于亞娟，王鳳龍，丁玉林，畢艷楠

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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大腸桿菌對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞bFGF及其受體FGFR2表達(dá)的影響

于亞娟，王鳳龍*，丁玉林，畢艷楠

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

摘要[目的]探討大腸桿菌(Escherichia coli)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)bFGF及其受體FGFR2表達(dá)的影響。[方法]取熱滅活的0、105、106和108 CFU/mL濃度的大腸桿菌作用于體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，分別在作用后6、12、24和48 h，采用熒光定量PCR和Western blot方法檢測bFGF和FGFR2的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。[結(jié)果]bFGF mRNA表達(dá)與對照組相比隨著大腸桿菌濃度的升高而顯著上調(diào)(P<0.01)，24 h bFGF表達(dá)量最高。BMEC bFGF蛋白表達(dá)隨著大腸桿菌濃度的增加而上調(diào)，24 h表達(dá)量達(dá)到最高；FGFR2 mRNA相對表達(dá)量除6 h組外隨大腸桿菌濃度的增加而呈現(xiàn)降低、升高、降低的變化趨勢，48 h表達(dá)量達(dá)到最高。各處理組與對照組相比FGFR2蛋白表達(dá)隨時間的延長、菌液濃度的增加而上調(diào)。[結(jié)論]大腸桿菌刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞可以明顯促進(jìn)bFGF和FGFR2的表達(dá)，具有濃度和時間依賴性。

關(guān)鍵詞bFGF；FGFR2；大腸桿菌；奶牛乳腺上皮細(xì)胞

奶牛乳腺炎是奶牛最常見、最多發(fā)且造成經(jīng)濟(jì)損失最大的疾病之一。該病可使奶牛泌乳機(jī)能受損，生殖機(jī)能失調(diào)，奶牛福利受損，引起產(chǎn)奶量下降[1]，嚴(yán)重者可引起泌乳機(jī)能完全喪失，導(dǎo)致乳腺纖維化。大腸桿菌是引起奶牛乳腺炎是主要原因之一，大腸桿菌感染大多引起嚴(yán)重的臨床癥狀，導(dǎo)致臨床型乳腺炎[2]。大量研究表明，bFGF(Basic fibroblast growth factor-2，bFGF2)是一種廣泛的有絲分裂原，可通過自分泌或旁分泌的方式來促進(jìn)包括腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖、分化和抗凋亡作用[3]，bFGF是通過與成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，F(xiàn)GFR2又是其高親和力受體。研究表明，bFGF可誘導(dǎo)體外腎小管上皮細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)(EMT)轉(zhuǎn)化[4]。據(jù)報道，bFGF在肝纖維化中晚期主要是促進(jìn)ECM的產(chǎn)生[5]。FGF2/FGFR 信號通路在多種組織細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中起到了重要作用，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[6]。然而，bFGF及其受體FGFR2在奶牛乳腺纖維化過程中的作用卻鮮有報道。筆者以熱滅活大腸桿菌作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞檢測 bFGF及FGFR2的相對表達(dá)量，以期為探討大腸桿菌感染與乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)bFGF、FGFR2相互關(guān)系及bFGF在奶牛乳腺纖維化的作用提供研究依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株、細(xì)胞及主要試劑大腸桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理解剖實驗室分離、鑒定并保存[7]；BMEC由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理解剖實驗室保存[8]。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基，購自Gibco公司；RNAisoPlus裂解液(批號為D910008A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號為DRR036A)、SYBR PremixExTaq(批號為DRR041A)、DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；小鼠β-actin 抗體，購自天津三箭生物技術(shù)有限公司；bFGF 鼠抗單克隆抗體(MA1-24682)，購自Millipore公司；FGFR2兔抗單克隆抗體(ab109372)，購自Abcom公司；蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗小鼠 IgG-HRP 和山羊抗兔 IgG-HRP，均購自碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白酶抑制劑、TBS封閉液、ECL化學(xué)超敏顯影液(34095)和蛋白預(yù)染Marker，均購自Thermo公司。

1.2處理組菌株的制備將凍存的大腸桿菌在37 ℃下24 h 復(fù)蘇并擴(kuò)菌培養(yǎng)，采用瓊脂平板活菌計數(shù)法檢測菌液濃度，用無血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液將大腸桿菌菌液倍比稀釋至105、106和108CFU/mL，70 ℃下熱滅活30 min ，血瓊脂鑒定，無菌落生長后即可作為處理組菌液。

