李正鵬，何慶元，史　鈞，祝嫦巍，吳　萍

(安徽科技學(xué)院　應(yīng)用微生物研究所, 安徽　鳳陽　233100)

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大豆根瘤菌AWCS13-4菌株培養(yǎng)條件的篩選與優(yōu)化

李正鵬，何慶元，史鈞，祝嫦巍，吳萍*

(安徽科技學(xué)院應(yīng)用微生物研究所, 安徽鳳陽233100)

摘要：研究了大豆根瘤菌AWCS13-4 菌株在YMA、TY、PA 、BSE 4種培養(yǎng)基中的生長情況，并通過單因素和正交試驗確定最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，AWCS13-4菌株在YMA培養(yǎng)基中生長較好，蔗糖為最佳碳源，酵母粉為最佳氮源，最佳pH為7.0，最佳接種量為3%，最佳培養(yǎng)溫度為30℃。在單因素的基礎(chǔ)上，采用正交試驗，對4個因素進(jìn)行優(yōu)化，其最佳培養(yǎng)組合為：每升培養(yǎng)基中添加蔗糖10 g，酵母粉3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL；pH為7.0，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30℃。

關(guān)鍵詞：大豆根瘤菌；培養(yǎng)基；條件優(yōu)化；正交試驗

大豆根瘤菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛的分布于土壤中，它能侵染豆科植物根部或者莖部，然后在植物根部或者莖部分化形成類菌體，將空氣中的氮素同化為植物可吸收的氨[1-3]，根瘤菌與豆科植物共生固氮體系是自然界固氮效率最高，固氮量最多的生物固氮體系[4]。

隨著人類社會的發(fā)展，生活需求日益增加，對谷物的需求也增大，谷物作物對氮肥的需求量也增加，增加氮肥的工業(yè)生產(chǎn)與更好的利用和提高生物固氮能力是農(nóng)業(yè)提供氮肥的兩條重要途徑[5]，特別是在我國人口暴增和節(jié)約資源的前提下，我們應(yīng)該大力發(fā)展生物固氮技術(shù)。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營養(yǎng)狀況、提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用，對于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展有著非常重要的作用及生態(tài)效果[6-7]。目前，接種根瘤菌劑已經(jīng)成為世界各國豆科作物增產(chǎn)、減少化肥施用的一項技術(shù)措施，在許多國家都有大規(guī)模商品菌劑的生產(chǎn)和出售，應(yīng)用面積也不斷擴(kuò)大[8-13]。因此，開發(fā)一類高效的大豆固氮菌劑對提高大豆的產(chǎn)量，增加土壤肥力具有重要意義。雖然大豆根瘤菌菌劑使用表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，受到越來越多的關(guān)注，但是我國大豆根瘤菌劑的研發(fā)與應(yīng)用時間相對較短，很多產(chǎn)品的研發(fā)還是處于研究階段。因此，要想使我國在大豆根瘤菌劑的應(yīng)用方面再上一個新臺階，必須加大研發(fā)力度。本文希望通過科學(xué)的試驗設(shè)計與分析，得出不同的因素對根瘤菌AWCS13-4的影響，得到活菌數(shù)較高、生長速度較快，適合實際應(yīng)用的最佳培養(yǎng)條件，為根瘤菌劑的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌種 大豆根瘤菌AWCS13-4菌株(安徽科技學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供)。

1.2培養(yǎng)基

YMA培養(yǎng)基[14]，其主要構(gòu)成為：甘露醇10 g，酵母粉1 g， K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL，H2O1000 mL，pH6.8～7.0。TY培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，CaCl21.3 g，H2O 1000 mL，pH 6.8～7.0。PA培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O1000 mL，pH 6.8～7.0。BSE培養(yǎng)基[15]：甘露醇10 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.1 g，Rh微量元素液4mL，豆芽汁1000 mL，pH 6.8～7.0。斜面培養(yǎng)基：YMA 固體培養(yǎng)基(YMA 液體培養(yǎng)基+2%瓊脂粉)。種子培養(yǎng)基：用YMA 培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基。

1.3試驗方法

1.3.1菌種活化在無菌條件下將AWCS13-4菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基(YMA)上，在溫度為28℃的條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2種子液制備將已經(jīng)活化好的AWCS13-4根瘤菌接一環(huán)到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基(250 mL的三角瓶裝80 mL培養(yǎng)基)中，在28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，3d后即得種子液備用。

1.3.3菌株在YMA、TY、PA、BSE 4種液體培養(yǎng)基中不同時期生長狀況的測定將培養(yǎng)好的種子液，按照3%(V∕V)接種量接入YMA、TY、PA、BSE 4種液體培養(yǎng)基(250 mL的三角瓶裝100mL培養(yǎng)液)中，28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，分別在0、24、48、72 h時測定OD620nm[11]值。

