丁曉燕，曲凌云，王　琛，田欣欣，孫承君，王敏強

(1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.海洋科學與技術國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室， 山東 青島 266237)

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溫度對副溶血弧菌T3SS中相關基因表達的影響*

丁曉燕1,2，曲凌云2,3*，王琛1,2，田欣欣2，孫承君2，王敏強1

(1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.海洋科學與技術國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室， 山東 青島 266237)

摘要:III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)是副溶血弧菌主要的毒力因子之一，能傳遞與致病有關的毒性因子來發(fā)揮病原菌的毒性，而溫度是影響細菌基因表達等生命活動的關鍵生態(tài)因子。本文以ATCC17802和JA21作為實驗菌株，分別提取其RNA，在不同溫度和溫度應激條件下，以pvuA為內參基因，以副溶血弧菌T3SS1的vcrD1、vopS、vopD1和T3SS2的vscC2β、vcrD2β、vopP2β作為目的基因，運用熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測T3SS相關基因的表達下，用ΔΔCt法計算基因表達差異。結果表明：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ATCC17802菌株的T3SS1基因在16 ℃表達量最高，T3SS2基因在25 ℃表達量最高。副溶血弧菌JA21菌株的T3SS1基因和T3SS2基因均在25 ℃表達量最高。2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉入到應激溫度37 ℃后，T3SS1和T3SS2基因的表達量均被顯著誘導，并表現(xiàn)出時間依賴性，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這為進一步探究環(huán)境因素與副溶血弧菌致病力的關系提供了科學依據。

關鍵詞：副溶血弧菌；T3SS；RT-PCR；基因表達

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus) 屬于弧菌科弧菌屬，是一種嗜鹽嗜溫性的革蘭氏陰性短桿菌[1]，主要生活在海洋環(huán)境、鹽湖和魚蝦貝類等海產品中。副溶血弧菌能感染魚類、對蝦、文蛤、九孔鮑等，引起水生動物疾病[2]，對水產養(yǎng)殖行業(yè)造成危害；人類誤食帶有副溶血弧菌的海產品可導致腸胃炎、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，嚴重者甚至引發(fā)敗血癥[3]。副溶血弧菌病主要在中國、日本等沿海國家或地區(qū)流行，我國部分沿海地區(qū)，細菌性食物中毒的病例中副溶血弧菌食物中毒占居首位(31%)[4]。副溶血弧菌的致病性與其產生的多種毒力因子密切相關，其中III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)是副溶血弧菌的主要毒力因子之一，具有細胞毒性[5]和腸毒性[6]。2002年Tagomori[7]完成第一株副溶血弧菌全基因組測序，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌含有兩套III型分泌系統(tǒng)(T3SS)，分別是T3SS1，T3SS2。 T3SS1位于染色體1的毒力島上，具有30個開放閱讀框，且T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分離株中，其G+C含量與基因組其它區(qū)域有差別，被認為是該菌的一個遺傳標記[8]。副溶血弧菌T3SS1 主要貢獻對宿主細胞的細胞毒性，引發(fā)一系列的細胞效應，介導宿主細胞的自體吞噬作用，最后導致細胞死亡。副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，主要具有腸毒性[9]，引起腹瀉和破壞腸道組織，同時也發(fā)揮少量細胞毒性，在感染過程中發(fā)揮重要功能。

環(huán)境溫度作為關鍵生態(tài)因子之一，其變化會影響微生物等生命體的生命活動[10-11]，Hoe和Gogven[12]研究表明外界環(huán)境溫度的變化可誘導細菌分泌系統(tǒng)的表達。Rao等[13]發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌在感染過程中經歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS的表達相應的受到溫度的調控，37 ℃條件下與28 ℃條件下T3SS的轉運蛋白表達量不同，而在20 ℃條件下，沒有檢測到T3SS轉運蛋白的表達。Vilches等[14]發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子誘導嗜水氣單胞菌AH-3菌株T3SS的表達，其中Ca2+的消耗和高濃度Mg2+是最主要的因素，溫度升高也能促進表達。龐歡瑛等[15]研究了溶藻弧菌T3SS轉運蛋白vscO基因在不同環(huán)境下的表達差異，結果顯示vscO基因在特定的環(huán)境下表達量最高。而關于環(huán)境因子對副溶血弧菌T3SS表達的影響未曾見到報道。

