張策　沈映勛　曹德君

·論著·

SD大鼠顱縫細(xì)胞不同時(shí)期GPC3基因表達(dá)變化的研究

張策沈映勛曹德君

【摘要】目的探索GPC3基因在顱縫組織和細(xì)胞中不同時(shí)期的表達(dá)情況，為后續(xù)的疾病模型研究提供參照。方法研究并觀察1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫細(xì)胞組織，應(yīng)用組織切片免疫熒光染色、RT-qPCR、Western Blot等方法，檢測(cè)其在不同年齡SD大鼠中的表達(dá)水平，判斷其與顱骨成骨及顱縫閉合的關(guān)系。結(jié)果免疫熒光顯示，GPC3在大鼠未閉合顱縫組織不同階段胞內(nèi)、細(xì)胞表面及胞外均有表達(dá)；RT-qPCR、Western Blotting結(jié)果顯示，GPC3基因表達(dá)隨著大鼠年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。結(jié)論SD大鼠中，GPC3與顱縫閉合密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】顱縫細(xì)胞SD大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

約1/2 500的新生嬰幼兒中會(huì)出現(xiàn)一條或者多條顱縫提早閉合的現(xiàn)象，稱為顱縫早閉癥[1]，其發(fā)病率僅次于唇腭裂畸形。因?yàn)轱B縫提前發(fā)生骨性閉合，會(huì)產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)，如顱腔狹小、顱面骨畸形、顱內(nèi)壓增高等，以及一些復(fù)雜的顱頜面畸形綜合征，如Crounzon綜合征、Apert綜合征等。嚴(yán)重者可引起腦發(fā)育受阻及智力發(fā)育障礙，嚴(yán)重影響患兒的正常發(fā)育、生理功能，甚至危及生命。目前，針對(duì)顱縫早閉癥的治療僅有手術(shù)一種方法，但風(fēng)險(xiǎn)高、費(fèi)用高，且效果不理想。因此，亟需開展顱縫發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)制與機(jī)理的研究，為探尋更好的治療方法奠定基礎(chǔ)。

顱縫早閉癥是一類由相關(guān)基因突變導(dǎo)致的疾病，其中約有20%已經(jīng)確認(rèn)了相關(guān)發(fā)病基因：FGFR2突變 （Apert、Crouzon和Pfeiffer綜合征），F(xiàn)GFR3突變 （Muenke綜合征），MSX2（Boston型綜合征），TWIST1（Saethre-Chotzen綜合征）等。Coussens等[2]發(fā)現(xiàn)，除 FGFR1～3等，還包括一系列與顱骨發(fā)育、顱縫閉合（成骨分化、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨塑形、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡）相關(guān)的新基因。研究表明，受累顱縫與正常顱縫相比，視黃醇結(jié)合蛋白-4（RBP4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、C1Q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白-3（C1QTNF3）均表達(dá)下調(diào)，其中GPC3下調(diào)7倍，提示GPC3基因在顱骨發(fā)育、顱縫閉合中可能存在調(diào)控作用。

GPC3，為蛋白聚糖（PGs）家族成員之一。蛋白聚糖作為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一，是一種大分子物質(zhì)，可以結(jié)構(gòu)性及功能性調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及基因表達(dá)。PGs由核心蛋白及一個(gè)或者多個(gè)葡糖氨基葡聚糖側(cè)鏈組成，可以分為硫酸肝素PGs（HSPGs）、硫酸皮膚素或軟骨素PGs（CSPGs）及硫酸角蛋白PGs。其中CSPGs大部分定位在細(xì)胞外基質(zhì)中，而HSPGs常為膜性蛋白聚糖。HSPGs可以和許多配體發(fā)生直接作用，包括一些生長(zhǎng)因子和成形素，如Wnts、BMPs、VEGFs等，以及相應(yīng)的受體。HSPGs還可與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)及黏附性分子，如膠原蛋白、纖維蛋白及層黏連蛋白等發(fā)生作用。GPCs還可通過成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶剪切位點(diǎn)的剪切，或GPI錨定作用的去除，進(jìn)入到細(xì)胞外基質(zhì)中，并發(fā)揮作用。GPC3就是一種膜性硫酸肝素蛋白聚糖，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素鏈 （HS）和糖基化磷脂酰肌醇（GPI），GPC蛋白通過GPI錨定于細(xì)胞外膜上。GPC3在哺乳動(dòng)物的胚胎期，可通過影響多個(gè)信號(hào)通路而對(duì)組織器官的發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)揮重要調(diào)控作用，目前的研究主要集中在基因與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性[3]。