1.3.4培養(yǎng)基碳源的篩選從4種培養(yǎng)基中選擇最適合AWCS13-4根瘤菌生長的一種培養(yǎng)基，進(jìn)行碳源的利用試驗，分別用10 g的葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖及甘油進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基中其他成分不變。按3%接種量將種子液接入上述培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，在0、24、48、72 h時測定OD620nm值。

1.3.5培養(yǎng)基氮源的篩選確定最佳碳源后，在培養(yǎng)基中放入1 g不同的氮源酵母粉、蛋白胨、大豆粉、玉米粉及麥麩進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基其他成分不變。按3%接種量將種子液接入上述培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，在0、24、48、72 h時測定OD620nm值。

1.3.6培養(yǎng)基初始pH值的篩選確定最佳碳、氮源后，將培養(yǎng)基中的初始pH值設(shè)定為4、5、6、7、8、9進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基中其他成分不變。按3%接種量將種子液接入上述培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，在0、24、48、72 h時測定OD620nm值。

1.3.7接種量的篩選確定最佳碳、氮源、pH值后，將接種量設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5% 進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基其他成分不變。于28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，在0 h、24 h、48 h、72 h時測定OD620nm值。

1.3.8培養(yǎng)溫度的篩選確定最佳碳、氮源、pH值和接種量后，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為20、25、30、35、40 ℃進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基其他調(diào)節(jié)不變。按3%接種量將種子液接入上述培養(yǎng)基，于150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)，在0、24、48、72 h 時測定OD620nm值。

1.3.9正交試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗法[16]對碳源、氮源添加量、pH值、溫度4個影響菌體生長的因素進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見表1。

表1　因素水平表

2結(jié)果與分析

2.1AWCS13-4菌株在4種培養(yǎng)基上的生長情況

由圖1可見AWCS13-4菌株在YMA、TY、PA、BSE 4種培養(yǎng)基中不同時期的OD620nm值的變化情況。試驗結(jié)果表明：AWCS13-4菌株在YMA培養(yǎng)基和BSE培養(yǎng)基中生長速度比較快，其次是TY培養(yǎng)基，在PA培養(yǎng)基中生長速度最慢，同時YMA培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)全面，原材料比較易于得到，因此本試驗的最佳培養(yǎng)基為YMA培養(yǎng)基，選定YMA培養(yǎng)基進(jìn)行剩余條件優(yōu)化。

圖1　AWCS13-4菌株在4種培養(yǎng)基上的生長狀況

2.2AWCS13-4菌株對不同碳源的利用

碳源為微生物細(xì)胞提供能量物質(zhì)和碳架，對微生物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，因此，碳源的選擇對微生物的培養(yǎng)特別重要。從圖2可以看出：AWCS13-4菌株在以蔗糖或者甘露醇為碳源的培養(yǎng)基中生長狀況較好，生長速度較快，且蔗糖稍強于甘露醇，培養(yǎng)72h后，蔗糖和甘露醇的OD620nm值最高可分別達(dá)到1.311和1.300。在葡萄糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長速度較緩，經(jīng)過72h的培養(yǎng)，葡萄糖和麥芽糖的OD620nm值最高分別達(dá)到了1.065和1.055，在以乳糖和甘油為碳源的培養(yǎng)基中根瘤菌AWCS13-4的生長速度最差。故此，實驗室提供的六種不同碳源對AWCS13-4菌株生長情況的影響依次為：蔗糖>甘露醇>麥芽糖>葡萄糖>乳糖>甘油。并且蔗糖的生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于甘露醇的生產(chǎn)成本，蔗糖比較廉價易得，故此本試驗的最佳培養(yǎng)基碳源為蔗糖。

圖2　AWCS13-4菌株對不同碳源的利用狀況

2.3AWCS13-4菌株對不同氮源的利用

氮源的主要作用是構(gòu)建菌體細(xì)胞物質(zhì)和菌體中的含氮代謝物這兩個方面，是菌體不可缺少重要營養(yǎng)元素之一。試驗結(jié)果表明(圖3)： AWCS13-4 菌株以酵母粉為氮源，其生長速度最快，經(jīng)過72 h后OD620nm值最高可達(dá)到1.469。在以蛋白胨和大豆粉為氮源的培養(yǎng)基中，根瘤菌AWCS13-4生長速度較緩，經(jīng)過72 h后，其OD620nm值最高分別達(dá)到1.114和0.932，根瘤菌AWCS13-4在以玉米粉和麥麩作為氮源的培養(yǎng)基中生長較差。故此本試驗的最佳培養(yǎng)基氮源為酵母粉。

