曾娟妮劉筱伍偉明尹婷吳志榮李文華

【摘要】目的：探討外用單味動(dòng)物藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制。方法：將50只大鼠分為急性創(chuàng)面組、模型組、貝復(fù)濟(jì)組、美洲大蠊提取液組，用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法，觀(guān)察大鼠皮膚修復(fù)組織VEGFmRNA的表達(dá)。結(jié)果：VEGFmRNA的表達(dá)在第5、7、11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組及模型組（P<001）；在第5、7、11天，美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于模型組（P<001）；在第5、11天，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005）；第7天，肉芽組織生長(zhǎng)期，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。結(jié)論：美洲大蠊提取液通過(guò)提高VEGFmRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

【關(guān)鍵詞】美洲大蠊提取液；慢性難愈合創(chuàng)面；RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）；基因表達(dá)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）19-0064-03

慢性難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面在各種內(nèi)外因素作用下不能通過(guò)正常的愈合進(jìn)程達(dá)到解剖和功能上的完整，從而進(jìn)入一種病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，最終導(dǎo)致經(jīng)久難愈。藥理研究證明美洲大蠊提取物能促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復(fù)各類(lèi)潰瘍及創(chuàng)傷創(chuàng)面；抗感染、消除炎性水腫，提高機(jī)體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細(xì)胞，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間[1-2]。目前，美洲大蠊提取物被廣泛應(yīng)用在創(chuàng)面修復(fù)、胃潰瘍、腫瘤等領(lǐng)域[3-4]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創(chuàng)面，并取得滿(mǎn)意療效[5]。但其促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的機(jī)制尚未探討。因此本實(shí)驗(yàn)研究從創(chuàng)面愈合機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)，以RT-PCR為主要研究方法，從肉芽組織中新生血管為切入點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從局部生長(zhǎng)因子等角度探討美洲大蠊促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制提供理論依據(jù)，并為中醫(yī)藥的外治提供新思路。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)50只大鼠，2月齡，體重200～250g，雌雄不限“均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，混合飼料單籠飼養(yǎng)”，50只大鼠隨機(jī)分組，先取12只建立大鼠急性愈合創(chuàng)面模型，其余38只建立大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型，慢性難愈合創(chuàng)面組再隨機(jī)分為模型組、貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性組（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20013152，實(shí)驗(yàn)全過(guò)程使用同批號(hào)藥物）、美洲大蠊提取液實(shí)驗(yàn)組（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004，實(shí)驗(yàn)全過(guò)程使用同批號(hào)藥物）。

12大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型建立參照付小兵等[6]全層皮膚缺損法經(jīng)改進(jìn)制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。

13主要實(shí)驗(yàn)試劑Trizol：Invitrogen；Real-time PCR mix：Promega A6001；DNA Marker：Fermentas；異丙醇：上海化學(xué)試劑公司；氯仿：上海化學(xué)試劑公司；引物：上海生工；Gold View核酸染料：上海生工；瓊脂糖粉：上海生工。

14主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo；核酸蛋白分析儀：德國(guó)eppendorf；PCR儀：德國(guó) Biometra；凝膠成像分析儀：美國(guó)Bio-Rad；微量移液器：德國(guó)eppendorf。

15實(shí)驗(yàn)方法及步驟

151引物設(shè)計(jì)從NCBI中下載以下基因序列，引物設(shè)計(jì)采用Primer50軟件，引物序列見(jiàn)表1。

152RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄從組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成的QPCR引物進(jìn)行real-time PCR，以檢測(cè)組織中目的基因的表達(dá)。組織中總RNA抽提：①取50～100mg組織，每孔加入1000μL Trizol，吹打，室溫靜置5min；②每管加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置3min；4℃，12000rpm，離心15min；③從每管中吸取上清至另一新的15mL EP管。加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20min；④4℃，12000rpm離心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀；⑤4℃，10000rpm離心5min，棄上清；4℃，10000rpm再次離心5min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）；⑥加入20μL RNase-free水，至完全溶解，備用。

15312%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。

154第一鏈cDNA合成 ①取10μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無(wú)RNA酶的EP管中，混勻后離心，70℃溫浴10min，立即置于冰上；②加一下反應(yīng)體系的其他試劑（冰上進(jìn)行），混勻，短暫離心。③上述體系在42℃反應(yīng)15min，然后在70℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活。④將得到cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

155普通PCR檢測(cè)（德國(guó)，biometra） 按下列比例配置反應(yīng)體系：①2×Real-time PCR mix/2×PCR mix：10μL；②PCRmix；③cDNA模板：1μL ④上游引物：1μL；⑤下游引物：1μL；⑥ddH2O：7μL；⑦總體積：20μL；⑧擴(kuò)增程序94℃，4min；94℃，40sec，60℃ 30sec，×40cycle。

16統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS160統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<005為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2112%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度

22VEGF電泳結(jié)果

圖2注：GAPDH電泳圖， 第 1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復(fù)濟(jì)組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組。

圖3注：VEGF mRNA表達(dá)電泳結(jié)果，第1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復(fù)濟(jì)組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組，可反映出VEGFmRNA的表達(dá)量從高到低依次是急性愈合創(chuàng)面組、貝復(fù)濟(jì)組、美洲大蠊提取液組、模型組，在第7天，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組的VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差異。

23結(jié)果（見(jiàn)表2）

3討論

31本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在第5天、第7天、第11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組及模型組（P<001），表明造模成功；在第5天、第7天、第11天，美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于模型組大鼠（P<001）；在第5天、第11天，美洲大蠊提取液組比貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量稍低，但差異不明顯（P>005）；在第7天的肉芽組織生長(zhǎng)期，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)差異（P>005）；表明美洲大蠊提取液在創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)期能誘導(dǎo)內(nèi)源性VEGF的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成并減少效應(yīng)T細(xì)胞在組織局部蓄積的作用，促進(jìn)創(chuàng)面血液循壞、增強(qiáng)創(chuàng)面免疫力，從而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)、抑制瘢痕生長(zhǎng)。

32血管生成可為創(chuàng)面的修復(fù)提供充足的氧分，有利于細(xì)胞的增殖；新生血管是肉芽組織的主要成分，肉芽組織是膠原沉積、改建的場(chǎng)所，因此，血管新生是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中重要的一環(huán)[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種特異的直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，可以刺激體內(nèi)尤其是缺血部位的血管生成，是迄今為止已知的最強(qiáng)烈的促血管生長(zhǎng)因子，它主要是通過(guò)啟動(dòng)微血管發(fā)生的初始過(guò)程-出芽，并最終形成成熟的血管結(jié)構(gòu)[8]因此，VEGF在皮膚潰瘍愈合過(guò)程中起決定性作用。在慢性創(chuàng)面，由于VEGF表達(dá)較正常創(chuàng)面下調(diào)而導(dǎo)致血管生成的下降，被認(rèn)為是慢性創(chuàng)面難愈合的重要原因[9]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肉芽結(jié)果中VEGFmRNA的表達(dá)來(lái)探討單味動(dòng)物中藥對(duì)促愈具有非常重要的意義，但美洲大蠊提取液在創(chuàng)面重塑期與貝復(fù)濟(jì)組表達(dá)有差異，那么它是否能減少瘢痕的形成有待于進(jìn)一步探討。

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（編輯：穆麗華）