為明確GPC3在顱骨發(fā)育調(diào)控中的作用，以及突變后發(fā)生顱縫早閉癥的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為模型，研究GPC3基因在顱縫組織和細(xì)胞中不同時(shí)期的表達(dá)情況，為后續(xù)的疾病模型研究提供參照。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，低糖DMEM （Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（Biowest，法國(guó)），Ⅳ型膠原蛋白酶（SERVA，德國(guó)），胰蛋白酶-EDTA、Trizol液（Invitrogen，美國(guó)），M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑（Promega，美國(guó)），大鼠 GPC3抗體（abcam，英國(guó)），EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)液（武漢谷歌生物公司），氯仿，異丙醇等。

1.2主要儀器及設(shè)備

倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀（Eppendorf，德國(guó)），高速離心機(jī) （Eppendorf，德國(guó)），凝膠成像分析儀（Syngene，英國(guó)），倒置熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE TISR，日本），成像系統(tǒng)（NIKON DS-U，日本）。

1.3方法

1.3.1免疫熒光

分別取出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，無菌條件下切取顱蓋骨，剝離硬腦膜，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后，加入4%多聚甲醛固定，脫水、透蠟、包埋、切片、脫蠟，制作石蠟切片。切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。切片稍甩干后用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后，滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干后用抗熒光淬滅，封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2原代細(xì)胞獲取及培養(yǎng)

以上述相同方法，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后剪碎，放入約10倍體積的0.2%Ⅳ型膠原蛋白酶中，37℃，5 h；100目濾網(wǎng)過濾，獲得細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心3 min，棄上清液。10 mL完全培養(yǎng)液（DMEM+10FBS+ 1%雙抗）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，1周后胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2傳代接種。

1.3.3RT-qPCR

取傳種后第1代細(xì)胞，使用Trizol裂解，實(shí)驗(yàn)操作參照Invitrogen Trizol使用說明，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA模板，使用qPCR法定量分析，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次（表1）。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequence

1.3.4Western-Blot

取部分原代細(xì)胞1 500 r/min離心后去上清液，加入細(xì)胞裂解液，4℃、12 000 g離心3 min，留取上清液后用Lowry法定量蛋白，完成電泳后，依次加入封閉液、抗rat GPC3抗體、二抗稀釋液，然后用化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)后顯影定影。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism6軟件行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GPC3在不同年齡SD大鼠顱縫組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，在1 d、3 d、7 d的顱縫組織中，胞內(nèi)、

細(xì)胞表面及胞外均有GPC3表達(dá)，GPC3熒光的表達(dá)強(qiáng)度隨著大鼠年齡的增加逐步減弱（圖1）。2.2GPC3基因表達(dá)程度隨SD大鼠年齡的變化

圖1　不同年齡SD大鼠中GPC3的免疫熒光檢測(cè)（40×）Fig.1　Immunofluorescence of GPC3 in SD rat of different age (40×)

RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，顱縫組織細(xì)胞中GPC3基因的表達(dá)水平明顯降低，其中1 d的SD大鼠顱縫細(xì)胞的GPC3基因表達(dá)量與3 d的SD大鼠細(xì)胞存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P<0.05），3 d與7 d的SD大鼠細(xì)胞存在明顯差異（P<0.01）（圖2）。

圖2　RT-qPCR檢測(cè)不同年齡SD大鼠顱縫細(xì)胞GPC3的相對(duì)基因表達(dá)量Fig.2　The relative mRNA amount of GPC3 in SD rat of different age detected by RT-qPCR

Western Blot結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，GPC3在顱縫細(xì)胞中的表達(dá)量逐漸降低，其中3 d與7 d的SD大鼠的顱縫細(xì)胞存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），但1 d與3 d的SD大鼠的顱縫細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

圖3　Western Blot檢測(cè)不同年齡SD大鼠GPC3的表達(dá)Fig.3　The expression of GPC3 in SD rat of different age detected by Western Blot

3　討論

本研究中，我們首先應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來確定GPC3基因在大鼠顱縫組織中的表達(dá)位置。通過熒光圖像發(fā)現(xiàn)，GPC3基因在1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫組織中均有表達(dá)，且在胞內(nèi)、細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中均檢測(cè)到GPC3，說明GPC3的生理作用可能不僅限于錨定在細(xì)胞表面，解錨定后，GPC3進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中可能也會(huì)發(fā)揮相應(yīng)的作用，具體機(jī)制仍有待探索。

我們應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，來確定GPC3隨著SD大鼠年齡增加的表達(dá)情況。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增加，GPC3基因的表達(dá)量明顯下降，且第3天到第7天的下降程度明顯較第1天到第3天的程度大，這與SD大鼠的顱縫閉合趨勢(shì)是相符合的。Western Blot的結(jié)果也從蛋白水平上基本驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。因此，我們判斷，GPC3基因的表達(dá)與顱縫閉合存在非常緊密的聯(lián)系，該基因在顱縫成骨的過程中可能扮演了非常重要的角色。

