陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 (咸陽712046)

楊曉航　李　舒　劉文奇　許小凡△ 　張　紅△ 　劉　力△▲

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二甲基亞砜、二甲基酰胺、甲醇、乙醇四種溶劑對(duì)Hela細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)效應(yīng)研究*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 (咸陽712046)

楊曉航李舒劉文奇許小凡△張紅△劉力△▲

摘要目的：觀察二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇四種常用有機(jī)溶劑對(duì)Hela細(xì)胞生存率的影響，為開展體外細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究選擇溶劑種類和濃度提供參考。方法：采用MTT法檢測(cè)四種溶劑各9個(gè)濃度下Hela細(xì)胞的存活率；在此基礎(chǔ)上采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)，觀察8種不同濃度的乙醇對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：四種有機(jī)溶劑不同濃度時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞生存率產(chǎn)生不同影響，DMSO最佳濃度為0.5%；DMF最佳濃度0.1%，甲醇的最佳濃度0.1%～0.5%；Hela細(xì)胞的存活率和凋亡結(jié)果均表明乙醇作為有機(jī)溶媒的最佳濃度0.25%。結(jié)論：DMSO、DMF、甲醇、乙醇四種溶劑對(duì)Hela細(xì)胞活性和生存率存在負(fù)向影響，程度從小到大依次為乙醇、DMSO、DMF、甲醇，用于體外細(xì)胞培養(yǎng)的濃度最大均不可超過0.5%；乙醇是體外細(xì)胞培養(yǎng)中較為理想的溶劑，但濃度不可超過0.25%，刺激時(shí)間不可超過12h。

主題詞Hela細(xì)胞二甲亞砜甲酰胺類甲醇乙醇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)干預(yù)性研究

Hela細(xì)胞是體外細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞株，在化學(xué)離子探針、分子作用靶向、血清藥理學(xué)等研究領(lǐng)域使用廣泛[1-4]。大量體外細(xì)胞培養(yǎng)的干預(yù)效應(yīng)研究都涉及了有機(jī)溶劑的使用，但有機(jī)溶劑的使用多根據(jù)溶質(zhì)需要確定濃度且差異較大[5-7]。目前未見針對(duì)使用有機(jī)溶劑的濃度差異對(duì)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的干預(yù)效應(yīng)研究[8-10]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞活性或計(jì)數(shù)的研究結(jié)果，理論上均為溶質(zhì)成分(分子)與有機(jī)溶劑形成溶液體系的疊加效應(yīng)，忽略了有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的干預(yù)效應(yīng)，從而引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。本研究擬通過觀察二甲基亞砜(DMSO)、二甲基酰胺(DMF)、甲醇、乙醇四種有機(jī)溶劑對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響，為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有機(jī)溶媒的選擇和矯正相關(guān)研究結(jié)果的誤差提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞，購于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心；緩沖液(PBS)配成0.01mmol/L，RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Solarbio公司， 胎牛血清、胰酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司 ，酶標(biāo)儀為美國Bio-TEK公司產(chǎn)品。DMSO購于美國Sigma公司(純度>99.9%)、DMF購于廣東光華科技股份有限公司(純度>99.5%)、甲醇購于天津富宇精細(xì)化工有限公司(純度>99.5%)、乙醇購于天津市達(dá)森化工產(chǎn)品有限公司(純度>99.7%),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司。

2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞用RPMi1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10mmol/L HEPES)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，觀察細(xì)胞貼壁狀況良好，即可使用。

3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml,分別接種于4個(gè)96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h后分別設(shè)空白對(duì)照組、DMSO組、DMF組、甲醇組和乙醇組?？瞻讓?duì)照組只加細(xì)胞和等體積培養(yǎng)基，不加有機(jī)溶劑，復(fù)孔8個(gè)；實(shí)驗(yàn)組分別加入DMSO、DMF、甲醇、乙醇這四種有機(jī)溶劑的9個(gè)不同濃度，分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%、10%、20%，濃度單位均為體積比,每組濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，孵育24h后加入MTT 50μl(終濃度是5mg/ml)，孵育4h，小心吸取上清后，每孔繼續(xù)加入DMSO 150μl，孵育10min，充分震蕩，放入酶標(biāo)儀，在490nm處測(cè)吸光度(OD值)，重復(fù)3次。得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過下面公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率R。

R(%)=×100%

4細(xì)胞形態(tài)的觀察倒置顯微鏡20倍、40倍物鏡下觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。

