蔡宇憶，葉永浩，楊麗瑩，黃玉梅，吳志堅，馬永德，李書淵

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HPLC-ELSD法測定膽南星中膽酸類成分的含量

蔡宇憶1，葉永浩1，楊麗瑩1，黃玉梅2，吳志堅2，馬永德2，李書淵1

（1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市藥材公司中藥飲片廠，廣東 廣州510360）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法測定膽南星中4種膽酸類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法。方法 色譜柱為WELCH AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%（體積分?jǐn)?shù)）冰醋酸（體積比60∶40），柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測器為ELSD，載氣流速為2.2 mL/min，漂移管溫度為90℃。結(jié)果膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸均在定量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為97.62%、98.38%、97.32%、97.86%。結(jié)論本方法操作簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于膽南星中膽酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：膽南星；HPLC-ELSD法；膽酸；豬去氧膽酸；鵝去氧膽酸；去氧膽酸

2015年版《中國藥典》所記載的“膽南星”為制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或為生天南星細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成［1］。目前，膽南星療效成分不完全清楚，膽汁為膽南星主要加工輔料，據(jù)現(xiàn)代實驗藥理學(xué)研究報道膽汁具有一定鎮(zhèn)靜、安神、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)作用［2-3］，因此測定膽汁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以部分反映膽南星藥用質(zhì)量。古代膽南星炮制一般用牛膽汁，現(xiàn)在逐步發(fā)展成用牛膽汁、豬膽汁、羊膽汁，甚至可以采用混合膽汁。2015年版《中國藥典》“膽南星”項下尚無檢查項和含量測定項，其質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)還未完善。由于有關(guān)原藥材天南星的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究比較少，與傳統(tǒng)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-24 15：34 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160524.1534.003.html藥效相對應(yīng)的活性成分還不清楚，不容易從中選擇質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，所以本研究參照文獻(xiàn)［4-5］，選用膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸作為對照品，首次建立HPLC-ELSD法同時測定膽南星中4種膽酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（日本島津公司），WELCH AQC18色譜柱，Dikma EasyGuard保護(hù)柱；3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）；XWK-Ⅲ無油空氣泵（天津市津分分析儀器制造有限公司）；BP211D十萬分之一電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；AY120萬分之一電子天平（日本島津公司）；SK250HP科導(dǎo)超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；ANKE TGL-16G-A恒溫高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：10078-0013），豬去氧膽酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-14060906），鵝去氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110806-200303），去氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：724-8601）；甲醇（分析純）；乙腈（色譜純）；蒸餾水。

10批膽南星樣品均產(chǎn)自四川，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院李書淵教授鑒定符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，其來源詳見表1。

表1 10批膽南星樣品來源信息表Table 1 The information of 10 batches of Arisaema cum Bile

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

分別取膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸分別為0.205、1.024、0.952、0.398 mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取膽南星（過4號篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，稱定質(zhì)量，加甲醇補足減失質(zhì)量，置離心管中離心（12 000 r/min）10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件及適應(yīng)性試驗

色譜柱：WELCH AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Dikma EasyGuard保護(hù)柱；流動相：乙腈-0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）冰醋酸（體積比60∶40），流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；蒸發(fā)光檢測器載氣流速：2.2 mL/min，漂移管溫度：90℃。精密吸取混合對照品、供試品溶液各20 μL，按上述條件進(jìn)行測定。色譜圖見圖1。

1.膽酸；2.豬去氧膽酸；3.鵝去氧膽酸；4.去氧膽酸。圖1 混合對照品（A）、膽南星供試品（B）溶液的HPLCELSD色譜圖Figure 1 The HPLC-ELSD chromatogram of mixed references （A）and Arisaema cum Bile（B）