GPCs（磷脂酰肌醇蛋白聚糖類）為HSPGs家族成員之一，是一種生長(zhǎng)因子通路的調(diào)節(jié)因子，一般通過糖基化磷酯酰肌醇錨定于細(xì)胞膜。解開錨定，脫離細(xì)胞膜后，即成為游離態(tài)的GPCs，同樣也會(huì)產(chǎn)生一定的生理功能。其在細(xì)胞的主要信號(hào)通路，如BMP信號(hào)通路、FGF信號(hào)通路、HH信號(hào)通路以及WNT信號(hào)通路中，都有其特定的效應(yīng)。因此，該類蛋白在生長(zhǎng)發(fā)育和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中均有重要的作用[4]。

Pilla等[5]報(bào)道了GPC3基因突變所導(dǎo)致的X連鎖遺傳?。哼^度生長(zhǎng)和畸變綜合征（SGBS）。Cano-Gauci等[6]發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠GPC3基因的第一個(gè)外顯子后，其體內(nèi)無法檢測(cè)到GPC3基因的mRNA的表達(dá)，并出現(xiàn)典型的SGBS的臨床表現(xiàn)，包括圍產(chǎn)期死亡、過度生長(zhǎng)發(fā)育、多囊腎、腎發(fā)育不全及肺部異常發(fā)育等。

GPC3在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有著重要的作用，目前的研究對(duì)于其與BMP信號(hào)通路的關(guān)系研究比較明確。骨形成蛋白（BMPs）是促進(jìn)骨形成的重要蛋白。BMPs信號(hào)通道中的效應(yīng)器轉(zhuǎn)錄因子MSX2，發(fā)生基因突變可導(dǎo)致Boston-type顱縫早閉。兔動(dòng)物模型研究顯示，高濃度的BMP2可導(dǎo)致顱縫過早閉合[7]。因此，BMPs及其信號(hào)通道是明確顱縫早閉發(fā)病機(jī)制的重要研究方向之一。文獻(xiàn)提示，GPC3參與調(diào)節(jié)骨形成蛋白（BMPs）及其信號(hào)通道。Dwivedi等[8]發(fā)現(xiàn)，GPC3在顱縫區(qū)表達(dá)，而在顱縫過早閉合的患兒顱縫區(qū)表達(dá)是下降的。此外，GPC1和GPC3同時(shí)表達(dá)于顱縫細(xì)胞表面并釋放入細(xì)胞外基質(zhì)。同時(shí)表達(dá)的GPC1與GPC3可抑制BMP2、BMP4和BMP7的活性，消除GPC1和GPC3活性可增強(qiáng)BMP2活性。相反，使GPC1和GPC3過表達(dá)或者在培養(yǎng)體系中添加GPC1或GPC3，可阻止BMP2信號(hào)通道及BMP2調(diào)節(jié)的成骨分化。該結(jié)果表明，GPC3對(duì)BMPs信號(hào)通道具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。而Dejima等[9]的研究則表明，GPCs對(duì)BMPs信號(hào)通道具有正向調(diào)節(jié)作用。無論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均顯示，果蠅的GPCs可增強(qiáng)BMPs信號(hào)通道。這兩種矛盾的結(jié)果可能是由于物種的不同所導(dǎo)致的，但都表明了GPCs參與BMPs信號(hào)通道的調(diào)節(jié)。另外，通過對(duì)GPC3基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，GPC3與BMP4在骨發(fā)育中具有相互作用[10]，與BMP2、BMP7在腎形態(tài)發(fā)育中具有相互作用類似[11-12]。關(guān)于GPC3在FGF、WNT信號(hào)通路中的作用，目前僅有少量研究。Midorikawa等[13]發(fā)現(xiàn)，GPC3在肝癌細(xì)胞中，與FGF2相互作用，并抑制FGF信號(hào)通路；Lai等[14]發(fā)現(xiàn)，GPC3在肝癌細(xì)胞中增強(qiáng)經(jīng)典WNT信號(hào)通路并促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，對(duì)于小鼠乳腺腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，GPC3抑制經(jīng)典WNT信號(hào)通路，增強(qiáng)非經(jīng)典WNT信號(hào)通路[15]。因此，GPC3在FGF信號(hào)通路和WNT信號(hào)通路中的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的探索研究。

本實(shí)驗(yàn)初步闡明了GPC3基因在SD大鼠顱縫發(fā)育過程中的表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)合Coussens等的研究結(jié)果，我們推斷，GPC3的低表達(dá)可能與顱縫早閉的發(fā)生與發(fā)展存在密切的聯(lián)系，對(duì)于其在顱縫早閉癥中的具體作用與機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

參考文獻(xiàn)

[1]Wilkie AOM.Craniosynostosis:genes and mechanisms[J].Hum Mol Genet,1997,10(6):1647-1656.