本研究共選取T3SS中6個相關結構和效應蛋白基因為目的基因，采用RT-PCR方法比較不同生長溫度和溫度應激條件下副溶血弧菌T3SS中相關基因的表達差異，以探討副溶血弧菌T3SS基因表達與環(huán)境溫度適應性之間的關系，并進一步探究環(huán)境因素變化對副溶血弧菌致病因子表達的影響。

1材料與方法

1.1菌株來源及毒力基因特征

本研究使用的菌株保存于國家海洋局第一海洋研究所免疫與疾控實驗室近海微生物資源庫。其中，副溶血弧菌ATCC17802購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，副溶血弧菌JA21為本實驗室分離。

表1　副溶血弧菌T3SS基因信息

1.2引物設計

根據GeneBank數據庫中副溶血弧菌T3SS基因，利用Primer Premier 5.0 軟件在T3SS基因比較保守區(qū)域設計特異性引物，引物序列見表2。 內標基因pvuA上、下游引物序列引用自參考文獻[20]。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2　RT-PCR所用引物

1.3實驗試劑與儀器

細菌培養(yǎng)所用2216E培養(yǎng)基按照《微生物學實驗》(第三版)[21]進行配制；細菌RNA提取試劑盒R6950-01購自Omega公司；逆轉錄試劑盒RR047A、熒光定量PCR試劑盒RR820A購自Takara公司；熒光定量PCR儀型號為Applied Biosystems 7500。

1.4實驗方法

1.4.1培養(yǎng)溫度對T3SS基因表達的影響

將2株副溶血弧菌ATCC17802、JA21接種于2216E培養(yǎng)基中，37 ℃[22]搖床震蕩過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的細菌以1%的比例接種于2216E培養(yǎng)基中，分別放置于16,20,25和37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)。根據生長曲線估計培養(yǎng)時間，在OD600達到0.6時，取菌液4 ℃離心取沉淀，用RNA提取試劑盒(Omega)提取總RNA用于T3SS基因轉錄水平差異的檢測。每個實驗組各設3個平行。

1.4.2溫度應激對T3SS基因表達的影響

將2株副溶血弧菌ATCC17802、JA21接種于2216E培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的細菌以1%的比例接種于2216E培養(yǎng)基中， 分別放置于16,20,25和37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)。根據生長曲線估計培養(yǎng)時間，待培養(yǎng)至OD600達到0.6，離心棄上清，用等體積2216E培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，放置于模擬人體溫度的37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)，分別于1，2，3和4 h取菌液4 ℃離心取沉淀，用RNA提取試劑盒提取總RNA用于T3SS基因轉錄水平差異的檢測。每個實驗組各設3個平行。

1.4.3總RNA提取與反轉錄

使用Omega細菌RNA提取試劑盒提取副溶血弧菌的總RNA，操作在紫外線滅菌的獨立RNA實驗室中進行。提取的總RNA的完整性用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用紫外分光光度計確定RNA濃度。

反轉錄使用Takara反轉錄試劑盒，首先去除總RNA中殘留的基因組，隨后將RNA反轉錄成單鏈cDNA，反轉錄產物cDNA分裝后置于-80 ℃保存。

1.4.4熒光定量PCR反應體系與條件

反應體系為20 μL，其中：cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) 10 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，濃度為10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，無菌雙蒸水6 μL。

反應條件：95 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 34 s，40個循環(huán)，72 ℃實時檢測熒光信號，同時進行ROX值校正。最后進行RT-PCR溶解曲線分析。

1.5數據處理

RT-PCR結果采用2-ΔΔCt法分析不同條件下T3SS基因表達差異。每個菌株以培養(yǎng)溫度37 ℃為對照組。

2結果

2.1提取的總RNA檢測結果

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的副溶血弧菌總RNA的完整性，結果顯示5SrRNA條帶很弱，幾乎不可見，而16SrRNA，23SrRNA條帶明亮清晰，說明提取的總RNA條帶完整。利用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，A260/280數值處于1.8～2.0，說明RNA可以進行下一步反轉錄。分析pvuA基因和vcrD1，vopS，vopD1，vscC2β，vcrD2β，vopP2β基因溶解曲線可知只有單峰值，排除了非特異性擴增，陰性對照無擴增曲線，表明加樣時無交叉污染。

