2.1三組培養(yǎng)體系中hBMSCs的形態(tài)變化

光鏡下觀察到對(duì)照組1細(xì)胞生長(zhǎng)較為緩慢、稀疏，細(xì)胞胞體較大，凸起較為明顯；對(duì)照組2的細(xì)胞低代次胞體較小，隨代次增加呈長(zhǎng)梭型改變，邊緣較銳利；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞比對(duì)照組1的低代次細(xì)胞體積更小，成多角形，而且隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞凸起增多，凸起較短。表明MSCM-acf培養(yǎng)體系能更好地維持hBMSCs的細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

2.2hBMSCs細(xì)胞得率

本實(shí)驗(yàn)中hBMSCs的擴(kuò)增基數(shù)均為0.5×106個(gè)有核細(xì)胞，各組前兩代細(xì)胞擴(kuò)增無(wú)明顯差異。第3～6代中，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組2細(xì)胞得率均高于對(duì)照組1。第6代時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞得率平均達(dá)到230×106個(gè)，遠(yuǎn)高于對(duì)照組2（110×106個(gè)）。表明MSCM-acf培養(yǎng)體系在保持細(xì)胞良好形態(tài)的同時(shí)，顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖2）。

2.3hBMSCs表面標(biāo)志檢測(cè)

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組hBMSCs表面陽(yáng)性標(biāo)記物CD90、CD73和CD105的表達(dá)程度均>99%，CD45、CD11b和HLA-DR等陰性標(biāo)志物的表達(dá)總數(shù)<2%，明顯優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組2陽(yáng)性標(biāo)記物CD90 和CD105的表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)組1，兩組CD73的表達(dá)沒(méi)有差別；而陰性標(biāo)志物的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組2遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組1，且兩組均>2%。表明MSCM-acf培養(yǎng)體系能更好地維持hBMSCs的干性（圖3-4）。

2.4hBMSCs的誘導(dǎo)分化

2.4.1成軟骨分化

hBMSCs成軟骨分化3周后，甲苯胺藍(lán)染色顯示三組細(xì)胞核均藍(lán)染，對(duì)照組2染色偏深。表明三組培養(yǎng)體系均保留成軟骨分化潛能，對(duì)照組2成軟骨能力比其他兩組強(qiáng)（圖5）。

2.4.2成脂分化

hBMSCs成脂誘導(dǎo)3周后，三組細(xì)胞逐漸由長(zhǎng)梭形變成多邊形、橢圓形等脂肪樣細(xì)胞形態(tài)，停止生長(zhǎng)，細(xì)胞中均出現(xiàn)脂肪顆粒，油紅O染色顯示三組均呈現(xiàn)橘紅色脂滴。對(duì)照組1、2間無(wú)明顯差異，但脂滴較小，數(shù)目較少。單個(gè)細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組脂滴顆粒比對(duì)照組多，且體積明顯增大。表明MSCM-acf培養(yǎng)體系能更好地促進(jìn)成脂分化（圖5）。

2.4.3成骨分化

成骨誘導(dǎo)3周后，三組細(xì)胞均聚集成團(tuán)，有結(jié)晶樣物質(zhì)出現(xiàn)，茜素紅染色均呈現(xiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)。實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)，對(duì)照組1、2鈣結(jié)節(jié)不明顯。表明MSCM-acf培養(yǎng)體系可更好地促進(jìn)成骨分化（圖5）。

圖1　hBMSCs在三種培養(yǎng)體系連續(xù)傳代培養(yǎng)下的形態(tài)觀察（40×）Fig.1　Morphological observation of hBMSCs under successively passaged culture in three expansion systems(40×)

圖2　hBMSCs在三組培養(yǎng)體系中的細(xì)胞得率Fig.2 Cell yield of hBMSCs in three expansion systems

圖3　第4～6代hBMSCs在三組培養(yǎng)體系中的CD90、CD105、CD73和所有陰性標(biāo)志的表達(dá)百分比Fig.3　The percentage of fluorescence of CD90,CD105,CD73 and all the negative cocktails of P4-P6 hBMSCs in three expansion systems

圖4MSCM-acf培養(yǎng)體系中第6代hBMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig.4　The cell surface marker expression profile of P6 hBMSCs with expansion system of MSCM-acf

