任平　韓雙　張凱華

摘要：隨著高職教育課堂形式改革的不斷深入，理實(shí)一體化課堂形式已成為培養(yǎng)高職學(xué)生的主要運(yùn)行模式。大腸桿菌疫苗的制作是《生物藥物制備技術(shù)課程》的主修內(nèi)容，具有實(shí)踐性和應(yīng)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，為了使菌苗制作的工序過程更接近生產(chǎn)實(shí)際，讓學(xué)生“零距離”體驗(yàn)生產(chǎn)崗位的操作標(biāo)準(zhǔn)，掌握操作過程的技能與技巧，經(jīng)過多年來的探索和實(shí)踐，總結(jié)出模擬生產(chǎn)工藝制作大腸桿菌鋁膠滅活苗的一些經(jīng)驗(yàn)供相關(guān)學(xué)者參考。

關(guān)鍵詞：模似生產(chǎn)；流程；大腸桿菌

中圖分類號(hào)：G71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-913X（2017）01-0143-02

大腸桿菌疫苗制作的課堂教學(xué)在內(nèi)容設(shè)計(jì)上，由原來的零散實(shí)驗(yàn)如：培養(yǎng)基的制作、菌種的培養(yǎng)、細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法、鋁膠的配制、配苗和檢驗(yàn)等，改為模擬大腸桿菌的生產(chǎn)工藝流程，按照生產(chǎn)崗位的操作標(biāo)準(zhǔn)，以生產(chǎn)上的工序過程，利用理實(shí)一體化課堂教學(xué)模式，完成大腸桿菌鋁膠滅活苗的制作和檢驗(yàn)，全過程分基本知識(shí)介紹和基本技能操作兩部分。

一、基本知識(shí)介紹

讓學(xué)生課下復(fù)習(xí)大腸桿菌相關(guān)的理論知識(shí)，課堂上通過播放工業(yè)生產(chǎn)中大腸桿菌苗的視頻及課件了解大腸桿菌苗的整體制作過程；同時(shí)講清大腸桿菌每道工序操作的要點(diǎn)及注意事項(xiàng)。讓學(xué)生明晰在生產(chǎn)崗位所要從事的工作。

二、基本技能操作訓(xùn)練

整個(gè)操作過程分6道工序完成。將學(xué)生分成6個(gè)小組，按工序的順序進(jìn)行實(shí)施。完成每一道工序時(shí)，按生產(chǎn)上的操作標(biāo)準(zhǔn)（模擬生產(chǎn)要求）執(zhí)行，同時(shí)按要求檢驗(yàn)每道工序作品是否合格，合格后方可執(zhí)行下一道工序。

（一）菌種的選擇與鑒定

可選用購買的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種或按常規(guī)制作血液瓊脂平板或營養(yǎng)瓊脂平板，分離培養(yǎng)含大腸桿菌的病料（死于大腸桿菌病的動(dòng)物心血、腹水、肝滲出物、氣囊附著物或正常動(dòng)物的腸道內(nèi)容物），經(jīng)伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)，挑選出黑色帶金屬光澤菌落；經(jīng)靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)，結(jié)果呈陽性，VP試驗(yàn)，結(jié)果呈陰性；細(xì)菌經(jīng)涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，結(jié)果呈中等大小革蘭氏陰性（紅色）的桿菌；經(jīng)因子血清鑒定確定血清型后，可作為標(biāo)準(zhǔn)菌種使朋。菌種可保存在瓊脂斜面中（短期使用）或采用冷凍干燥法保存（長期使用），以免發(fā)生變異。

（二）種子培養(yǎng)及菌液的制備

取上述大腸桿菌菌種接種于伊紅美蘭瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板上，置37℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)典型菌落，移植于瓊脂斜面中作為種子。用滅菌吸管取5 mL馬丁肉湯加人大腸桿菌的瓊脂斜面中，用接種環(huán)刮取下菌體，研磨稀釋后倒入另一只滅菌試管中，置37%培養(yǎng)18～24h后，作為一級種子。將一級種子按10%的量再次接種馬丁肉湯中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)后，做為配苗菌液。取配苗菌液少量裝于滅菌試管中做菌數(shù)計(jì)數(shù)，其余菌液滅活待做配苗用（強(qiáng)毒細(xì)菌須在殺菌后，再行計(jì)數(shù)）。

（三）采用活菌計(jì)數(shù)法或比濁計(jì)數(shù)法對配苗菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)