2.2熒光定量PCR結果

2.2.1不同培養(yǎng)溫度下副溶血弧菌T3SS基因的表達差異

圖1　副溶血弧菌在不同溫度下T3SS基因的表達差異Fig.1　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus cultured at different temperature

將2株副溶血弧菌ATCC17802和JA21分別接種于不同培養(yǎng)溫度的2216E培養(yǎng)基中生長，比較T3SS基因的表達差異。實驗結果表明(圖1)：副溶血弧菌ATCC17802的T3SS1基因在16 ℃表達量最高，其次是25 ℃；其中16 ℃時T3SS1內膜蛋白基因vcrD1的表達量是最低組的4.31倍，T3SS1轉運蛋白基因vopD1的表達量最低組的5.11倍，T3SS1效應蛋白基因vopS的表達量是最低組的6.71倍；T3SS2基因在25 ℃表達量最高，其次是16 ℃；其中25 ℃時T3SS2內膜蛋白基因vcrD2β的表達量是最低組的2.61倍，T3SS2外膜蛋白基因vscC2β的表達量是最低組的5.80倍，T3SS2效應蛋白基因vopP2β的表達量是最低組的5.59倍；副溶血弧菌JA21的T3SS1基因和T3SS2基因均在25 ℃表達量最高，其次是37 ℃；其中25 ℃時T3SS1內膜蛋白基因vcrD1的表達量是最低組的1.34倍，T3SS1轉運蛋白基因vopD1的表達量是最低組的5.72倍，T3SS1效應蛋白基因vopS的表達量是最低組的1.39倍；25 ℃時T3SS2編碼內膜蛋白基因vcrD2β的表達量是最低組的11.02倍，T3SS2外膜蛋白基因vscC2β的表達量是最低組的22.75倍，T3SS2效應蛋白基因vopP2β的表達量是最低組的22.60倍。整體而言，2株副溶血弧菌T3SS基因均在20 ℃表達量最低。

2.2.2溫度應激條件下副溶血弧菌T3SS基因表達差異

圖2　副溶血弧菌從16 ℃轉入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為16 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達差異Fig.2　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 16 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 16 ℃ and 37 ℃

圖3　副溶血弧菌從20 ℃轉入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為20 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達差異Fig.3　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 20 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 20 ℃ and 37 ℃

如圖2a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度16 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達量明顯升高，除vopS外其它基因在2 h時達到最高值，然后表達量開始回落。其中，T3SS1轉運蛋白基因vopD1的表達量是對照組(37 ℃)的157.97倍，遠高于其他基因。除此之外5個T3SS基因在最高值處的變化范圍是12.05～28.91倍，其中表達量變化最小的是T3SS2效應蛋白基因vopP2β，表達量變化最大的是T3SS2外膜蛋白基因vscC2β。

如圖2b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度16 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達量明顯升高，且T3SS1基因表達量在2 h時達到最高值，T3SS2基因表達量在1 h時達到最高值，然后表達量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是2.74～17.91倍，其中表達量變化最小的是T3SS2效應蛋白基因vopP2β，表達量變化最大的是T3SS2外膜蛋白基因vscC2β。

圖4　副溶血弧菌從25 ℃轉入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為25 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達差異Fig.4　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 25 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 25 ℃ and 37 ℃

如圖3a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度20 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達量明顯升高，且在2 h時達到最高值，然后表達量開始回落。其中T3SS1轉運蛋白基因vopD1的表達量是對照組(37 ℃)的88.74倍，遠高于其他基因。除此之外5個T3SS基因在最高值處的變化范圍是7.14～22.25倍，其中表達量變化最小的是T3SS1內膜蛋白基因vcrD1，表達量變化最大的是T3SS2內膜蛋白基因vcrD2β。

如圖3b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度20 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達量明顯升高，除vscC2β外在3 h時達到最高值，然后表達量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是4.01～14.47倍，其中表達量變化最小的是T3SS1轉運蛋白基因vopD1，表達量變化最大的是T3SS2效應蛋白基因vopP2β。