1.3細(xì)胞處理將實驗室凍存的 3～4 代BMEC 復(fù)蘇培養(yǎng)，計數(shù)后，按1×105個/mL 密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪滿后，無血清饑餓處理24 h。處理組加入105、106和108CFU/mL大腸桿菌熱滅活菌液，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)液為對照組，分別作用 6、12、24和48 h。

1.4引物的設(shè)計與合成根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中奶牛bFGF、FGFR2和β-actin的mRNA 序列，用 Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物由大連寶生物有限公司合成。具體引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

表1　引物序列及產(chǎn)物長度

1.5實時熒光定量PCR檢測大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞bFGF 和FGFR2 mRNA表達(dá)的影響將成熟的貼壁細(xì)胞按照TaKaRa RNAiso Plus試劑盒說明書提取總 RNA。取適量的RNA溶液，使用酶標(biāo)儀檢測其OD260和OD280，計算OD260/OD280，判斷RNA純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

以制備的cDNA為模板，利用特異引物，通過qPCR方法擴(kuò)增 bFGF、FGFR2和β-actin基因，利用2-ΔCt(△Ct=目的基因的Ct值-β-actin的Ct值)公式計算目的基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中相對表達(dá)量。

1.6采用Wesrern blot 技術(shù)檢測大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中bFGF 和FGFR2蛋白表達(dá)的影響B(tài)MEC 經(jīng)饑餓處理24 h后棄掉培養(yǎng)基，大腸桿菌菌液分別作用6、12、24和48 h，用PBS清洗后，加入裂解液，冰上裂解。刮取細(xì)胞，吸出裂解液，12 000 r/min 4 ℃下離心10 min。取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度，通過Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2結(jié)果與分析

2.1實時熒光定量PCR檢測不同濃度大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞 bFGF、FGFR2的標(biāo)準(zhǔn)曲線與熔解曲線利用內(nèi)參基因 β-actin 和目的基因bFGF、FGFR2 進(jìn)行 qPCR 檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖1可以看出，其引物反應(yīng)性良好，產(chǎn)物單一，可得到良好的定量結(jié)果。

注：A.bFGF qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線；B.FGFR2 qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。Note：A.Standard curve and melting curve of bFGF by qPCR；B.Standard curve and melting curve of bFGF by qPCR.圖1　bFGF、FGFR2 qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線Fig.1　Standard curve and melting curve of bFGF and FGFR2 by qPCR

2.2實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同濃度大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞 bFGF mRNA表達(dá)的量效關(guān)系從圖2可以看出，當(dāng)不同濃度的大腸桿菌菌液(105、106、108CFU/mL)作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞6、12、24、48 h后，bFGF mRNA的表達(dá)量與對照組相比極顯著增加(P<0.01)。在相同時間點，bFGF mRNA的表達(dá)量隨大腸桿菌菌液濃度的增加而增加，105、106、108CFU/mL大腸桿菌處理組bFGF mRNA的表達(dá)量均在24 h達(dá)到最大，24 h后bFGF mRNA的表達(dá)量有所降低。在相同濃度，bFGF mRNA的表達(dá)量隨時間的延長而增加，24 h bFGF mRNA的表達(dá)量達(dá)到最高，此后mRNA表達(dá)量降低。

注：**表示與陰性對照組差異極顯著(P <0.01)。Note：** indicated extremely significant differences with negative control group(P <0.01). 圖2　bFGF mRNA在不同濃度大腸桿菌中作用不同時間的相對表達(dá)量變化Fig.2　Changes of the bFGF mRNA relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.3實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同濃度大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞FGFR2 mRNA表達(dá)影響的量效關(guān)系從圖3可以看出，106CFU/mL大腸桿菌處理組FGFR2 mRNA表達(dá)量在24 h與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，F(xiàn)GFR2 mRNA表達(dá)量在12、24、48 h不同濃度大腸桿菌處理組均隨大腸桿菌菌液濃度的增大呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的變化趨勢。

注：* 表示與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。Note：* indicated significant differences with negative control group(P<0.05). 圖3　FGFR2 mRNA在不同濃度大腸桿菌中作用不同時間的相對表達(dá)量 Fig.3　Changes of the FGFR2 mRNA relative expression quantity in BMEC with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.4大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞 bFGF蛋白表達(dá)的影響從圖4和圖5可以看出，除12 h外，各濃度大腸桿菌處理組與陰性對照組差異極顯著(P<0.01)。同一時間點，bFGF蛋白表達(dá)量隨菌液濃度的增大呈現(xiàn)先升高再降低后升高的趨勢。在相同濃度大腸桿菌，bFGF蛋白表達(dá)量隨時間的延長而增加，24 h達(dá)到最大值。