[2]Coussens AK,Wilkinson CR,Hughes IP,et al.Unravelling the molecular control of calvarial suture fusion in children with craniosynostosis[J].BMC Genomics,2007,8:458.

[3]Song HH,Shi W,Xiang YY,et al.The loss of glypican-3 induces alterations in Wnt signaling[J].J Biol Chem.2005,280(3): 2116-2125.

[4]Svensson G,Awad W,Hakansson M,et al.Crystal structure of N-glycosylated human glypican-1 core protein:structure of two loops evolutionarily conserved in vertebrate glypican-1[J].J Biol Chem,2012,287(17):14040-14051.

[5]Pilia G,Hughes-Benzie RM,Mackenzie A,et al.Mutations in GPC3,a glypican gene,cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J].Nat Genet,1996,12(3):241-247.

[6]Cano-Gauci DF,Song HH,Yang H,et al.Glypican-3-deficient miceexhibitdevelopmentalovergrowthandsomeofthe abnormalities typical of Simpson-Golabi-Behmel syndrome[J].J Cell Biol,1999,146(1):255-264.

[7]Kinsella CJ,Cray JJ,Durham EL,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2-induced craniosynostosis and growth restriction in the immature skeleton[J].Plast Reconstr Surg,2011,127(3):1173-1181.

[8]Dwivedi PP,Grose RH,Filmus J,et al.Regulation of bone morphogenetic protein signalling and cranial osteogenesis by Gpc1 and GPC3[J].Bone,2013,55(2):367-376.

[9]Dejima K,Kanai MI,Akiyama T,et al.Novel contact-dependent bonemorphogeneticprotein(BMP)signalingmediatedby heparan sulfate proteoglycans[J].J Biol Chem,2011,286(19): 17103-17111.

[10]Paine-Saunders S,Viviano BL,Zupicich J,et al.Glypican-3 controls cellular responses to Bmp4 in limb patterning and skeletal development[J].Dev Biol,2000,225(1):179-187.

[11]Grisaru S,Cano-Gauci D,Tee J,et al.Glypican-3 modulates BMP-and FGF-mediated effects during renal branching morphogenesis[J].Dev Biol,2001,231(1):31-46.

[12]Hartwig S,Hu MC,Cella C,et al.Glypican-3 modulates inhibitory Bmp2-Smad signaling to control renal development in vivo[J]. Mech Dev,2005,122(7-8):928-938.

[13]Midorikawa Y,Ishikawa S,Iwanari H,et al.Glypican-3,overexpressed in hepatocellular carcinoma,modulates FGF2 and BMP-7 signaling[J].Int J Cancer,2003,103(4):455-465.

[14]Lai JP,Oseini AM,Moser CD,et al.The oncogenic effect of sulfatase 2 in human hepatocellular carcinoma is mediated in part by glypican 3-dependent Wnt activation[J].Hepatology, 2010,52(5):1680-1689.

[15]Stigliano I,Puricelli L,Filmus J,et al.Glypican-3 regulates migration,adhesionandactincytoskeletonorganizationin mammary tumor cells through Wnt signaling modulation[J]. Breast Cancer Res Treat,2009,114(2):251-262.

【中圖分類號(hào)】R622

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）03－0163－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.005

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

通訊作者：曹德君（E-mail：dejuncao@163.com）。

收稿日期：（2016年4月15日；修回日期：2016年6月8日）

Expression of GPC3 in Cranial Suture Cells of Different Stages of Rats

ZHANG Ce,Shim Yoong-hoon,CAO Dejun. Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Dejun(E-mail:dejuncao@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo explore GPC3 expression in cranial suture tissues and cells of different stages,and to provide reference for later research in disease models.MethodsThe cranial suture tissues and cells of 1 d,3 d,7 d SD rats were observed.The expression level of GPC3 were analyzed by immune-histofluorescence staining,RT-qPCR and Western Blot to judge the relationship between GPC3 expression and calvarial osteogenesis/fusion of cranial sutures.ResultsGPC3 was expressed in all stages of unfused rat cranial suture tissues by immune-histofluorescence staining.Results of RT-qPCR and Western Blot showed a descending trend of GPC3 expression with the age increasing.ConclusionIn SD rats,GPC3 has a close relationship with fusion of cranial sutures.

【Key words】Cranial suture cells;SD rats;GPC3