圖3　AWCS13-4菌株對不同氮源的利用狀況

2.4不同pH值對AWCS13-4菌株生長的影響

圖4　不同pH值對AWCS13-4菌株生長的影響

適宜的pH可以促進(jìn)根瘤菌AWCS13-4的生長，強酸強堿都不利于根瘤菌的生長，試驗結(jié)果表明(圖4)：AWCS13-4菌株在pH為7時生長速度最好，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)，pH為7的OD620nm值最高達(dá)到1.423，在pH為4、5、9時，根瘤菌AWCS13-4的生長速度較為緩慢，根瘤菌AWCS13-4在不同pH值中的生長狀況排序依次為：pH 7>pH 8>pH 6>pH 9>pH 5>pH 4，所以本試驗培養(yǎng)基中最適pH值為7。

2.5不同接種量對AWCS13-4菌株生長的影響

圖5　不同接種量對AWCS13-4菌株生長的影響

適宜的接種量有利于根瘤菌充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，使得根瘤菌可以快速生長，但是接種量過大時，由于對營養(yǎng)的競爭吸收，反而不利于根瘤菌的培養(yǎng)。故此，篩選出適宜的接種量對根瘤菌的培養(yǎng)有著重要的作用。試驗結(jié)果表明(圖5)：AWCS13-4菌株在接種量為3%(250 mL的三角瓶中裝100 mL的種子液)的培養(yǎng)基中生長狀況最好，且最終OD620nm值可達(dá)到1.435，故此，本次試驗中最好接種量為3%。

2.6不同培養(yǎng)溫度對WCS13-4菌株生長的影響

不同的根瘤菌都有著適宜自己快速生長的溫度，溫度過高或過低都不利于菌株的生長，甚至導(dǎo)致菌株的死亡，故此篩選適宜根瘤菌最適的培養(yǎng)溫度是至關(guān)重要。試驗結(jié)果表明(圖6)：AWCS13-4菌株在培養(yǎng)溫度為30 ℃時生長速度最快，生長72 h后，其OD620nm值最高達(dá)到了1.474。在溫度為25 ℃和35 ℃時，生長72 h，其OD620nm值最高可分別達(dá)到1.347和1.239，在溫度為20 ℃和40 ℃時，根瘤菌AWCS13-4的生長狀況較差，不同培養(yǎng)溫度的最終生長結(jié)果順序依次為：30 ℃>25 ℃>35 ℃>20 ℃>40 ℃。故此本試驗最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對WCS13-4菌株生長的影響

2.7最佳培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

由表2可以看出，在9個處理中，培養(yǎng)3 d后測吸光值，AWCS13-4 菌株在9號培養(yǎng)基上生長狀況最好。經(jīng)極差分析，4種主要因素對其生長速度影響的順序依次為：溫度(D)>pH值(C)>酵母粉(B)>蔗糖(A)；其中溫度為主要因素。正交分析最佳組合為A2B3C2D2，即培養(yǎng)基的碳源為蔗糖10 g，最佳氮源為酵母粉3 g，最佳pH值為7，最佳溫度為30 ℃。

表2　正交試驗結(jié)果

3結(jié)論與討論

本試驗通過對4種培養(yǎng)基的篩選，得出的結(jié)果是AWCS13-4菌株在YMA培養(yǎng)基上生長的較好，YMA培養(yǎng)基是根瘤菌的常規(guī)培養(yǎng)基，大多數(shù)的根瘤菌都能在YMA培養(yǎng)基上生長[17]，此外，根瘤菌AWCS13-4菌株在BSE培養(yǎng)基中生長僅次于YMA培養(yǎng)基，但由于在制備豆芽汁的過程中有很多因素是難以控制的，比如豆芽汁原料的不穩(wěn)定性等[18]，因此本試驗選擇YMA液體培養(yǎng)基作為大豆根瘤菌AWCS13-4最佳培養(yǎng)基。

試驗得到的最佳碳源為蔗糖和甘露醇，但是由于甘露醇價格高，蔗糖價格低廉且易獲得，故此選擇蔗糖為最佳碳源。對根瘤菌AWCS13-4菌株的其余的培養(yǎng)條件如氮源、pH、接種量、溫度進(jìn)行篩選，同時通過正交試驗，篩選出適宜根瘤菌AWCS13-4菌株生長的最佳氮源為酵母粉3g，最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適宜pH為7，最優(yōu)接種量為3%。用以上條件來培養(yǎng)AWCS13-4菌株，可促進(jìn)大豆根瘤菌的良好生長。

