汪　凱，劉　浩，李文超，顧有方*

(1.安徽科技學(xué)院　動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽　鳳陽(yáng)　233100；2. 鳳陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)局，安徽　鳳陽(yáng)　233100)

?

猴源溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)巢式PCR檢測(cè)方法的建立

汪凱1，劉浩2，李文超1，顧有方1*

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng)233100；2. 鳳陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)局，安徽鳳陽(yáng)233100)

摘要：目的:建立猴源溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)巢式PCR 檢測(cè)方法并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè);方法:根據(jù)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)16S rDNA基因序列，設(shè)計(jì)1 對(duì)阿米巴屬原蟲(chóng)保守引物和1 對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)特異性引物，建立猴源溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)巢式PCR 檢測(cè)方法，摸索出了該檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)了行特異性和敏感性試驗(yàn)，并對(duì)96份獼猴糞便樣品進(jìn)行檢測(cè);結(jié)果:該巢式PCR方法能特異性地?cái)U(kuò)增出猴源溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)目的片段，與莫氏內(nèi)阿米巴、波氏內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米巴、大腸內(nèi)阿米巴、微小隱孢子蟲(chóng)等11種相關(guān)原蟲(chóng)基因組DNA 無(wú)交叉反應(yīng)；最低能檢測(cè)到0.3 fg的陽(yáng)性參照DNA；對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明該P(yáng)CR技術(shù)檢查陽(yáng)性者顯微鏡檢查均為陽(yáng)性;結(jié)論:建立的巢式PCR方法具有高度的特異性和敏感性，對(duì)于溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)；猴；巢式PCR；檢測(cè)

溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica) 又稱痢疾阿米巴，是引起阿米巴性結(jié)腸炎和腸外膿腫的病原體[1]。全世界約有5 000 萬(wàn)人感染，每年導(dǎo)致10萬(wàn)人死亡[2]，其死亡率在原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)病患者中僅次于瘧疾[3]。

E.histolytica在獼猴、猩猩和狒狒等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腸道內(nèi)感染均較為普遍[4]，尤其是最近報(bào)道顯示E.histolytica在菲律賓食蟹猴群中高度流行[5]。阿米巴原蟲(chóng)在猴群中的流行不僅對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物自身健康帶來(lái)威脅，而且可能具有人獸共患潛力，在公共衛(wèi)生上具重要意義[4]。

從形態(tài)上看，溶組織內(nèi)阿米巴的包囊或裂殖子階段與寄生于人或非人靈長(zhǎng)類腸道的其它非致病性阿米巴如莫氏內(nèi)阿米巴(E.moshkovskii)和迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar)難以區(qū)分，因此傳統(tǒng)的鏡檢方法難以區(qū)分不同的阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種[6]。盡管可以通過(guò)糞便培養(yǎng)后利用同工酶分析區(qū)分E.histolytica和E.dispar，但該方法周期較長(zhǎng)，大約需幾周的時(shí)間才能得到結(jié)果，而且對(duì)試驗(yàn)設(shè)備的要求較高，難以普及應(yīng)用[7]。因此，目前主要通過(guò)分子診斷方法對(duì)阿米巴原蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定和基因分型，常用的靶基因有16S rRNA、HLY6基因、30-kDa蛋白基因等，其中16S rRNA基因已成為區(qū)分阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種的重要靶基因[8]。鑒于國(guó)內(nèi)目前有關(guān)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的分子檢測(cè)方法報(bào)道較少，本試驗(yàn)根據(jù)猴源溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)16S rRNA基因序列，建立一種能夠快速檢測(cè)猴源溶組織內(nèi)阿米巴的巢式PCR方法，為溶組織內(nèi)阿米巴的分子檢測(cè)和防控提供簡(jiǎn)便可靠的技術(shù)工具。

1材料與方法

1.1蟲(chóng)體及對(duì)照基因組DNA

微小隱孢子蟲(chóng)、人隱孢子蟲(chóng)、人五毛滴蟲(chóng)、莫氏內(nèi)阿米巴、波氏內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米巴、大腸內(nèi)阿米巴、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、人芽囊原蟲(chóng)、犬賈第蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)基因組DNA均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。溶組織內(nèi)阿米巴陽(yáng)性對(duì)照為插入猴源溶組織內(nèi)阿米巴16S rDNA片段的重組質(zhì)粒，由本室制備、保存。

1.2獼猴糞便樣品

96份獼猴糞便樣品，采自安徽某動(dòng)物園。

1.3主要試劑

rTaq DNA 聚合酶、PCR Buffer、dNTPs和DNA Marker DL2000均為Takara公司產(chǎn)品；糞便DNA提取試劑盒，為天根生化科技(北京)有限公司品。