如圖4a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度25 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達量明顯升高，且在2 h時達到最高值，然后表達量開始回落。其中T3SS1轉運蛋白基因vopD1的表達量是對照組(37 ℃)的71.71倍，遠高于其他基因。除此之外5個T3SS基因在最高值處的變化范圍是4.26～21.33倍，其中表達量變化最小的是T3SS1內膜蛋白基因vcrD1，表達量變化最大的是T3SS2內膜蛋白基因vcrD2β。

如圖4b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度25 ℃轉入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達量明顯升高，且在1 h達到最高值，然后表達量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是3.59～7.46倍，其中表達量變化最小的是T3SS2效應蛋白基因vopP2β，表達量變化最大的是T3SS2內膜蛋白基因vcrD2β。

由圖2，3，4結果可見，2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉入到應激溫度37 ℃后，T3SS基因的表達量明顯升高，既高于在原本的培養(yǎng)溫度時的表達量，也高于2株菌在培養(yǎng)溫度為37 ℃時的表達，轉入應激條件下的副溶血弧菌T3SS基因表現(xiàn)出顯著的時間依賴性，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。

3討論與分析

T3SS作為副溶血弧菌的主要毒力因子之一， 能傳遞與致病有關的毒性因子來發(fā)揮病原菌的毒性，而溫度是影響細菌基因表達等生命活動的關鍵生態(tài)因子。

副溶血弧菌T3SS1主要貢獻對宿主細胞的細胞毒性，介導宿主細胞的自體吞噬作用，最后導致細胞死亡。vcrD1編碼的內膜蛋白是組成T3SS1分泌裝置基體的一部分，在此基礎上針管狀結構蛋白才能繼續(xù)生長。vopD1編碼的轉運蛋白功能是在宿主細胞的細胞膜表面形成孔洞，效應蛋白沿該通道進入宿主細胞內，此外還具有對HeLa細胞的毒性和接觸溶血活性[23]。圖1a、1c顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vcrD1和vopD1基因分別在16 ℃和25 ℃條件下表達量最高。轉運蛋白vopD1的高表達量有利于T3SS分泌通道的完善，釋放分泌蛋白，表現(xiàn)細菌毒性。vopS編碼的效應蛋白可導致細胞變圓和通過抑制RhoB的鳥苷三磷酸酶導致肌動蛋白細胞骨架的崩潰，并且vopS可以使AMPylation 阻止Rho家族的鳥苷三磷酸酶與下游的效應蛋白反應，因此抑制受感染細胞內肌動蛋白的重排[17]。圖1a 、1c顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vopS基因分別在16 ℃和25 ℃條件下表達量最高，暗示2株菌分別在16 ℃和25 ℃溫度下，其相關毒素分泌較多。

上述實驗結果表明副溶血弧菌ATCC17802、JA21在不同的環(huán)境溫度下表現(xiàn)對宿主細胞不同的細胞毒性作用，即它們表現(xiàn)最強細胞毒性的溫度不同。副溶血弧菌ATCC17802和JA21的T3SS1分別在16 ℃和25 ℃表達量最高，二者的差異可能是由于菌株來源不同，菌株宿主的生存環(huán)境溫度有所差異，造成了溫度調控的多樣性。呂遠志[24]在研究遲緩愛德華氏菌的雙組份系統(tǒng)的毒力調控機制中發(fā)現(xiàn)，在相同的溫度條件下，不同來源的2株菌的T3SS轉運蛋白EseBCD的分泌量差異很大，實驗現(xiàn)象與本實驗相似。Zhou等[25]研究表明副溶血弧菌T3SS1主要受exsACDE操縱子的調控，在誘導條件下ExsA蛋白促進T3SS1介導的細胞毒性的表達，而ExsD可以結合ExsA從而阻斷其對T3SS1表達的促進作用，ExsC結合ExsD 釋放ExsA, 從而促進T3SS1的表達。Kodama等[26]研究證明，H-NS蛋白能夠通過抑制exsA基因的表達來調控T3SS1的表達，而H-NS蛋白能夠響應環(huán)境刺激對許多系統(tǒng)起調控作用，因此溫度對副溶血弧菌T3SS1表達的影響是否與H-NS蛋白和exsACDE操縱子響應環(huán)境溫度有關及其響應機制仍需進一步驗證。