大豆根瘤菌培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化有眾多的好處，如可以降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)資源的高效利用，還可以實現(xiàn)大豆根瘤菌快速、大量的生長，同時通過正交試驗所得出的結(jié)果，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)根瘤菌菌劑提供了理論依據(jù)，但本次試驗所用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，液態(tài)培養(yǎng)基具有保質(zhì)期短，運輸不方便等缺點，如何促使液體培養(yǎng)基活菌數(shù)高，保質(zhì)期長，易運輸，易配制還需要進(jìn)一步的研究。

通過本試驗得出最佳培養(yǎng)基是YMA培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行正交設(shè)計試驗，得出的最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖10 g，酵母粉3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL，H2O 1000 mL，pH是7.0，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳文新，汪恩濤．中國根瘤菌[M]．北京：科學(xué)出版社，2011．

[2]吳萍，何慶元，李正鵬，等．高效大豆根瘤菌篩選的初步研究[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報，2013，27(3)：29-32．

[3]吳萍，何慶元，李正鵬，等．大豆根瘤菌對不同微肥及pH耐性的篩選[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報，2015，29(2)：20-24．

[4]朱劍光，尉亞輝，吳藝舟．花生慢生根瘤菌的分離與鑒定[J]．生物技術(shù)，2006，16(2)：45-47．

[5]竇新田．生物固氮[M]．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989．

[6]張學(xué)江．廣譜高效的大豆根瘤菌[M]．武漢：武漢作物油料科研所出版社，1979．

[7]趙念力，谷維，張俐俐，等．引進(jìn)的俄羅斯高效大豆根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(3)：69-70．

[8]譚娟．接種俄羅斯大豆根瘤菌對大豆生長和產(chǎn)量的影響[J]．作物雜志，2007(4)：36-37．

[9]李阜棣，胡正嘉．微生物肥料在持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[M]．北京：中國科技出版社，1994．

[10]張武．俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態(tài)適應(yīng)性[J]．作物雜志，2010(3)：54-55．

[11]李艷杰．接種大豆根瘤菌對大豆生長及產(chǎn)量的影響[J]．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(1)：50-52．

[12]梁彥濤，徐太海，金連豐，等．豆科植物在生態(tài)恢復(fù)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(20)：6637-6638, 6655．

[13]楊鶴同，徐超，趙桂華，等．微生物肥料在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(29)：10078-10080, 10082．

[14]劉盧生，玉永雄，胡艷，等．酸鋁對耐酸苜蓿根瘤菌生長的影響[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(36)：17615-17618．

[15]吳紅慧，周俊初．根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和劑型的比較研究[J]．微生物學(xué)通報，2004，31(2)：14-19．

[16]肖亦農(nóng)，徐瓊．大豆根瘤菌HH103菌株培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化[J]．微生物學(xué)雜志，2011，31(6)：92-95．

[17]王秀芹，張華微．野大豆快生型根瘤菌共生固氮及其生理生化特性研究[J]．遼寧師專學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，5(4)：98-101．

[18]李萍，楊會青，李泰侖，等．費氏中華根瘤菌培養(yǎng)基的選擇及優(yōu)化[J]．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2007，19(6)：71-74．

(責(zé)任編輯：馬世堂)

收稿日期：2016-01-08

基金項目：國家星火計劃(2015GA710012)，安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目(KJ2011Z066)，安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目 (KJ2013A077)，安徽科技學(xué)院自然科學(xué)基金項目(ZRC2013367)。

作者簡介：李正鵬(1971-)，男，安徽省天長市人，碩士，副教授，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與研究。*通信作者：吳萍，教授，E-mail：wupinggu@126.com。

中圖分類號：S656.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-8772(2016)03-0014-06

Screening and Optimizing of the Culture Conditions for Soybean Rhizobium Strain AWCS13-4

LI Zheng-peng, HE Qing-yuan, SHI Jun, ZHU Chang-wei ,WU Ping*

(Institute for Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Abstract：The growth conditions of AWCS13-4 were studied using single factor and orthogonal test in 4 culture medium of YMA, TY, PA and BSE. The results showed that AWCS13-4 grew better in culture medium of YMA than in others. The best carbon source, nitrogen source, pH value, inoculation amount and temperature were saccharose, yeast powder, pH 7.0, 3% and 30℃ respectively. On the basis of single factor, orthogonal experiment was used to optimize the 4 factors. The best culture conditions were 10 g saccharose, 0.2 g MgSO4·7H2O，0.5 g K2HPO4 ，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2·5H2O, 4 mL Rh microelement solution in 1 L culture medium, pH 7.0, inoculation amount of 3% and culture temperature of 30℃.

Key words:Soybean rhizobia;Medium;Condition optimization;Orthogonal experiment