注：1.陰性對照組；2.105 CFU/mL大腸桿菌處理組；3.106 CFU/mL大腸桿菌處理組；4.108 CFU/mL大腸桿菌處理組；A.6 h;B.12 h;C.24 h;D. 48 h。Note：1.Negative control group；2.105 CFU/mL E.coli treatment group；3.106 CFU/mL E.coli treatment group；4.108 CFU/mL E.coli treatment group；A.6 h；B.12 h；C.24 h；D.48 h.圖4　不同濃度大腸桿菌作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞不同時間點后β-actin 和bFGF 的Western blot檢測Fig.4　Western blot detection of β-actin and bFGF in BMEC treated with heat-inactivated Escherichia coli at different concentrations and time points

注：**表示與陰性對照組差異極顯著(P<0.01)。Note：** indicated extremely significant differences with negative control group(P<0.01).圖5　bFGF蛋白在不同濃度大腸桿菌中作用不同時間的相對表達(dá)量變化Fig.5　Changes of bFGF relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

注：1.陰性對照組；2.105 CFU/mL大腸桿菌處理組；3.106 CFU/mL大腸桿菌處理組；4.108 CFU/mL大腸桿菌處理組；A.6 h;B.12 h;C.24 h;D. 48 h。Note：1.Negative control group；2.105 CFU/mL E.coli treatment group；3.106 CFU/mL E.coli treatment group；4.108 CFU/mL E.coli treatment group；A.6 h；B.12 h；C.24 h；D.48 h.圖6　不同濃度大腸桿菌作用不同時間BMEC中β-actin 和 FGFR2的Western blot 檢測Fig.6　Western blot detection of β-actin and FGFR2 in BMEC treated with heat-inactivated Escherichia coli at different concentrations and time points

注：*表示與陰性對照組差異顯著(P<0.05)；**表示與陰性對照組差異極顯著(P<0.01)。Note：* indicated significant differences with negative control group(P<0.05); ** indicated extremely significant differences with negative control group(P<0.01).圖7　FGFR2蛋白相對表達(dá)量隨大腸桿菌的不同作用濃度和時間的變化Fig.7　Changes of FGFR2 relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.5大腸桿菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)的影響從圖6和圖7可以看出，F(xiàn)GFR2蛋白表達(dá)量隨著時間的延長、菌液濃度的增大而增加，105CFU/mL大腸桿菌處理組和106CFU/mL大腸桿菌處理組FGFR2蛋白表達(dá)量與陰性對照組在6 h差異極顯著(P<0.01)；106CFU/mL大腸桿菌處理組和108CFU/mL大腸桿菌處理組在24 h與陰性對照組差異極顯著(P<0.01)；6 h 108CFU/mL大腸桿菌處理組，12 h 106CFU/mL大腸桿菌處理組，108CFU/mL大腸桿菌處理的FGFR2蛋白表達(dá)量與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。在同一時間點，106CFU/mL大腸桿菌處理組和108CFU/mL大腸桿菌菌液處理組FGFR2蛋白表達(dá)量較高。在相同濃度下，24 h FGFR2蛋白表達(dá)量最高。

3討論與結(jié)論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)FGFs/FGFR 系統(tǒng)的過度激活可能導(dǎo)致纖維化。Inoue等[9]研究發(fā)現(xiàn)FGF2可作用于肌成纖維細(xì)胞，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖、致纖維化的作用。研究表明，F(xiàn)GF2 與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展可能有密切關(guān)聯(lián)，它可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞表型，成纖維細(xì)胞也會增生和分化成肌成纖維細(xì)胞，并過度生成 ECM，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷FGF 通路可緩解肺纖維化程度[10]，并且bFGF在纖維化的肺組織、血清、肺泡灌洗液中高表達(dá)且呈正相關(guān)，說明bFGF表達(dá)增強與肺纖維化關(guān)系密切[11]。研究表明，間質(zhì)及小管上皮細(xì)胞 FGF2在腎間質(zhì)纖維化過程中表達(dá)上升，說明FGF2可能與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)[12]。