5AnnexinⅤ-FiTC/Pi雙標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)觀察8種不同濃度的乙醇對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響。Hela細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml,接種于6孔板，每孔2ml，培養(yǎng)24h后分為6h實(shí)驗(yàn)組、12h實(shí)驗(yàn)組、24h實(shí)驗(yàn)組。每組實(shí)驗(yàn)組中均包含空白對(duì)照組和8種不同乙醇濃度組?？瞻讓?duì)照組共兩個(gè)復(fù)孔，只加細(xì)胞和等體積培養(yǎng)基，不加有機(jī)溶劑；實(shí)驗(yàn)組各組分別加入8種不同濃度的乙醇，濃度分別為：0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%、10%；每組兩個(gè)復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，分別在6h、12h、24h時(shí)取出細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞曬網(wǎng)濾過之后，按試劑盒說明加入AnnexinⅤ-FiTC和Pi雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)3次，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

結(jié)果

1DMSO對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響在濃度為0.5%以內(nèi)，DMSO對(duì)Hela 細(xì)胞存活率無明顯影響。DMSO濃度在0.01%～0.05%時(shí)，細(xì)胞生存率與培養(yǎng)基對(duì)照組均無差異。但是，當(dāng)濃度超出0.5%時(shí)，隨著濃度的增加，存活率顯著下降。以5%濃度組同0.5%濃度組相比較，細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)。濃度對(duì)于0.5%的各組細(xì)胞生存率明顯下降，且隨著濃度的升高，存活率逐漸下降，見表1。

表1　DMSO不同濃度組Hela細(xì)胞OD均值與存活率

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；**P>0.05

2DMF對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響DMF的濃度為0.01%組、0.05%組、0.1%組、0.25%組、0.5%組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，存活率與培養(yǎng)基對(duì)照組比無差異；DMF濃度為1%組、5%組、10%組、20%組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Hela細(xì)胞的存活率與培養(yǎng)基對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以0.5%濃度組同1%濃度組相較，細(xì)胞存活率有明顯下降(P<0.05)，見表2。

3甲醇對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響甲醇濃度為0.01%組、0.05%組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Hela細(xì)胞的存活率與培養(yǎng)基對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且小于培養(yǎng)基對(duì)照組；0.1%組和0.5%組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，存活率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；0.25%組與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且大于培養(yǎng)基對(duì)照組；1%組、5%組、10%組和20%組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，存活率有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且隨著濃度的升高存活率逐漸下降，見表3。

表2　DMF不同濃度組Hela細(xì)胞OD均值與存活率

注：與空白對(duì)照組比較，*P>0.05；與0.5%組比較，**P<0.05；與空白對(duì)照組比較，***P<0.01

表3　甲醇不同濃度組Hela細(xì)胞OD均值與存活率

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05， **P>0．05，***P<0.01

4乙醇對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響乙醇9種不同濃度各組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，濃度從0.01%～0.25%，隨著濃度的升高，存活率逐漸升高。0.5%組、1%組、5%組、20%組，隨著濃度的增加，Hela細(xì)胞的存活率逐漸降低，而10%濃度組與5%濃度組相較，10%組Hela細(xì)胞的存活率高。以0.5%組同0.25%組相較，Hela細(xì)胞的存活率有顯著下降差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示乙醇濃度超過0.25%時(shí)，Hela細(xì)胞的存活率明顯降低，見表4。

5相同濃度梯度下DMSO、DMF、甲醇、乙醇對(duì)Hela細(xì)胞存活率影響的比較當(dāng)濃度同在0.25%以內(nèi)時(shí)，乙醇分別與甲醇、DMSO、DMF相比較，Hela細(xì)胞的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，乙醇中Hela細(xì)胞的存活率高于其他三種溶劑。提示0.25%濃度以內(nèi)，首選乙醇作為有機(jī)溶媒。當(dāng)有機(jī)溶媒濃度超0.5%，隨著濃度的增大，Hela細(xì)胞的存活率逐漸下降，與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示，DMSO、DMF、甲醇、乙醇四種有機(jī)溶劑在參與到Hela細(xì)胞培養(yǎng)的離體實(shí)驗(yàn)中時(shí)，濃度均不可高于0.5%(圖1)。

