殷　悅，熊德琪，張欣欣，何　山，段美娜，呂昕璐

(大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，遼寧 大連 116026)

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消油劑處理180#燃料油對黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)抗氧化酶系統(tǒng)影響的初步探究*

殷悅，熊德琪*，張欣欣，何山，段美娜，呂昕璐

(大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，遼寧 大連 116026)

摘要:本文研究了180#燃料油分散液(Water-Accomodated Fractions, WAFs)和乳化液(Chemical Enhanced Water-Accomodated Fractions, CEWAFs)對黃海膽(Glyptocidaris Crenularis)腸和性腺組織抗氧化酶系統(tǒng)的毒性影響。將黃海膽暴露在不同質量濃度的WAFs和CEWAFs中，96 h后提取其腸和性腺，測定暴露期抗氧化系統(tǒng)各酶的活性；再用海水培養(yǎng)，7 d后進行恢復期抗氧化酶活性測定。研究結果顯示，WAFs和CEWAFs對抗氧化酶活性均呈現(xiàn)先誘導后抑制效應，暴露期海膽腸組織的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)在WAFs中的最大誘導率分別為40.21%，46.03%，26.01%，23.89%；在CEWAFs中的最大誘導率分別為38.60%，48.83%，29.34%，27.86%。實驗組性腺組織抗氧化酶活性最大誘導率均高于腸組織，且恢復期與暴露期規(guī)律基本一致。由此可知，黃海膽性腺組織較腸組織對石油烴更為敏感。通過對比可以得出海膽CAT、SOD對石油烴污染的敏感度更高，更適合作為監(jiān)測海洋石油烴污染的生物標志物。對照組間差異不明顯，說明消油劑本身對生物無明顯急性毒性效應。

關鍵詞：消油劑；180#燃料油；黃海膽；抗氧化酶系；酶活性

隨著全球一體化的趨勢日益推進，我國對外經貿往來也更加頻繁，并且由于水路運輸憑借費用低、運輸距離長、運輸噸位大等優(yōu)勢成為主要運輸方式，故沿海地區(qū)船運事業(yè)蓬勃發(fā)展，船用燃料油已然占據(jù)燃料油市場的主導地位[1-4]。船用燃料油主要由石油的裂化殘渣油和直餾殘渣油制成，主要成分含有非烴化合物、膠質、瀝青質等[5]。本實驗所用的180#燃料油，粘度大熱值高，化學性質穩(wěn)定不易降解。當其聚集于深層海域，就會污染海洋生態(tài)環(huán)境，破壞底棲生物結構，從而給漁業(yè)帶來不利影響[6]。目前，雖已研發(fā)出消油劑來清理海面上的油污，但其給海洋生物帶來的危害也是不容忽視的[7-8]。Hannah等[9]以藍蟹幼體作為受試生物，研究了消油劑對其急性毒性效應，結果表明隨著消油劑質量濃度增加藍蟹幼體活動靈活性下降。E. Cotou等[10]通過消油劑對生長期鹵蟲無節(jié)幼體的三磷酸腺苷酶促系統(tǒng)毒性作用研究，發(fā)現(xiàn)了消油劑對生物的毒性效應。Gong等[11]，Etkinds[12],Lessard和Demarlog[13],Xia等[14]研究表明，消油劑是由表面活性劑及含有大量多環(huán)芳烴等毒性極強的有機溶劑和助劑組成，故其不僅不能徹底清除油污而且會造成二次污染。

目前，已有大量關于石油烴對海洋中藻類、浮游微生物、魚類、甲殼類等海洋生物的毒性效應影響研究[15-20]。國內外很多學者對抗氧化酶防御系統(tǒng)的研究表明，生物體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉硫酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽含量(GSH)等活性(含量)升高或降低程度往往與機體受毒性影響程度有著一定關系[21-25]。因此,抗氧化酶系統(tǒng)的活性被作為生物毒理研究的重要指標，對它的測定也是判斷環(huán)境污染的警示性手段。本文選用180#燃料油和GM-2型消油劑對黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)進行急性毒理實驗，測定其SOD，CAT，GST酶活性和GSH含量，為海洋溢油污染對底棲生物的影響評估提供實驗基礎和參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1受試生物

本實驗選用將黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)置于室溫(13±2) ℃、鹽度31.4的實驗室養(yǎng)3個月后，選擇生理性狀正常、反應敏捷、狀態(tài)健康、大小一致的海膽進行實驗。實驗用海膽直徑(5±0.2) cm左右、體重(57.4±3.2) g、30個月齡左右。