副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，具有腸毒性，在感染過程中發(fā)揮重要作用。vcrD2β和vscC2β分別編碼T3SS2內膜蛋白和外膜蛋白，這2種蛋白是組成T3SS2分泌裝置基體的一部分。圖1b、1d顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vscC2β、vcrD2β基因都是在25 ℃表達量最高，暗示在25 ℃條件下，副溶血弧菌T3SS2的基底裝置部分組裝最多。vopP2β編碼的效應蛋白能活化激酶催化環(huán)結構中保守的賴氨酸乙酰化，阻止ATP的結合，最終組織激酶的磷酸化[19]。圖1d顯示JA21的vopP2β基因在25 ℃和37 ℃條件下表達量遠高于16 ℃和20 ℃，提示副溶血弧菌JA21的T3SS2的效應蛋白基因可能在高溫環(huán)境下表達量高，在低溫環(huán)境下表達量低。圖1b、1d顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的 vopP2β基因都在25 ℃下表達量最高，暗示在該溫度下T3SS2分泌的毒力因子最多。由效應蛋白的功能描述可知，副溶血弧菌的T3SS2能夠破壞腸道組織，誘導腹瀉，并且具有一定的細胞毒性，是發(fā)揮感染作用的重要毒力因子。本文研究顯示，在25 ℃下，2株副溶血弧菌的T3SS2表達量均最高；而且陳星等[27]研究表明，副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因tdh也在25 ℃表達量最高，溶血活性最強；由此暗示此溫度下，養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌對受感染宿主有較強的致病性。

本實驗還研究了副溶血弧菌從不同培養(yǎng)溫度轉入人體溫度37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后T3SS基因的表達差異。實驗結果如2.2.2所示，2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉入到應激溫度37 ℃后，T3SS基因的表達量明顯升高，其中副溶血弧菌ATCC17802從不同培養(yǎng)溫度轉入37 ℃后2 h，vopD1的表達量升高異常顯著。vopD1是T3SS1的轉運蛋白，在形成T3SS1的早期階段，細菌只具備橫跨膜的環(huán)狀基底部分和在此基礎上突出的針管狀裝置，當細菌與宿主細胞接觸后，T3SS1通過針管狀通道輸出轉運蛋白安裝到針管結構的頂端，轉運蛋白在靶細胞膜上形成孔洞，效應蛋白通過孔洞進入宿主細胞[28]。副溶血弧菌ATCC17802的vopD1表達量的大量升高，可能是由于溫度應激條件能誘導副溶血弧菌釋放轉運蛋白，完善分泌通道，釋放分泌蛋白。

應激條件下2株菌T3SS基因的表達表現(xiàn)出顯著的時間依賴性，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，4 h后T3SS表達量明顯降低，由于37 ℃是模擬人體溫度，可以猜測副溶血弧菌被誤食進入人體后，前3 h T3SS的表達量是最高的，即副溶血弧菌分泌的毒素較多，隨后T3SS基因表達量降低。比較2株副溶血弧菌轉入37 ℃后T3SS基因表達量的變化，可以發(fā)現(xiàn)，ATCC17802的T3SS基因表達量變化顯著高于JA21，說明ATCC17802對溫度變化的反應更強烈，應激條件下毒力因子基因表達增加顯著。

苑淑賓，朱愛貴[28]認為，條件致病菌一般情況下不會引起養(yǎng)殖動物發(fā)生病害，但一些環(huán)境因子，例如溫度、鹽度等均可以調控其致病性相關蛋白的表達，從而影響細菌的致病性[29]。龐歡瑛等[15]對溶藻弧菌T3SS的轉運蛋白vscO基因的表達差異進行了研究，結果顯示vscO基因在28 ℃時表達量最高。這與本研究中副溶血弧菌17802和JA21的T3SS在25 ℃表達量最高相似。Rao等[12]認為，遲緩愛德華氏菌在感染過程中經歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS的表達相應的受到溫度的調控， 實驗結果表明在28 ℃條件下，T3SS的轉運蛋白表達最高，而在20 ℃條件下，沒有檢測到T3SS轉運蛋白的表達， 說明遲緩愛德華氏菌T3SS的轉運蛋白表達量在不同培養(yǎng)溫度下有較大差異，這與本研究中副溶血弧菌的T3SS基因在不同培養(yǎng)溫度下表達差異顯著的現(xiàn)象一致。