表4　乙醇不同濃度組Hela細(xì)胞OD均值與存活率

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與0.5%組比較，**P< 0.01

圖1　相同濃度梯度下四種溶劑對(duì)Hela細(xì)胞存活率影響

6Hela細(xì)胞在四種溶劑中形態(tài)變化的比較對(duì)照組(圖2A)細(xì)胞核清晰可見、完整、型好，細(xì)胞個(gè)體緊實(shí)、邊界清楚、貼壁良好、緊緊相連。與空白對(duì)照組相比，DMSO組細(xì)胞隨著濃度的增加，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核明顯腫脹、變形、固化，邊界清晰可見無連接(圖2B、C、D)；DMF組細(xì)胞中可見，細(xì)胞體積腫脹，細(xì)胞核變大、固化(圖2E、F、G)；甲醇組細(xì)胞隨著濃度增大，細(xì)胞核逐漸腫脹變大，相較于其他三種溶劑其細(xì)胞核折疊程度明顯增加(圖2H、I、J)；乙醇組細(xì)胞隨著濃度增大體積逐漸腫大，固化，邊界清晰，無連接，細(xì)胞核腫大與保質(zhì)邊界清晰可見(圖2K、L、M)。各組Hela細(xì)胞形態(tài)變化與MTT檢測(cè)結(jié)果一致。

7不同時(shí)間段相同濃度梯度下乙醇對(duì)Hela細(xì)胞存活率影響當(dāng)乙醇濃度為0.25%時(shí)，以刺激6h后Hela細(xì)胞的存活率與刺激12h后Hela細(xì)胞的存活率相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示乙醇刺激Hela細(xì)胞6h和12h，Hela細(xì)胞的存活率無差別。

圖2　四種溶劑不同濃度對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響

同樣比較Hela被乙醇刺激6h與24h，12h與24h，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示當(dāng)乙醇濃度為0.25%時(shí)，刺激時(shí)間在24h內(nèi)，Hela細(xì)胞的存活率無差別。同理比較乙醇濃度為0.5%時(shí)，Hela細(xì)胞被刺激6h與24h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示乙醇濃度為0.5%時(shí)，Hela細(xì)胞被刺激6h與24h后的存活率有差別。當(dāng)Hela細(xì)胞被乙醇刺激同為12h時(shí)，以濃度為1%組同5%組相比較，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示同被乙醇刺激12h后，Hela細(xì)胞的存活率1%組與5%組有顯著性差別，5%組Hela細(xì)胞的存活率明顯低于1%組。當(dāng)Hela細(xì)胞被乙醇刺激同為6h時(shí)，同樣以濃度為1%組同5%組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示1%組與5%組Hela細(xì)胞的存活率有差別。結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中，乙醇作為有機(jī)溶媒時(shí)，濃度不可超過0.5%，與MTT檢測(cè)結(jié)果基本一致，刺激時(shí)間控制在12h為最佳(圖3)。

8乙醇對(duì)Hela細(xì)胞刺激12h流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)乙醇刺激12hHela細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組Hela細(xì)胞群99.99%集中在Q3象限；0.25%乙醇組有少部分細(xì)胞分散到其他3個(gè)象限，同時(shí)Q3象限細(xì)胞數(shù)量明顯減少；5%乙醇組可以看到明顯的有多部分細(xì)胞分散到Q1和Q2象限，Q3象限相較0.25%組有減少；10%乙醇組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，分散在4個(gè)象限的細(xì)胞也明顯稀疏(圖4)。乙醇刺激12hHela細(xì)胞顯微鏡下顯示：對(duì)照組細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞形態(tài)完好，呈梭狀或不規(guī)則形狀，貼壁。0.25%乙醇組細(xì)胞有部分呈圓形，不貼壁，透亮度增大，另一部分呈梭形。5%乙醇組可以看見細(xì)胞少部分貼壁，腫脹，同樣透亮度增大。10%乙醇組細(xì)胞已沒有細(xì)胞形態(tài)，皺縮呈黑色團(tuán)狀，周圍有光暈，細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(圖5)。鏡下觀察與流式檢測(cè)結(jié)果基本一致。

圖3　不同時(shí)間段相同濃度梯度下，乙醇對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響

討論

細(xì)胞體外培養(yǎng)計(jì)數(shù)及存活率檢測(cè)是細(xì)胞研究的基本技術(shù)指標(biāo)， DMSO、DMF、甲醇和乙醇是開展細(xì)胞研究最常用的四種有機(jī)溶劑。雖然目前已開展了四種有機(jī)溶劑對(duì)不同細(xì)胞株的毒性和干預(yù)效應(yīng)研究，但缺乏在同一細(xì)胞和培養(yǎng)環(huán)境四種溶劑的比較研究[11-13]，造成在有機(jī)溶劑選擇時(shí)缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究結(jié)果證實(shí)了四種有機(jī)溶劑對(duì)Hela細(xì)胞活性和生存率存在負(fù)向干預(yù)效應(yīng)，其影響程度從小到大依次為乙醇，DMSO、DMF、甲醇。同時(shí)研究結(jié)果表明在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用四種溶劑的體積比濃度上限為0.5%，否則會(huì)一定程度上導(dǎo)致Hela細(xì)胞的死亡，影響細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率。