1.1.2受試油品

本實驗選用180#船用燃料油作為受試油品，黏度大，在50 ℃時其運動黏度小于180，熱值高，含有大量的非烴化物、膠質和瀝青質，由大連船舶燃料公司提供。

本實驗選用GM-2型消油劑作為實驗消油劑，購自青島光明環(huán)保技術有限公司。

1.1.3實驗儀器

JY92-Ⅱ型細胞破碎儀、微型離心機(Beckman Microfuge 18)、冷凍臺式離心機(Thermo Fisher)、酶標儀、基因研究型超純水機(FJY2002-UVF-P)、DK-8D型電熱恒溫水浴鍋、FA1004型電子天平、JDS-109U紅外測油儀、JB-3型磁力攪拌器、Beckman J2-MC型高速冷凍離心機、HH-S水浴鍋等。

1.1.4實驗試劑

無水乙醇(分析純)、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)、抗氧化酶活性測試試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)、NaCl(分析純)、CCl4(紅外測油專用)等。

1.2受試液制備

1.2.1180#燃料油WAFs(Water-Accomodated Fractions)的制備

將180#燃料油與過濾海水按一定質量體積比例混合，置于2 L燒杯中封口避光，磁力攪伴器低速攬拌24 h，控制漩渦高度為總體系高度的25%～30%。靜置6 h后，分離下層水相即為WAF母液。將母液置于4 ℃環(huán)境中避光保存，實驗前稀釋至所需濃度。

1.2.2180#燃料油CEWAFs(Chemical Enhanced Water-Accomodated Fractions)的制備

將180#燃料油與過濾海水按一定的質量體積比混合，并加入油品質量20%的消油劑，攬拌24 h后靜置6 h，分離下層水相即為CEWAFs母液，置于4 ℃環(huán)境中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

以上受試液制備均為預實驗所用，油水配比濃度可按實驗具體要求改變。

1.2.3消油劑空白對照組受試液制備

在2 L海水中加入油品質量20%的GM-2型消油劑，按照上述方法與上述2種受試液一同攪拌24 h后，靜置6 h，分離下層水相，置于4 ℃環(huán)境中避光貯存待用。

1.2.4實驗濃度梯度設定

根據(jù)預實驗測得的96 h-EC50值為實驗組的WAFs組和CEWAFs組設置5個質量濃度梯度，分別用紅外測油儀測出其實際質量濃度(表1)。

表1　質量濃度梯度設定

1.3實驗方法

1.3.1暴露實驗

暴露期分為實驗組和對照組。實驗組包括WAFs組和CEWAFs組，將18只黃海膽置于32 cm×16.5 cm×24 cm玻璃缸中，暴露在根據(jù)預實驗所設定的0.312 5，0.625，1.25，2.5和5 g/L五組質量濃度WAFs和CEWAFs(總體積為2 L)中培養(yǎng)。對照組為海水空白對照和消油劑空白對照，按照最佳分散比例，消油劑對照組受試液2 L海水中加入2 g消油劑；海水對照組即受試液僅為2 L海水。進行24 h更換一次受試液的半靜態(tài)暴露，96 h后，從容器中隨機選取3只海膽用于實驗。

1.3.2恢復實驗

暴露期后只用2 L海水培養(yǎng)，24 h換1次水，7 d后按上述方法進行實驗。

1.3.3樣品預處理

取各實驗組及對照組中海膽部分腸和性腺組織，在4 ℃生理鹽水(0.86%)中漂洗，用濾紙拭干后，置于10 mL小燒杯中，稱重并記錄。向小燒杯中加入2/3體積的質量為組織樣品9倍的生理鹽水，用醫(yī)用剪刀盡快剪碎組織，整個過程應將小燒杯置于冰水中進行。

將超聲粉碎機的電流調至400A，超聲時間為5 s/次，間隔10 s，重復5次，即得到組織勻漿。

將制備好的10%組織勻漿用低溫高速離心機在4 ℃、轉速為2 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用于后續(xù)實驗。

1.3.4酶活性測定

蛋白含量測定需按照考馬斯亮藍試劑盒說明書進行操作。

抗氧化酶活性的測定參照SOD，CAT，GSH-Px，GST試劑盒說明書進行。

1.4數(shù)據(jù)處理

誘導率計算公式：

誘導率=(Ni-N)/N×100%，

(1)