1.4引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Que等[5]的引物，引物根據(jù)E.histolytica16S rDNA基因設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)2對(duì)引物，其中第一對(duì)引物E-1：5'- TAAGATGCAGAGCGAAA -3'，E-2：5'- GTACAAAGGGCAGGGACGTA-3'，第二對(duì)引物為EH-1：5'- AAG CAT TGT TTC TAGATC TGA G-3'，EH-2：5'- AAG AGG TCT AAC CGA AAT TAG-3'。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段為439 bp。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5巢式PCR反應(yīng)

以溶組織內(nèi)阿米巴重組陽(yáng)性質(zhì)粒為巢式PCR首輪擴(kuò)增模板， 兩輪PCR反應(yīng)體系相同，均為5 U/μL rTaq酶0.2 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，20 mol/L上、下游引物各0.25 μL，模板1 μL，加雙蒸水至25 μL，其中第2輪PCR時(shí)用2 μL首輪PCR產(chǎn)物作為模板。巢式PCR首輪反應(yīng)條件為96 ℃，2 min；92 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。第二輪PCR反應(yīng)條件為96 ℃，2 min；92 ℃ 60 s，48 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。

1.6特異性試驗(yàn)

以溶組織內(nèi)阿米巴重組陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，分別以微小隱孢子蟲(chóng)、人隱孢子蟲(chóng)、人五毛滴蟲(chóng)、莫氏內(nèi)阿米巴、波氏內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米巴、大腸內(nèi)阿米巴、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、人芽囊原蟲(chóng)、犬賈第蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)DNA為模板，ddH2O為陰性對(duì)照，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測(cè)其特異性。

1.7敏感性試驗(yàn)

將3 ng /μL溶組織內(nèi)阿米巴重組陽(yáng)性質(zhì)粒按1 ∶10°～1 ∶108進(jìn)行10倍系列稀釋。從每個(gè)稀釋液中各取1μL作為首輪PCR模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)其敏感性。

1.8臨床樣本的檢測(cè)

對(duì)所采集的獼猴糞便采用水洗離心沉淀并碘染后鏡檢的方法進(jìn)行檢測(cè)，以鏡檢發(fā)現(xiàn)阿米巴包囊判為陽(yáng)性，同時(shí)提取所有糞便樣品的基因組DNA，按本試驗(yàn)所建立的巢式PCR方法對(duì)所有樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳后若在439 bp出現(xiàn)條帶則判為陽(yáng)性。

2結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)

利用特異性引物對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴16S rDNA陽(yáng)性對(duì)照及11種其它寄生蟲(chóng)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有溶組織內(nèi)阿米巴重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增出特異條帶，其它DNA作為模板均無(wú)條帶出現(xiàn)(圖1)。

圖1　溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物PCR擴(kuò)增不同蟲(chóng)體DNA的電泳結(jié)果

M：DL2000 DNA Marker；1：ddH2O；2：溶組織內(nèi)阿米巴；3：微小隱孢子蟲(chóng)；4：人隱孢子蟲(chóng)；5：人五毛滴蟲(chóng)；6：莫氏內(nèi)阿米巴；7：波氏內(nèi)阿米巴；8：迪斯帕內(nèi)阿米巴；9：大腸內(nèi)阿米巴；10：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；11：人芽囊原蟲(chóng)；12：犬賈第蟲(chóng)；13：犬弓首蛔蟲(chóng)

Fig.1PCR amplicon from different genomic DNAs with specific primers ofE.histolytica

M：DL2000 DNA Marker；1：ddH2O；2：Entamoebahistolytica；3：Cryptosporidiumparvum；4：Cryptosporidiumhominis；5：Pentatrichomonashominis；6：Entamoebamoshkovskii；7：Entamoebapolecki；8：Entamoebadispar；9：Entamoebacoli；10：Eimeriatenella；11：Blastocystishominis；12：Giardiacanis；13：Toxocaracanis

2.2敏感性試驗(yàn)

將3 ng /μL溶組織內(nèi)阿米巴重組陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增可檢測(cè)到1 ∶104稀釋的陽(yáng)性參照DNA，即對(duì)陽(yáng)性參照模板最低可檢測(cè)到0.3 fg(圖2)。

圖2　溶組織內(nèi)阿米巴巢式PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3臨床樣本的檢測(cè)