研究結(jié)果顯示乙醇是體外細(xì)胞培養(yǎng)中較為理想的溶劑，但濃度不可超過0.25%，時(shí)間不可超過12h。研究還發(fā)現(xiàn)乙醇刺激24h后，濃度小于1%時(shí)，Hela細(xì)胞的數(shù)量和存活率均較6h、12h高，且與濃度呈正相關(guān)，提示較低濃度的乙醇可以刺激細(xì)胞增殖。結(jié)合MTT的實(shí)驗(yàn)原理[14]推測(cè)導(dǎo)致上述結(jié)果的原因可能為：低濃度的乙醇激活了琥珀酸脫氫酶，使三羧酸循環(huán)加快，從而使得OD值升高。同時(shí)低濃度的乙醇可以刺激Hela細(xì)胞的增殖，線粒體增多。但琥珀酸脫氫酶是否被激活以及其激活途徑本實(shí)驗(yàn)尚未涉及，有待進(jìn)一步研究。

研究還發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑培養(yǎng)的Hela細(xì)胞核明顯折疊，細(xì)胞腫脹沒有其他三種溶劑中的細(xì)胞明顯。推斷可能甲醇可能通過對(duì)細(xì)胞核的影響引起了細(xì)胞凋亡。因此建議在實(shí)驗(yàn)中，如溶質(zhì)分子可能進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，應(yīng)慎重考慮使用甲醇。

細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換、細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)影響著細(xì)胞的生存、結(jié)構(gòu)和功能，胞內(nèi)存在的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間又存在著復(fù)雜的交叉對(duì)話機(jī)制[15]，細(xì)胞的生存率、形態(tài)變化、染色質(zhì)凝縮、空泡出現(xiàn)等事件受到來自細(xì)胞內(nèi)外諸多因素的影響和調(diào)控[16-17]。離子探針、化學(xué)藥物、中藥藥效成分等在體外與細(xì)胞共培養(yǎng)過程中使用的有機(jī)溶劑雖然用量較少，可理論上都會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性和計(jì)數(shù)產(chǎn)生一定影響，甚至影響研究結(jié)果。

本次研究結(jié)果明確了四種常見有機(jī)溶劑在不同濃度時(shí)對(duì)離體培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)的干預(yù)效應(yīng)，對(duì)開展離體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)有機(jī)溶劑類型和濃度的選擇有一定指導(dǎo)意義，但溶劑濃度差異與細(xì)胞存活率和形態(tài)差異形成的機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

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(收稿:2016-02-11)

【中圖分類號(hào)】R392.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.02

The optimum concentration of four kinds of organic solvents such as DMSO，DMF，methyl alcohol，ethyl alcohol as solvents effect on Hela cell in vitro experiments

Department of Medical Technology of Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Yang XiaohangLi ShuLiu Wenqiet al

ABSTRACTObjective :To research the best concentration of four kinds of organic solvents DMSO 、DMF 、methyl alcohol、ethyl alcohol effect on Hela cell through measure the optical density value (OD value) of the four solvents under various survival rate. Provide guidance for select solvention microprobe and traditional Chinese medicine experiment. Methods: Using determined by MTT reagent combined enzyme standard meter method to concentrations of 9 Hela survival rate. Using 8 different concentrations of ethanol and 3 time periods in Hela cells with AnnexinⅤ-FiTC/Pi marked, and then characteristics on the apoptosis of Hela cells by flow cytometry method. Result: The best concentration of ethyl alcohol could not more than 0.25%;The bestconcentration of DMSO could not more than 0.5%;The best concentration of DMF could not more than 0.1%;The best concentration of methyl alcohol was between 0.1% and 0.5% . Conclusion: Ethyl alcohol is the best one of these 4 organic solvents which used in experiment of Hela cell in vitro. You’d better use the concentration less than 0.25%;stimulate time can not more than 12 hours. if there is something wrong with the solubitity, the order of these 4 organic solvents is ethyl alcohol, DMSO 、DMF and methyl alcohol. Take care ,the concentration must be less than 0.5%.

KEY WORDSHela cellsDimethyl sulfoxideFormamidesMethanolEthanolCell culture techniquesIntervention studies

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173156)

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14JK1188)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心

▲陜西省中醫(yī)藥研究院