式中，Ni為實驗組受誘導后酶活性(含量)；N為對照組酶活性(含量)。

各酶活性的計算公式均根據(jù)試劑盒內說明書進行計算。實驗結果數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。當0.01≤p≤0.05時認為差異顯著，p≤0.01時認為差異極顯著。

2結果與分析

2.1暴露期黃海膽體內酶活性變化

暴露在油水配比質量濃度分別為0.312 5，0.625，1.25，2.5和5 g/L的燃料油WAFs和CEWAFs中96 h的黃海膽，其腸和性腺組織中CAT、SOD、GST酶活性及GSH含量不僅實驗組與對照組差異顯著，而且各實驗組間亦存在顯著差異，圖1～圖4可清晰反映出2種暴露液對黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性的影響。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大?。弧癮”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖1　暴露期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的CAT酶活性影響Fig.1　Effect of WAFs and CEWAFs on CAT activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the exposure period

由圖1可知，黃海膽經不同質量濃度的WAFs和CEWAFs暴露96 h后，其腸和性腺組織的CAT酶活性變化趨勢大致相同，均先升高后降低。質量濃度為0.625 g/L到1.25 g/L時實驗組與對照組存在顯著差異，說明暴露液對CAT酶活性誘導作用顯著。當油水配比質量濃度為1.25 g/L時，腸和性腺的CAT酶活性達到最大誘導值，即在WAFs和CEWAFs中分別為120.72，103.19 U/mgprot和123.02，114.14 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖2　暴露期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的SOD酶活性影響Fig.2　Effect of WAFs and CEWAFs on SOD activity of G. Crenularis in intestine and gonad during exposure period

由圖2可知，實驗組腸和性腺組織SOD酶活性明顯高于對照組，說明WAFs和CEWAFs對SOD顯著誘導。而酶活性總體呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，說明一定質量濃度時誘導作用減弱，出現(xiàn)抑制效應。WAFs組油水配比質量濃度為2.5 g/L時，SOD酶活性出現(xiàn)最大誘導值，腸為113.06 U/mgprot、性腺為113.67 U/mgprot；而CEWAFs組，油水配比質量濃度為1.25 g/L時，SOD酶活性達到最大誘導值，腸和性腺分別為119.57，116.95 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖3　暴露過程中WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的GST酶活性影響Fig.3　Effect of WAFs and CEWAFs on GST activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the exposure period

由圖3可知，暴露期黃海膽腸和性腺組織的GST酶活性均隨著WAFs和CEWAFs質量濃度的升高先增大后減小。當油水配比質量濃度0.312 5 g/L時各組織GST酶活性均WAFs組低于CEWAFs組,說明此質量濃度時CEWAFs組對GST酶活性誘導強度大于WAFs。而油水配比質量濃度5 g/L時，情況則相反。當油水配比濃度為2.5 g/L時，暴露在WAFs中的海膽腸和性腺中GST酶活性均最大，即最大誘導值為127.82,128.46 U/mgprot；而油水配比濃度為1.25 g/L時，CEWAFs中海膽腸和性腺中GST酶活性均最大，最大誘導值為140.19,134.13 U/mgprot。

注：“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖4　暴露期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的GSH含量影響Fig.4　Effect of WAFs and CEWAFs on GSH content of G. Crenularis in intestine andgonad during the exposure periodd

由圖4可知，當油水配比質量濃度為0.312 5 g/L時，腸和性腺組織中GSH含量均略有上升，說明2種暴露液對GSH酶含量的誘導作用較弱。隨著油水配比質量濃度的升高，GSH含量增加，說明2種受試液對GSH酶活性誘導效應增強。達到最大值后酶活下降，發(fā)生抑制作用。當油水配比質量濃度為1.25 g/L時，暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽腸和性腺GSH含量均達到最大誘導值，即腸中分別為178.67，191.03 μmol/L，性腺中分別為170.81，187.97 μmol/L。而且相鄰濃度組之間基本上存在極顯著差異。

表2　暴露期WAFs與CEWAFs對黃海膽抗氧化酶活性誘導效應的比較

由表2可見，WAFs組油水配比質量濃度為2.5 g/L時，腸和性腺組織中的SOD和GST均達到最大誘導率，即該質量濃度對SOD和GST酶活性誘導作用最強；而CEWAFs組油水配比質量濃度在1.25 g/L時對CAT，SOD，GST，GSH酶活性誘導強度最大。從最大誘導率來看，無論是腸還是性腺，SOD和CAT均為最大，可以說明二者對暴露液的誘導作用敏感度最高。