筆者以熱滅活的大腸桿菌刺激體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，采用qPCR、Western blot方法檢測 bFGF的表達(dá)情況。結(jié)果表明，大腸桿菌顯著促進(jìn)了體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中 bFGF的表達(dá)。隨著大腸桿菌濃度的增加、作用時間的延長，bFGF 的表達(dá)上調(diào)，24 h bFGF表達(dá)量達(dá)到最高。該研究結(jié)果與吳建美[13]關(guān)于金黃色葡萄糖球菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞 bFGF 表達(dá)的趨勢基本一致，與嚴(yán)家春等[14]研究 bFGF-mRNA在慢性乙肝肝組織中的表達(dá)相一致，與張愚等[15]關(guān)于肝硬化相關(guān)的研究結(jié)果相一致。毛小榮[16]研究表明bFGF 可直接參與肝纖維化過程，bFGF還通過對其他細(xì)胞因子的影響，間接促進(jìn)纖維化的形成，如bFGF能促進(jìn) TGF 的產(chǎn)生，bFGF在肝組織局部為其他細(xì)胞因子發(fā)揮作用創(chuàng)造了條件，構(gòu)成了一個局部分子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。丁旭娜[17]和楊磊[18]研究表明外源性bFGF和含有bFGF的奶牛乳汁均可促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞bFGF的表達(dá)。該研究結(jié)果表明bFGF及其受體在大腸桿菌刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，由此可見大腸桿菌引起的奶牛乳腺纖維化過程bFGF發(fā)揮了重要作用。

bFGF 在細(xì)胞的增殖分化和ECM的過程中有重要的作用[3，5]。FGFR2為酪氨酸激酶受體，是bFGF最主要的受體，bFGF與其受體結(jié)合后可以激活細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇-3激酶和蛋白激酶 B(PI3K/AKT)等信號通路，起到調(diào)節(jié)如血管內(nèi)皮細(xì)、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層的細(xì)胞的分化增殖，還參與機(jī)體的多種生理病理學(xué)過程(如胚胎發(fā)育、組織愈合、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移)[19]。FGFR2表達(dá)異常，可能導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。在乳腺癌和胃癌基因拷貝數(shù)的增加，可使FGFR2過表達(dá)而導(dǎo)致FGFR2信號的激活[20-21]。研究表明，F(xiàn)GFR2基因表達(dá)量增加，引起乳腺癌和子宮頸癌等腫瘤形成的可能性也增加。該研究結(jié)果表明熱滅活的大腸桿菌能不同程度促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中FGFR2的表達(dá)。然而，關(guān)于bFGF與FGFR2結(jié)合引起奶牛乳腺纖維化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究有待進(jìn)一步研究。

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基金項目國家自然科學(xué)基金項目(31460642)。

作者簡介于亞娟(1986- )，女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：動物傳染病與免疫病理學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事動物傳染病與免疫病理學(xué)研究。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號S 852.61

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-175-04

Effects ofEscherichiacolion bFGF and FGFR2 mRNA Expression and Protein Secretion in Bovine Mammary Epithelial Cells Culturedinvitro

YU Ya-juan, WANG Feng-long*, DING Yu-lin et al

(College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

Abstract[Objective] To explore the effects of heat-inactivated Escherichia coli on the expression of bFGF and FGFR2 mRNA and protein in vitro bovine mammary epithelial cells. [Method] The mammary epithelial cells cultured in vitro were exposed to the heat-inactivated E. coli at 105, 106 and 108 cfu/mL, respectively. The total RNA and protein were extracted from the cells after 6, 12, 24 and 48 h, respectively, for examinations by real-time RT-PCR and western blot. [Result] The bFGF mRNA expressions in all cells treated with different concentration of bacteria were significantly higher than that in control cells at every time point (P < 0.01). bFGF expression quantity was the maximum at 24 h, and then reduced. BMEC bFGF protein expression enhanced as the E. coli concentration increased, and reached the maximum value at 24 h. Except the 6 h group, FGFR2 mRNA relative expression quantity showed a trend of decrease-increase-decrease as the E. coli concentration enhanced, and reached the maximum at 48 h. Compared with control group, FGFR2 protein expression in treatment groups increased as the bacteria concentration enhanced. [Conclusion] Heat-inactivated E. coli up-regulates the expression of bFGF and FGFR2 mRNA and protein in bovine mammary epithelial cells, showing concentration and time dependence.

Key wordsbFGF; FGFR2; Escherichia coli; Bovine mammary epithelial cells