2.4 線性關(guān)系的考察

分別取膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸混合對照品溶液0.1、1、2.5、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。分別精密吸取各混合對照品溶液20 μL，按照“2.3”項下條件進(jìn)行測定。以對照品進(jìn)樣量對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。由表2可知，4種膽酸成分均在測定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 膽南星中4種膽酸類成分的線性范圍、回歸方程及r值Table 2 　The linear relationship，regression equations and rvalues of four cholic acids in Arisaema cum Bile

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20 μL，按“2.3”項下條件進(jìn)行測定，重復(fù)6次，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其RSD值分別為0.38%、0.86%、0.84%、1.33%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后分別進(jìn)樣，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其RSD值分別為1.81%、1.48%、 1.72%、1.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)操作6份。分別按“2.3”項下色譜條件測定并記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積。計算得膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.86%、1.98%、2.21%、2.50%，表明方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知膽酸成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.25 g，共6份，精密稱定，分別加入適量膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸對照品溶液，分別按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其平均回收率分別為97.62%、98.38%、97.32%、97.86%，RSD值分別為2.11%、1.96%、1.86%、2.48%。結(jié)果見表3。

表3 膽南星中4種膽酸類成分的加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 The recovery results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=6）

2.9 樣品測定

分別取10批膽南星樣品粉末，各0.5 g，精密稱定，每批重復(fù)操作2份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下條件測定并記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸的峰面積，分別計算4種膽酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表4。

表4 膽南星中4種膽酸成分及總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果Table 4 The determination results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=2）　w/%

3 討論

本實驗旨在研究建立同時測定膽南星中4種膽酸類成分的方法，從而為制定膽南星的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。由張能榮［6］對牛、羊、豬膽汁中15種成分的研究結(jié)果可知：牛、羊膽汁中無豬去氧膽酸，豬膽汁中不含膽酸與去氧膽酸，而鵝去氧膽酸為3種膽汁共有的成分，據(jù)此可以判斷市售的膽南星藥材在炮制過程中加入了何種膽汁。從本試驗結(jié)果可以看出，所檢測10個批次的膽南星中采用的膽汁輔料大多是豬膽汁，部分批次采用的是混合膽汁；各樣品膽酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，可能是由于加工過程中加入膽汁類型和加入膽汁量不同導(dǎo)致的——因此把膽酸類成分作為膽南星的質(zhì)量控制指標(biāo)是必不可少的。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本法操作簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于膽南星膽酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定和質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：245.

［2］王凱平，石朝周.動物膽汁藥用研究的概況與展望［J］.中國中醫(yī)藥科技，2000，7（5）：350-352.

［3］白萬富，鞠愛華，楊乾.牛膽汁的化學(xué)成分及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（2）：149-151.

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［6］張能榮.牛羊膽汁質(zhì)量的研究［J］.中草藥，1983，14（7）：15.

（責(zé)任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0311-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032301

收稿日期：2016-03-23

基金項目：廣州市荔灣區(qū)科技計劃（20133115008）

作者簡介：蔡宇憶（1991—），女，2013級碩士研究生，Email：406371983@qq.com；通信作者：李書淵（1963—），女，教授，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email：1018720684@qq.com。

Determination of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile by HPLC-ELSD

CAI Yuyi1，YE Yonghao1，YANG Liying1，HUANG Yumei2，WU Zhijian2，MA Yongde2，LI Shuyuan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Materia Company，Guangzhou 510360，China）

AbstractObjective To develop a HPLC-ELSD method for the determination of cholic acids from Arisaema cum Bile.Methods WELCH AQ-C18column 4.6 mm×250 mm 5 μm was employed and eluted at 30℃with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.2%glacial acetic acid 60∶40 and the flow rate was 1.0 mL/min.The drift-tube temperature of ELSD was 90℃ and the flow rate of air was 2.2 mL/min. Results Cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid and deoxidation cholic acid had good linearity within the quantitative range and their mean recovery ratios were 97.62% 98.38% 97.32%and 97.86% respectively.Conclusion The method was simple and accurate which could be used for the determination and quality control of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile.

Key wordsArisaema cum Bile HPLC-ELSD cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid deoxidation cholic acid