2.2恢復期黃海膽體內酶活性變化

經過7 d恢復期，海膽腸和性腺中CAT，SOD和GST酶活性和GSH含量變化趨勢與暴露期大體一致，如圖5～圖8。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖5　恢復期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的CAT酶活性影響Fig.5　Effect of WAFs and CEWAFs on CAT activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

由圖5可見，恢復期的黃海膽腸和性腺組織的CAT酶活性發(fā)生了顯著變化，相鄰質量濃度組之間表現(xiàn)出極顯著差異，變化趨勢隨著暴露期油水配比質量濃度的增加呈先增加后降低?；謴推谕┞镀谙啾?，實驗組的酶活性均有所降低，說明活性有所恢復。暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽均在恢復期油水配比質量濃度為1.25 g/L時腸和性腺組織的CAT酶活性最大，腸中最大誘導值WAFs組為111.98 U/mgprot、CEWAFs組為99.68 U/mgprot，性腺中最大誘導值WAFs組為115.84 U/mgprot，CEWAFs組為101.31 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白,表示每毫克蛋白中酶活性大?。弧癮”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖6　恢復期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的SOD酶活性影響Fig.6　Effect of WAFs and CEWAFs on SOD activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

經過7 d恢復期，黃海膽腸和性腺中SOD酶活性同暴露期相比，對應油水配比質量濃度下的SOD酶活性與對照組差異性減弱，隨著WAFs和CEWAFs質量濃度的增大酶活性仍呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但變化程度減小。海膽腸和性腺組織SOD酶活性最大誘導值出現(xiàn)在質量濃度為2.5 g/LWAFs組，即109.47,109.06 U/mgprot。CEWAFs組腸和性腺組織的SOD酶活性達到最大誘導值的油水配比質量濃度為1.25 g/L，即112.33,108.70 U/mgprot(圖6)。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白,表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖7　恢復期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的GST酶活性影響Fig.7　Effect of WAFs and CEWAFs on GST activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

當油水配比質量濃度為0.312 5 g/L時，性腺組織中實驗組與對照組無顯著差異，油水配比質量濃度為0.625，1.25和2.5 g/L時，實驗組與對照組均呈現(xiàn)極顯著差異，而且相鄰濃度組之間亦差異顯著，腸組織中GST酶活性的差異形態(tài)與性腺組織基本一致。與暴露期WAFs和CEWAFs油水配比質量濃度對應的腸和性腺中GST酶活性均隨著配比質量濃度的增大出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，而這種變化程度和暴露期相比較小，最大誘導值也下降，暴露期WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導值分別為132.26 U/mgprot和140.19 U/mgprot；恢復期對應WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導值分別為125.04 U/mgprot和131.29 U/mgprot(圖7)。

注：“a”表示該組數(shù)據(jù)和對照空白組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析結果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖8　恢復期WAFs和CEWAFs對黃海膽腸和性腺的GSH含量影響Fig.8　Effect of WAFs and CEWAFs on GSH content of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

如圖8所示，和暴露期相比，經過7 d恢復腸和性腺中試驗組GSH的含量有不同程度的降低，隨著油水配比質量濃度的增大，含量出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，但變化程度明顯下降。當油水配比質量濃度為0.312 5，0.625，1.25和2.5 g/L時，試驗組和空白對照組的GSH含量呈現(xiàn)顯著差異，相鄰濃度組之間亦表現(xiàn)顯著差異。在油水配比質量濃度為1.25 g/L時，腸中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中均出現(xiàn)最大誘導值，分別為172.90，182.81 μmol/L。而性腺中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中亦均出現(xiàn)最大誘導值，分別為166.84，181.35 μmol/L。

表3　恢復期WAFs與CEWAFs對黃海膽抗氧化酶活性誘導效應的比較

與暴露期相比，最大誘導率均有所下降。但WAFs和CEWAFs組對各酶活性的最大誘導濃度與暴露期相同。經過對比發(fā)現(xiàn)，WAFs組性腺中SOD酶活性恢復程度較其他3種酶相比最為顯著，CEWAFs組性腺中CAT和SOD酶活性均顯著恢復。

3討論

劑量-效應柱形圖是被采用最頻繁的生物急性毒性研究結果的反應形式[26]，它能清晰反映出想要對比的數(shù)值之間的差異情況。暴露期和恢復期各實驗組的抗氧化酶活性均不同程度的高于對照組，說明WAFs和CEWAFs對腸和性腺的抗氧化酶系統(tǒng)均起著不同程度的誘導作用，從整體趨勢看誘導強度先增大后減小。