活菌計(jì)數(shù)法可選用平板表面涂布法或傾注平板培養(yǎng)法。

1.活菌計(jì)數(shù)?；罹?jì)數(shù)法是將待測菌液精確地作一系列稀釋，然后吸取一定量某稀釋度的菌液樣品，選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行培養(yǎng)。一個(gè)活的細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后，在平板培養(yǎng)基上大量繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的菌落，從長出的菌落數(shù)及稀釋倍數(shù)，換算出每毫升待測菌液中的活菌數(shù)即細(xì)菌總數(shù)。

（1）平板表面涂布法

制備營養(yǎng)瓊脂平板。用商品化的營養(yǎng)瓊脂粉，按常規(guī)方法制作營養(yǎng)瓊脂平板8個(gè)，用前將營養(yǎng)瓊脂平板倒置在37℃溫箱中烘干1h，使其表面的水分蒸發(fā)。取出后將其分為4組，每組2個(gè)平板，第4組為對照組。

稀釋菌液。根據(jù)待測菌液中菌數(shù)含量的多少，在做培養(yǎng)之前，用普通肉湯或生理鹽水將被測菌液作10倍遞進(jìn)稀釋即10^-1、10^-2、10^-3、10^-4……。稀釋方法為：取滅菌試管6～10支，分別標(biāo)明稀釋倍數(shù)；每支試管中加入滅菌生理鹽水或肉湯9mL；另取滅菌吸管吸取待測菌液1mL，加入第1支試管中，充分混勻，稀釋倍數(shù)為10^-1；從第1支試管中吸取稀釋菌液1mL加入到第2支試管中，充分混勻，稀釋倍數(shù)為10^-2，如此一直稀釋到最后一支試管。

涂樣。另取三支滅菌吸管，分別吸取后三個(gè)稀釋度試管中的菌懸液0.1mL，對應(yīng)加在3組營養(yǎng)瓊脂平板上，每一個(gè)稀釋度菌液接種2個(gè)平板，用滅菌L形玻璃棒將菌液涂勻。在平皿底作好與試管稀釋度相同的標(biāo)記。第4組作對照，加稀釋液0.1mL。

培養(yǎng)。將上述各組的平板置37℃溫箱中培養(yǎng)1～2h，使菌液滲透于培養(yǎng)基內(nèi)，然后倒置培養(yǎng)24h。

計(jì)數(shù)。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，用肉眼觀察計(jì)算每個(gè)平板上的菌落數(shù)，必要時(shí)可用5-10倍放大鏡觀察，以免遺漏。一般選擇菌落數(shù)在30～300之間的平皿用以計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度應(yīng)取其菌落平均數(shù)，并求3個(gè)稀釋度之和再取其平均值，得出每毫升待測菌液所含的活菌數(shù)。按下式計(jì)算活菌數(shù)。

活菌數(shù)/mL=2個(gè)平板平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。舉例：在10^-8稀釋的平板中所得平均菌落數(shù)為85個(gè)。計(jì)算結(jié)果：85×10×10⁸=8.5×10¹⁰個(gè)活菌/mL

說明：對照組應(yīng)無菌落生長，否則試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，應(yīng)重做。

前一稀釋度的平均菌落數(shù)應(yīng)大致為后一稀釋度平均菌落數(shù)的10倍左右，如差別太大，則說明試驗(yàn)不準(zhǔn)確，應(yīng)重做。

（2）傾注平板培養(yǎng)法

待檢菌液稀釋方法同上。分別吸取后三個(gè)稀釋度試管中的菌懸液1mL加在滅菌平皿中，然后取預(yù)先融化且冷卻至50℃～55℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別傾入上述平皿中，立即搖勻平放，待其冷凝后，置37℃培養(yǎng)24h。統(tǒng)計(jì)平皿上長出的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出三個(gè)稀釋度的平均數(shù)，即為每毫升待測菌液所含的活菌數(shù)。

2.比濁計(jì)數(shù)法

比濁計(jì)數(shù)法是通過對比待測菌液與標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濁度，求出大致的細(xì)菌總數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)比濁管由國家生物制品檢定部門提供，每套包括一支細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管、數(shù)支對照空管和一張比濁用的圖片，說明書上注明標(biāo)準(zhǔn)管相當(dāng)于不同細(xì)菌種類的菌數(shù)，使用期為1年。也可自行制作標(biāo)準(zhǔn)比濁管。比濁計(jì)數(shù)法節(jié)時(shí)方便，但誤差大。

（1）標(biāo)準(zhǔn)比濁管的制備

選取口徑和管壁厚薄一致的潔凈試管10支，分別加入1%氯化鋇溶液，然后加入1%濃硫酸溶液，使各管總液量為10mL，加塞并用石蠟封固，保存?zhèn)溆?。各管加液量及濁度單位見?。