圖5　三種培養(yǎng)體系中第6代hBMSCs分別誘導(dǎo)成軟骨、成脂和成骨分化（100×）Fig.5　Chondrogenic differentiation,adipogenic differentiation and osteogenic differentiation of P6 hBMSCs in three expansion culture conditions(100×)

3　討論

hBMSCs是組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一[9-10]。如何在維持干性的前提下大量擴(kuò)增，是制約其發(fā)展與應(yīng)用的重要問(wèn)題[11-13]。研究表明，MSCM-acf培養(yǎng)體系能有效地實(shí)現(xiàn)hBMSCs大量擴(kuò)增，擴(kuò)增細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志，且保留了良好的軟骨、脂肪、骨多向分化潛能，細(xì)胞得率和干性維持顯著，優(yōu)于傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)體系及基于bFGF的擴(kuò)增體系。提示MSCM-acf是一種具有臨床應(yīng)用前景的hBMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增體系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MSCM-acf培養(yǎng)體系中，第2代后的細(xì)胞得率均大于傳統(tǒng)含血清的DMEM培養(yǎng)體系和基于bFGF的擴(kuò)增體系。第1、2代三個(gè)培養(yǎng)體系的細(xì)胞得率無(wú)明顯差異，可能是低代次的細(xì)胞干性較好，受培養(yǎng)體系的影響小。自第2代起，細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)體系中的增殖明顯高于其他兩組，第6代細(xì)胞得率平均達(dá)到230×106個(gè)，且傳代后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。可能是在這種培養(yǎng)體系中，添加了類似血清替代品或bFGF等促細(xì)胞增殖的一系列因子，無(wú)異源蛋白成分，加之這種培養(yǎng)液成分固定，可以穩(wěn)定維持細(xì)胞的干性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，不同批號(hào)甚至同一批號(hào)不同批次的血清成分不穩(wěn)定，使得DMEM培養(yǎng)體系易受血清的影響，而發(fā)生老化和自發(fā)分化，從而減弱細(xì)胞的增殖能力。DMEM+bFGF培養(yǎng)體系雖然添加了bFGF，可刺激細(xì)胞增殖，但成分單一，無(wú)法滿足細(xì)胞大量擴(kuò)增需要。

hBMSCs干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志的表達(dá)是反應(yīng)干性的重要指標(biāo)，表達(dá)水平對(duì)于細(xì)胞維持多向分化潛能有很大影響[3-4]。影響細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)的因素是多方面的，其中血清是一個(gè)很重要的影響因素，因其成分復(fù)雜，不可控，不能穩(wěn)定維持細(xì)胞的干性，進(jìn)而影響細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的無(wú)血清培養(yǎng)體系MSCM-acf可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)志穩(wěn)定均一表達(dá)，陽(yáng)性標(biāo)志CD90、CD105和CD73表達(dá)均達(dá)到99%以上，所有陰性指標(biāo)的表達(dá)總數(shù)<2%，并且代次間無(wú)明顯變化。該結(jié)果符合MSCs定義的最低標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b和HLA-DR[9，14]。而DMEM培養(yǎng)體系達(dá)不到上述標(biāo)準(zhǔn)，尤其是添加 bFGF后，CD90和CD105的表達(dá)明顯下調(diào)，陰性標(biāo)志的表達(dá)總數(shù)平均達(dá)到40%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

hBMSCs多向分化潛能是反應(yīng)其干性的另一重要指標(biāo)。在MSCM-acf培養(yǎng)體系中，成脂分化，脂滴的數(shù)目更多，體積更大；成骨分化，鈣結(jié)節(jié)更多；成脂和成骨分化優(yōu)于含血清的DMEM培養(yǎng)體系。DMEM+bFGF培養(yǎng)體系成軟骨分化較為明顯，這一結(jié)果同樣與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]；DMEM培養(yǎng)體系中，由于細(xì)胞干性的逐步喪失，因此失去了良好的分化潛能。這一結(jié)果表明，細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)體系中可以更好地維持細(xì)胞的干性，進(jìn)而穩(wěn)定維持其分化潛能。

綜上所述，無(wú)血清培養(yǎng)體系MSCM-acf能長(zhǎng)期維持hBMSCs的干性并大量快速擴(kuò)增，同時(shí)使細(xì)胞表面標(biāo)志高度均一表達(dá)，解決了細(xì)胞表面標(biāo)志不穩(wěn)定表達(dá)的難題，也充分維持了細(xì)胞多向分化的潛能。因此，MSCM-acf是hBMSCs較為理想的培養(yǎng)體系。

參考文獻(xiàn)

[1]Le Black K,Rasmusson I,Sundberg B,et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third partyhaploidential mesenchymal stem cells[J].Lancent,2004,363(6):1439-1441.