在不同質量濃度組之間進行比較，0.312 5，0.625，1.25 g/L的CEWAFs對黃海膽的抗氧化酶誘導作用依次增強，達到最大誘導值后開始減弱，抗氧化酶活性開始下降。而WAFs對于SOD和GST酶活性最大誘導濃度達到2.5 g/L，CAT和GSH酶活性最大誘導濃度均為1.25 g/L。由此說明從最大誘導濃度開始，生物體細胞受損，抗氧化酶系統(tǒng)被破壞。盡管CEWAFs濃度約WAFs的3倍，但CEWAFs組2個時期的抗氧化酶活性整體卻并沒有高出WAFs組3倍。這與Milinkovitch等[27]的研究中得出了相同的結果，加入化學消油劑的暴露液(CD)總石油烴濃度近似原油分散液(MD)總石油烴濃度3倍，而所測得的GST和GPx均是CD略高于MD，而SOD、CAT則MD略高于CD，其原因可能是CD的PAH含量較MD低，ROS較少，故不能充分激發(fā)抗氧化酶活性[28]。這同時也說明了化學消油劑的使用，在一定程度上降低了石油中PAH的含量。

從表2和表3來看，不同組織之間受WAFs和CEWAFs的誘導影響規(guī)律為，性腺組織大于腸組織。且腸和性腺的SOD和CAT活性對于暴露液誘導和抑制作用的敏感性較GST和GSH要相對強一些。余群等[29-32]認為SOD和CAT活性更能在一定程度上反映生物毒性機制，因此更適合作為溢油污染的生物標志物。其研究石油烴脅迫對海洋生物的急性毒性影響結果顯示，SOD和CAT酶活性隨著暴污濃度的上升而增強，達到最大誘導值后便下降。說明SOD和CAT活性的增強是機體對抗氧化脅迫的一種調節(jié)機制，然而這種適應性調節(jié)能力有限，當劑量過高氧化脅迫壓力增強時，氧化損傷在所難免，酶活降低，從而使機體細胞受損出現(xiàn)病變致畸甚至致死。本文中SOD和CAT活性受影響變化程度較為顯著，恢復程度較好，因此二者可看作抗氧化防御機制的主要調節(jié)功能酶。

GSH是生物體內一種重要的抗氧化劑，其特點是水溶性較強。在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)作用下把 H2O2還原為 H2O，其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)。而GSSG又可被還原酶催化受H轉化為GSH，進而持續(xù)清除活性氧自由基，減輕氧化脅迫毒性影響。本實驗中，GSH含量實驗組始終高于對照組且CEWAFs組高于WAFs組，這與黃志斐等[33]研究BDE209脅迫對翡翠貽貝(Perna viridis)SOD，MDA和GSH的影響中結論相一致。表明隨著暴露液濃度上升，GSH大量消耗同時也大量合成，故活性增加。達到最大誘導濃度后，機體氧化損傷加重，自身調節(jié)機制無法有效緩解氧化脅迫壓力，GSH消耗遠大于合成，故含量降低。

Milinkovitch等[34]和Marques等[35]在研究原油及消油劑對鯔魚心臟組織生物標記物毒性效應中表明，CD組GST酶活性高于MD組，二者均顯著高于對照組并且此規(guī)律在暴露期和恢復期相同，此結論與本文相一致。GST可促進氧化型PAH與GSH結合，故GST增加則GSH會有所減少，但本實驗中并沒用體現(xiàn)出此規(guī)律。

4結論

本文探究了180#燃料油WAFs和CEWAFs對黃海膽抗氧化酶活性的影響，得出如下結論：

1)暴露后的黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性隨著暴露液濃度的增加出現(xiàn)先誘導后抑制的趨勢，說明機體在WAFs和CEWAFs暴露下既可產生適應性“毒性興奮”作用，表現(xiàn)為酶活性因受到誘導而升高；也受到抑制產生中毒反應，表現(xiàn)為各酶活力下降。

2)CEWAFs組和WAFs組的各酶活性最大誘導濃度均相同，說明二者對黃海膽抗氧化酶活性的效應濃度大致相同，然而二者質量濃度相差懸殊，這其中具體的機制還有待進一步的研究。