96份獼猴糞便樣品，水洗離心沉淀并碘染后鏡檢共檢出陽(yáng)性樣品25份，陽(yáng)性率為26.04 %；PCR方法檢出陽(yáng)性數(shù)為30份，陽(yáng)性率為31.25 %。其中，PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性者，鏡檢均呈陽(yáng)性。

3結(jié)論與討論

內(nèi)阿米巴屬原蟲(chóng)是可寄生于人和動(dòng)物多種臟器的人獸共患原蟲(chóng)，種類較多，包括致病性和非致病性的蟲(chóng)種，其中致病性種類主要是溶組織內(nèi)阿米巴，可引起人和動(dòng)物出現(xiàn)痢疾和肝膿腫，嚴(yán)重者可危及生命[11]。致病性和非致病性的內(nèi)阿米巴屬原蟲(chóng)的包囊和滋養(yǎng)體在形態(tài)上很難區(qū)別，因此，傳統(tǒng)的診斷方法很難確定病原種類，開(kāi)發(fā)新的方便、易行、快捷、費(fèi)用低、敏感性高的檢測(cè)方法已迫在眉睫。

PCR技術(shù)由于其靈敏度高，而且易于操作，對(duì)寄生蟲(chóng)的各個(gè)生活史階段都可以檢測(cè)，尤其是巢式PCR技術(shù)由于經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增使診斷的特異性、靈敏度大大增強(qiáng)，特別適合檢測(cè)雜質(zhì)較多但目的基因含量少的樣本，如糞便樣本等。目前國(guó)外已有針對(duì)阿米巴原蟲(chóng)不同基因的PCR方法用于檢測(cè)或區(qū)分內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)不同蟲(chóng)種，其中16S rDNA基因由于在不同內(nèi)阿米巴蟲(chóng)種之間存在穩(wěn)定的遺傳偏差，而且該基因在基因組上具有多拷貝性，使得該基因比單拷貝基因更易檢測(cè)，因此該基因目前作為區(qū)分內(nèi)阿米巴蟲(chóng)種的一個(gè)重要靶基因廣泛應(yīng)用于內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種的檢測(cè)和蟲(chóng)種分類方面[9]。

本研究以含有猴源溶組織內(nèi)阿米巴16S rDNA基因重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參照模板，建立了猴源溶組織內(nèi)阿米巴的巢式PCR檢測(cè)方法。對(duì)PCR檢測(cè)方法而言，特異性和敏感性是評(píng)價(jià)其其優(yōu)良與否的關(guān)鍵指標(biāo)，兩者缺一不可[10]。本試驗(yàn)特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示只有猴源溶組織內(nèi)阿米巴擴(kuò)增出目的條帶，其他所有對(duì)照包括內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)對(duì)照均不能擴(kuò)增出目的條帶，表明所建立的巢式PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法對(duì)陽(yáng)性參照模板最低可檢測(cè)到0.3 fg，顯示該方法具有較高的敏感性。本試驗(yàn)中所用陽(yáng)性參照模板為重組質(zhì)粒，其DNA純度要比實(shí)際工作中樣品提取的DNA純度要高，而且實(shí)際樣品如糞便中提取的DNA中可能含有較多的PCR抑制因子，因此本試驗(yàn)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果只能用于樣品檢測(cè)的一個(gè)參考，但本試驗(yàn)建立的方法對(duì)于某些難以大量獲得病原體的情況下的檢測(cè)卻很有意義[11]。

本試驗(yàn)中，比較巢式PCR方法和水洗離心沉淀并碘染后鏡檢法的結(jié)果，顯示常規(guī)方法往往會(huì)出現(xiàn)大量的假陽(yáng)性。獼猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可感染多種內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)，包括E.histolytica、迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar)、波列基內(nèi)阿米巴(E.polecki)、 結(jié)腸內(nèi)阿米巴(E.coli)、諾氏內(nèi)阿米巴(E.nutalli)等[12]。而E.histolytica與其它內(nèi)阿米巴在形態(tài)上難以區(qū)分，因此常規(guī)方法鏡檢時(shí)可能把非致病性的內(nèi)阿米巴誤認(rèn)為E.histolytica，因而人為提高了E.histolytica的陽(yáng)性率。其次，獼猴糞便中含有大量的干擾物質(zhì)如各種酵母菌、纖毛蟲(chóng)等，檢查者的技術(shù)水平也會(huì)影響檢查結(jié)果。本試驗(yàn)中，PCR 技術(shù)檢查陽(yáng)性者顯微鏡檢查都為陽(yáng)性，表明所建立的巢式PCR方法與傳統(tǒng)方法具有較好的一致性，說(shuō)明該方法具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳奕，程訓(xùn)佳．溶組織內(nèi)阿米巴致病因子的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2006，24(6)：457-460．

[2]WALSH J A. Problems in recognition and diagnosis of amebiasis: estimation of the global magnitude of morbidity and mortality[J]. Reviews of Infectious Diseases, 1986, 8(2): 228-238.