[2]Maurer MH.Proteomic definitions of mesenchymal stemcells[J]. Stem Cells Int,2011,2011:704256.

[3]Hagmann S,Moradi B,Frank S,et al.FGF-2 addition during expansion of human bone marrow-derived stromal cells alters MSC surface marker distribution and chondrogenic differentiation potential[J].Cell Prolif,2013,46(4):396-407.

[4]滕勇,徐建麗,李旭升,等.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)與鑒定[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(10):1742-1747.

[5]Bara JJ,Richards RG,Alini M,et al.Concise review:Bone marrowderived mesenchymal stem cells change phenotype following in vitro culture:implications for basic research and the clinic[J]. Stem Cell,2014,32(7):1713-1723.

[6]Hagmann S,Moradi B,Frank S,et al.Different culture media

affect grow th characteristics,surface marker distribution and chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J].BMC Musculoskelet Disord,2013, 14:223.

[7]Sotiropoulou PA,Perez SA,Salagianni M,et al.Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,24(2):462-471.

[8]Jung S,Panchalingam KM,Rosenberg L,et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells in defined serum-free media [J].Stem Cells Int,2012,2012:123030.

[9]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006,8(4):315-317.

[10]Ankrum J,Karp JM.Mesenchymal stem cell therapy:Two steps forward,one step back[J].Trends Mol Med,2010,16(5):203-209.

[11]Li G,Chan CY,Wang H,et al.Proteomic analysis of human mesenchymal stem cells[J].Methods Mol Biol,2011,698:443-457.

[12]Gharibi B,Hughes FJ.Effects of medium supplements on proliferation,differentiation potential,and in vitro expansion of mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Transl Med,2012,1(11): 771-782.

[13]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284 (5411):143-147.

[14]Lv FJ,Tuan RS,Cheung KM,et al.Concise review:the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells[J].Stem cells,2014,32(6):1408-1419.

·論著·

【中圖分類號(hào)】Q813.1+1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）03－0152－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.002

作者單位：261042山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科研究所（王婷婷，唐勝建，周廣東）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王婷婷，何愛(ài)娟，劉豫，曹誼林，周廣東）；200241上海市組織工程國(guó)家工程研究中心（王婷婷，何愛(ài)娟，劉豫，曹誼林，周廣東）。

通訊作者：周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。

收稿日期：（2016年2月26日；修回日期：2016年4月19日）

Research on the Amplification System of Bone Marrow Stromal Stem Cells

WANG Tingting1,2,3,HE Aijuan2,3,LIU Yu2,3,CAO Yilin2,3,TANG Shengjian1,ZHOU Guangdong1,2,3.1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College, Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail: guangdongzhou@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo compare the effects of three different culture systems on the proliferation ability,surface marker and differentiation potential of bone marrow stromal stem cells(hBMSCs),and to explore a suitable expansion system for hBMSCs.MethodshBMSCs were obtained and cultured respectively in three culture systems:DMEM,DMEM+basic fibroblast growth factor(bFGF)and Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free(MSCM-acf),to the sixth generation of repeated passages.The cell yield of each culture system for each rate was counted.Cell surface markers of P4-P6 were detected using flow cytometry.At the same time,hBMSCs of P6 in each culture system were induced for chondrogenic differentiation,osteogenic differentiation and adipogenic differentiation.ResultsThe cell yield in MSCM-acf group was far greater than that of the other two groups;The positive indicators of hBMSCs were detected by flow cytometry, in MSCM-acf group,CD73,CD90 and CD105 were all greater than 99%,the sum of negative cocktails was lower than 2%, which showed better results compared with the other two groups,especially DMEM+bFGF group.All of the three groups had the potential of differentiation.Cartilage differentiation in DMEM+bFGF was better.Adipogenic differentiation and osteogenic differentiation in MSCM-acf group were better than the other two expansion systems.ConclusionMSCM-acf expansion system can achieve a large number of hBMSCs amplification,and maintain the activity of cells.Therefore,MSCM-acf can be considered as an ideal hBMSCs expansion system.

【Key words】Bone marrow stromal stem cells;Expansion system;Surface marker;Differentiative potential