3)從抗氧化酶活性上來看，CAT和SOD這兩種酶變化幅度較大，表現(xiàn)較為活躍，與其他學者研究作對比分析，得出結論，CAT和SOD可看作抗氧化防御機制的主要調節(jié)功能酶。二者也更適合作溢油污染評估分析的生物標記物。

4)暴露期腸和性腺的各酶活性最大誘導率均為CEWAFs組高于WAFs組，說明經過化學消油劑增溶后的180#燃料油乳化液毒性效應要高于燃料油單獨作用的毒性效應。同時也反映了目前噴灑消油劑這種海上溢油的處理方法還有待進一步研究和改善，從而使溢油事故得到更加優(yōu)化高效的防治。

參考文獻(References)：

[1]HUANG J Z. China’s fuel oil market today and outlook[J].Sino-Glabol Energy, 2013, 18(9): 73-78. 黃金珠. 中國燃料油市場現(xiàn)狀與展望[J].中外能源, 2013, 18(9): 73-78.

[2]FU B. The current state and future development prospects of the Chinese market for boat fuel[J].International Petroleum Economics, 2009,(12): 23-26. 付斌. 中國船供油市場發(fā)展現(xiàn)狀及前景展望[J].國際石油經濟, 2009, (12): 23-26.

[3]TIAN G W. The simple analysis of admiralty fuel oil development[J].Petroleum & Petrochemical Today, 2010, 188(8): 17-20. 田廣武. 船舶燃料油發(fā)展淺析[J].當代石油石化, 2010, 188: 17-20.

[4]ZUO L. The prospect of admiralty fuel oil market and techno-economic analysis of its production[J].Petroleum & Petrochemical Today, 2008, 8(16): 21-24. 左黎. 船舶燃料油市場前景及生產技術經濟分析[J].當代石油石化, 2008, 16(8): 21-24.

[5]ZHU H Y. Sinopec marine fuel oil business development plan research[D].Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2013. 朱洪印. 中國石化船用燃料油業(yè)務發(fā)展規(guī)劃研究[D].北京: 北京化工大學, 2013.

[6]FANG X, YANG W. The current status of petroleum pollution of the ocean and the prevention[J].Environmental Science and Management, 2007, 32(9): 78-80. 方曦, 楊文. 海洋石油污染研究現(xiàn)狀及防治[J].環(huán)境科學與管理, 2007, 32(9): 78-80.

[8]FISHER W S, FOSS S S. A simple test for toxicity of number 2 fuel oil and oil dispersants to embryos of grass shrimp, palaemonetes pugio[J].Mar Pollut Bull, 1993, 26(7): 385- 391.

[9]HANNAH V P, MITCHELMORE C L. Acute toxicity of current and alternative oil spill chemical dispersants to early life stage blue crabs (Callinectes sapidus)[J].Chemosphere, 2015, 128: 14-20.

[10]COTOU E, CASTRITSI-CATHARIOS I, MORAITOU-APOSTOLOPOULOU M. Surfactant-based oil dispersant toxicity to developing nauplii of Artemia: effects on ATPase enzymatic system[J].Chemosphere, 2001, 42: 959-964.

[11]GONG Y Y, FU J, O'REILLY S E. Effects of oil dispersants on photodegradation of pyrene in marine water[J].Journal of Hazardous Materials, 2015, 287(28): 142-150.

[12]ETKINDS. Oilspill dispersants:From technologytopolicy[M].Arlington: Cutter Information Corp, 1999, 77-78.

[13]LESSARD R R, DEMARCOG. The significance of oil spill dispersants[J].Spill Science & Technology Bulletin, 2000, 6(1): 59-68.

[14]XIA W X, LIN H T, LI J C, et al. Application of dispersants in pollution control of oil spill[J].Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control, 2004, 5(7): 39-43.夏文香, 林海濤, 李金成, 等. 分散劑在溢油污染控制中的應用[J].環(huán)境污染治理技術與設備, 2004, 5(7): 39-43.

[15]WANG J L, LIU C G, FENG J F, et al. Literature review of the effects of petroleum hydrocarbons on marine phytoplankton[J].Environmental Pollution & Control, 2011, 4(4): 81-86.王君麗, 劉春光, 馮劍豐, 等. 石油烴對海洋浮游植物生長的影響研究進展[J].環(huán)境污染與防治, 2011, 4(4): 81-86.

[16]MICHAEL L, RACHEL P. Toxicities of oils, dispersants and dispersed oils to algae and aquatic plants: Review and database value to resource sustainability[J].Environmental Pollution, 2013, 180: 345-367.