[3]NGUI R, ANGAL L, FAKHRURRAZI S A, et al. DifferentiatingEntamoebahistolytica,entamoebadisparandEntamoebamoshkovskiiusing nested polymerase chain reaction (PCR) in rural communities in Malaysia[J]. Parasites & Vectors, 2012, 5(1): 187.

[4]FENG Meng, YANG Bin, YANG Liu, et al. High prevalence ofEntamoebainfectionsin captive long-tailed macaques in China[J]. Parasitology Research, 2011, 109(4): 1093-1097.

[5]RIVERA W L, YASON J A, ADAO D E.EntamoebahistolyticaandE.disparinfections in captive macaques (Macacafascicularis) in the Philippines[J]. Primates, 2010, 51(1): 69-74.

[6]HAMZAH Z, PETMITR S, MUNGTHIN M, et al. Differential detection ofEntamoebahistolytica,Entamoebadispar, andEntamoebamoshkovskiiby a single-round PCR assay[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2006, 44(9): 3196-3200.

[7]HUSTON C D, HAQUE R, PETRI W A. Molecular-based diagnosis ofEntamoebahistolyticainfection[J]. Expert Reviews in Molecular Medicine, 1999(12): 1-11.

[8]FOO P C, CHAN Yean-yean, SEE TOO W C, et al. Development of a thermostabilized, one-step, nested, tetraplex PCR assay for simultaneous identification and differentiation of Entamoeba species,EntamoebahistolyticaandEntamoebadisparfrom stool samples[J]. Journal of Medical Microbiology, 2012, 61(Pt9): 1219-1225.

[9]董海聚，王榮軍，張龍現(xiàn)．內(nèi)阿米巴屬原蟲(chóng)分子檢測(cè)及基因分型方法研究進(jìn)展[J]．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30(7)：747-752．

[10]肖淑敏，李國(guó)清，楊建偉，等．牛源賈第蟲(chóng)套式PCR檢測(cè)方法的建立[J]．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(1)：26-29．

[11]高振永，李國(guó)清，岳彩玲，等．猴源環(huán)孢子蟲(chóng)巢式PCR檢測(cè)方法的建立[J]．中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18(5)：32-36．

[12]FENG Meng, CAI Jun-long, MIN Xiang-yang, et al. Prevalence and genetic diversity of Entamoeba species infecting macaques in southwest China[J]. Parasitology Research, 2013, 112(4): 1529-1536.

(責(zé)任編輯：馬世堂)

收稿日期：2016-01-06

基金項(xiàng)目：安徽省第七批“115”產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；安徽省教育廳重大項(xiàng)目(KJ2014ZD09)；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A189)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(gxyqZD2016220)；安徽省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)客實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2015ckjh027)；安徽科技學(xué)院校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)客實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(Xj201550)；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(AKZDXK2015A04)。

作者簡(jiǎn)介：汪凱( 1991-)，女，安徽省池州市人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究。 *通訊作者：顧有方，教授，E-mail：youfanggu@163.com。

中圖分類號(hào)：S855.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-8772(2016)03-0010-04

Establishment of Nested PCR Assay for Detection of Monkey-DerivedEntamoebahistolytica

WANG Kai1,LIU Hao2, LI Wen-chao1, GU You-fang1*

( 1.College of Animal Science,Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100，China；2.Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Fengyang, Fengyang 233100,China)

Abstract：Objective： To develop a nested PCR assay for the detection of monkey-derived Entamoeba histolytica. Method Based on the monkey-derived E. histolytica 16S rRNA gene sequences, one pair of Entamoeba genus specific primers and one pair of E. histolytica species specific primers were designed. With these primers, a nested PCR amplification conditions were optimized. A series of tests were conducted regarding the specificity and sensitivity. Results： The nested PCR assay was specific and there is no cross-reaction with other parasites, such as E. moshkovskii,E. polecki,E. dispar,E .coli and C. parvum. The assay was able to detect as low as 0.3 fg of control positive DNA. The results of detection of clinical samples showed that the assay was coinciding with the traditional method. Conclusion： The nested PCR assay reported here detects E. histolytica accurately and sensitively and will be an effective tool for molecular epidemiology and diagnosis of E. histolytica in monkey feces.

Key words:Entamoeba histolytica；Monkey；Nested PCR；Detection