探究環(huán)境因素對副溶血弧菌致病力的影響，將有助于揭示副溶血弧菌的致病規(guī)律。綜上研究，溫度的變化對副溶血弧菌T3SS基因的表達具有顯著的影響，但是不同的基因對溫度的響應不同。由副溶血弧菌全基因組測序表明[7]，副溶血弧菌的基因結構與耶爾森氏菌相似，已有文獻顯示耶爾森菌的T3SS具有多個操縱子[30]，副溶血弧菌T3SS基因對溫度不同的響應特性是否根源于不同基因受不同的操縱子調控有待進一步的驗證。

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Received: September 9, 2015

*收稿日期：2015-09-09

作者簡介：丁曉燕(1990-)，女，山東青島人，碩士研究生.主要從事海洋微生物分子生物學方面研究.E-mail：dingxiaoyan1010@163.com *通訊作者：曲凌云(1975-)，女，山東榮成人，研究員，博士，碩士生導師，主要從事海洋微生物和海洋分子生物學以及海水養(yǎng)殖動物病原微生物學方面研究.E-mail：qly@fio.org.cn(王佳實編輯)

中圖分類號：X834

文獻標識碼：A

文章編號：1671-6647(2016)02-0250-10

doi:10.3969/j.issn.1671-6647.2016.02.010

Effect of Temperature on T3SS Gene Expression ofVibrioparahaemolyticus

DING Xiao-yan1,2, QU Ling-yun2，3, WANG Chen1,2, TIAN Xin-xin2,SUN Cheng-jun2, WANG Min-qiang1

(1.CollegeofLifeSciences,YantaiUniversity, Yantai 264005, China;2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China;3.NationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,FunctionLaboratoryforMarineFisheriesScienceandFoodProductionProcesses,Qingdao 266237, China)

Abstract:T3SS (Type III secretion system) is one of the major virulence factors of Vibrio parahaemolyticus, which could deliver pathogenic virulence factors or effectors to eukaryotic host cells, and temperature is one of the key ecological factors which could influence gene expression. We can compare the virulence of strains which in different culture temperature and stress conditionsby comparing the expression level of T3SS genes, including vcrD1, vopS, vopD1, vscC2β, vcrD2β, vopP2β, which encode T3SS1 inner membrane protein, T3SS1 effector, T3SS1 translocator, T3SS2 outer membrane protein, T3SS2 inner membrane protein and T3SS2 effector, respectively. In this paper, we extracted total RNA from two kinds of Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 and JA21 cultured under different temperature and stress condition. By means of established fluorescence quantitative RT-PCR method which using pvuA as the internal standard gene and the ΔΔCt method as the calculation method，the transcription changes of the T3SS mRNA were studied. The results showed that in V. parahaemolyticus 17802, T3SS1 exhibited highest expression at 16℃ while T3SS2 exhibited highest expression at 25℃. In V. parahaemolyticus JA21, both T3SS1 and T3SS2 exhibited highest expression at 25℃. The expression level of T3SS of the 2 strains V. parahaemolyticus changed over time in response to stress condition, and were significantly increased compared to control group at 1h after transporting from culture temperature into stress condition. After the peak point, the expression level dropped down. This research provides a scientific basis for the study of the relationship between the environmental factors and the pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus.

Key words:V. parahaemolyticus; T3SS; RT-PCR; gene expression

資助項目：國家科技支撐計劃項目——海洋水產病害實用化檢測及預警技術的建立與應用(2012BAD17B01)；青島海洋科學與技術國家實驗室鰲山科技創(chuàng)新計劃項目——近海健康養(yǎng)殖關鍵技術研究與新生產模式構建(2015ASKJ02-03)；海洋公益性行業(yè)科研專項——重要魚類增養(yǎng)殖區(qū)致病細菌基因芯片檢測技術研究開發(fā)與示范(201105007-1)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉化專項——重要水產養(yǎng)殖病害防治替代產品(2014ZZCX06205)；泰山學者海外人才項目