[17]HUANG Y J, CHEN Q Z, ZENG J N, et al. The impact of oil pollution on marine phytoplankton community growth change[J].Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(2): 513-521.黃逸君, 陳全震, 曾江寧, 等. 石油污染對海洋浮游植物群落生長的影響[J].生態(tài)學報, 2011, 31(2): 513-521.

[18]SAMMUHM, NICKLESS G. Petroleum hydrocarbons in marinesediment and animals from the island of Malta[J].Environmental Pollution, 1978, 16(1): 17-30.

[19]RODRIGO A, CAMMIE H, EDWARD J B. Toxicity of dispersant Corexit 9500A and crude oil to marine microzooplankton[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2014, 106: 76-85.

[20]EL SHEEKH M M, EL NAGGAR A H, OSMAN M E H, et al. Comparative studies on the green algaeChlorellahomosphaeraandChlorellavulgariswish respect to oil pollution the river Nile[J].Water, Air and Soil Pollution, 2000, 124(1): 79-83.

[21]REID D J, MACFARLANE G R. Potential biomarkers of crude oil exposure in the gastropod mollusc, Austrocochlea porcata: laboratory and manipulative field studies[J].Environmental Pollution, 2003, 126: 147-155.

[22]CHEN J C, MENG S L, HU G D, et al. Effects of low concentration of Atrazine on catalase activity in carassius auratus[J].Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(3): 1151-1156. 陳家長, 孟順龍, 胡庚東, 等. 低濃度阿特拉津對鯽魚過氧化氫酶(CAT)活性的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報, 2008, 27(3): 1151-1156.

[23]WANG Y, ZHENG W Y, YU Q. Effects of fuel oil exposure on the activity of sedium-dependent glutathione peroxidase in viscera mass ofPagrosomusmajorlarvae[J].Acta Scientiae Circumstantiae, 2000, 20(1): 91-94. 翁妍, 鄭微云, 余群. 石油污染對真鯛幼體谷胱甘肽過氧化物酶影響的研究[J].環(huán)境科學學報, 2000, 20(1): 91-94.

[24]SHEN A L, SHEN X Q. Effects of diesel fuel on the superoxide dismutase and catalase of zebra fish[J].Marine Fisheries, 2005, 27(4): 314-318. 沈盎綠, 沈新強. 柴油對斑馬魚超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的影響[J].海洋漁業(yè), 2005, 27(4): 314-318.

[25]HU G F, LI Z, LIANG H W, et al. Effects of Cadmium on SOD and CAT in hepatopancreas, antennary gland and gill of procambarus clarkii[J].Journal of Agro-Environment Science, 2009, 28(9): 1806-1811. 呼光富, 李忠, 梁宏偉, 等. 鎘對克氏原螯蝦肝胰腺觸角腺及鰓中SOD和CAT活性的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報, 2009, 28(9): 1806-1811.

[26]ZHENG W Y, WENG E Q. Environmental Toxicicology Outline[M].Xiamen: Xiamen University Press, 1993: 200-203. 鄭微云,翁恩琪.環(huán)境毒理學概論[M].廈門:廈門大學出版社,1993: 200-203.

[27]MILINKOVITCH T, NDIAYE A, SANCHEZ W, et al. Liver antioxidant and plasma immune responses in juvenile golden grey mullet(Lizaaurata) exposed to dispersed crude oil[J].Aquatic Toxicology, 2011, 101: 155-164.

[28]SUN F H, ZHOU Q X, ZHANG Q R. Toxic effects of petroleum hydrocarbons and copper on PolychaeteNereisdiversicolorand on its antioxidant enzyme systems[J].Environmental Science, 2006, 27(7): 1415-1419. 孫福紅,周啟星,張倩如.石油烴、Cu2+對沙蠶的毒性效應及對其抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J].環(huán)境科學, 2006, 27(7): 1415-1419.

[29]CLAIREAUX G, THéRON M, PRINEAU M, et al. Effects of oil exposure and dispersant use upon environmental adaptation performance and fitness in the European sea bass,Dicentrarchuslabrax[J].Aquatic Toxicology, 2013, 130-131: 160-170.

[30]CHEN R, ZHENG W Y, YU Q, et al. Effect of oil pollution on antioxidant enzyme of oyster(Ostreacucullata)[J]. Actascientiae Circumstantiae, 2002, 22(3): 385-388. 陳榮, 鄭微云, 余群, 等.石油污染對僧帽牡蠣(Ostreacucullata)抗氧化酶的影響[J].環(huán)境科學學報， 2002, 22(3): 385-388.