（2）比濁方法

取待測菌液1mL加入空試管中，與標(biāo)準(zhǔn)管并列緊貼在圖片前，使兩管受光均勻，透過兩管管壁對比觀察，目測圖片的清晰度。比濁時(shí)標(biāo)準(zhǔn)管與待測菌液管應(yīng)經(jīng)常搖勻。若待測菌液管較標(biāo)準(zhǔn)管過濃時(shí)，可在待測管中加適量生理鹽水進(jìn)行調(diào)整，直至兩管背后的圖片清晰度相同為止。

例如：測定大腸桿菌的菌數(shù)，若1mL菌液加入4mL的生理鹽水后，與標(biāo)準(zhǔn)管的濁度相同，即表示該菌液經(jīng)5倍稀釋后相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)管的菌數(shù)相當(dāng)于8億個(gè)/mL，故被測菌數(shù)為8×5=40億個(gè)/mL，

（四）滅活與檢驗(yàn)

滅活在疫苗制造上是將細(xì)菌及其產(chǎn)生的毒素用物理或化學(xué)方法處理，使其喪失毒力或致病性，而保留其抗原性的過程。滅活時(shí)，根據(jù)細(xì)菌的特性選用有效的滅活劑和最適的滅活條件。甲醛是大腸桿菌滅活中最有效的滅活劑，向上述培養(yǎng)的大量菌液中加人終濃度0.3%甲醛溶液，置37℃溫箱滅活24～48h。取少量滅活后菌液接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)3天，檢查無細(xì)菌生長，證明滅活完全。

（五）配制氫氧化鋁膠與配苗

將滅活后的菌液按5份菌液加入1份氫氧化鋁膠進(jìn)行配苗，大腸桿菌的菌液濃度為100億-400億個(gè)/ml。配苗時(shí)應(yīng)充分振蕩，加入0.01%硫柳汞防腐，置2～8℃靜置2-3天，抽棄上清液，濃縮成全量的60%。塞上膠塞，用固體石蠟溶化封口，貼上標(biāo)簽，注明菌苗名稱，使用前充分搖勻。在菌液中加入氫氧化鋁膠（佐劑），是為了增強(qiáng)免疫效果。

氫氧化鋁膠的制作：先用去離子水將無水A1Cl3配成25%溶液，加熱溶化，使用時(shí)稀釋成8%的溶液；另配4%NaOH溶液，將兩種溶液同時(shí)加溫至56℃～60℃。在此溫度下，將NaOH溶液緩慢加入于8%AlCl3溶液中，邊加邊攪拌，當(dāng)pH值達(dá)5.6-6.0時(shí)，即為終點(diǎn)，繼續(xù)攪拌10分鐘，置高壓滅菌器內(nèi)121.3℃滅菌20分鐘，氫氧化鋁膠呈透明略帶乳光液體，保存期不超過3個(gè)月。

（六）成品檢驗(yàn)

1.無菌檢查

取1ml鋁膠苗加入49ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72h后，移植于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中和酪胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，檢查無細(xì)菌生長。

2.安全檢驗(yàn)

取1月齡健康易感雞5只，各頸部皮下或肌肉注射鋁膠苗2ml，同時(shí)設(shè)不接種疫苗的對照組，與免疫組同條件飼養(yǎng)，觀察14天，應(yīng)健康存活，剖檢時(shí)，內(nèi)臟器官及注射部位應(yīng)無損傷。

3.效力檢驗(yàn)

取1月齡健康非免疫雞5只，各頸部皮下注射鋁膠苗0.5ml，21天后，連同條件的對照組雞5只，各腹腔注射致病性大腸桿菌的肉湯培養(yǎng)物0.5ml（含活菌2億～5億個(gè)）。攻毒后觀察14天，對照組雞應(yīng)全部發(fā)病或死亡，剖檢后具有典型病變；免疫組雞保護(hù)率在70%以上，為合格。

通過對學(xué)生模擬生產(chǎn)工藝制作大腸桿菌鋁膠滅活苗的理實(shí)一體化的課堂訓(xùn)練，不僅讓學(xué)生掌握生產(chǎn)大腸桿菌疫苗的操作技巧，學(xué)會(huì)細(xì)菌性滅活苗的制作，同時(shí)讓學(xué)生感受到自己是在生產(chǎn)崗位上工作，即是學(xué)習(xí)，又是工作，鍛煉了學(xué)生對應(yīng)職工作崗位的認(rèn)知和了解。又因?yàn)槭切〗M共同完成任務(wù)，又培養(yǎng)了學(xué)生共處共生、團(tuán)結(jié)協(xié)助的關(guān)系。為學(xué)生今后走向工作崗位打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[責(zé)任編輯：馬欣]