[31]LIN K, CHUN G Z, YUK S W, et al. Dose and accumulative effects of spent lubricating oil on four common mangrove plants in South China[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2011, 74: 55-66.

[32]DUSSAUZE M, DANION M, FLOCH S L, et al. Innate immunity and antioxidant systems in different tissues of sea bass(Dicentrarchuslabrax) exposed to crude oil dispersed mechanically or chemically with Corexit 9500[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2015, 120: 270-278.

[33]HUANG Z, ZHANG Z, MA S W, et al. Effects of BDE209 on the SOD, MDA, GSH ofPernaviridis[J].Journal of Agro-Environment Science, 2012, 31(6): 1053-1059. 黃志斐, 張喆, 馬勝偉, 等. BDE209脅迫對翡翠貽貝(Pernaviridis)SOD、MDA和GSH的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報, 2012, 31(6): 1053-1059.

[34]MILINKOVITCH T, IMBERT N, SANCHEZ W, et al. Toxicological effects of crude oil and oil dispersant: Biomarkers in the heart of the juvenile golden grey mullet(Lizaaurata)[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 88: 1-8.

[35]MARQUES J A, SILVA H C, GUILOSKI I C, et al. Antioxidant defense responses inMytellaguyanensis(Lamarck,1819) exposed to an experimental diesel oil spill in Paranagu Bay(Paran, Brazil)[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2014, 107: 269-275.

Received: June 25, 2015

*收稿日期：2015-06-25

作者簡介：殷悅(1992-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事環(huán)境毒理學方面研究.E-mail：18841129227@163.com *通訊作者：熊德琪(1967-)，男，遼寧大連人，教授，博士，博士生導師，主要從事海洋生態(tài)毒理學與溢油損害評估方面研究.E-mail：xiongdq@dlmu.edu.cn(王佳實編輯)

中圖分類號：X55

文獻標識碼：A

文章編號：1671-6647(2016)02-0292-12

doi:10.3969/j.issn.1671-6647.2016.02.014

Compound Toxicity of No.180 Fuel Oil Disposed by Oil Spill Dispersant onGlyptocidarisCrenularis

YIN Yue, XIONG De-qi, ZHANG Xin-xin, HE Shan, DUAN Mei-na, Lü Xin-lu

(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,DalianMaritimeUniversity, Dalian 116026, China)

Abstract:In this study, the compound toxic effects of 180# fuel oil water-accommodated fractions (WAFs) and chemically enhanced water-accommodated fractions (CEWAFs) on the antioxidant enzyme system in gonadal and intestinal tissues of Glyptocidaris Crenularis were investigated. During the exposure period, the sea urchins were exposed in different concentration gradient of WAFs and CEWAFs for 96 h, then a portion of its intestine and gonad was extracted for antioxidase activities determination. Subsequently, the exposure solution was replaced by filtered seawater to culture the rest of sea urchins for 7 d, then the same antioxidase activities of sea urchins were examined during the recovery period..The results indicated that the CEWAFs and WAFs demonstrated an inductive effect first and then an inhibitory effect to the antioxidase activity. In the exposure period, the maximum inductive rates of CAT、SOD、GST and GSH in WAFs were 40.21%，46.03%，26.01% and 23.89%, in CEWAFs they were 38.60%，48.83%，29.34% and 27.86% respectively. In disposal group, the maximum inductive rates of antioxidase activity in gonad were higher than those in intestine, and same phenomenon was observed during the recovery period as well. The results suggested that the gonad of Glyptocidaris Crenularis is more sensitive to the petroleum hydrocarbon than intestine. By comparison, the activity of CAT and SOD was more sensitive to petroleum hydrocarbon pollutant , suggesting CAT and SOD were better suited as a biomarker for marine oil spill pollution monitoring. There were no significant diversity between the two kinds of control suggesting that the chemical dispersant has inconspicuous toxicity itself.

Key words:oil spill dispersant; 180# fuel oil; Glyptocidaris Crenularis; antioxidase activity

資助項目：國家自然科學基金項目——消油劑處理溢油對模式生物海膽的聯(lián)合毒性效應及機制研究(41276105/D0608)；交通運輸部應用基礎研究項目——消油劑處理溢油對生物的復合毒害效應及機理研究(2013329225250)