汪　穩(wěn), 林威敏, 陳　靜, 胡宇平, 毛小鴻, 肖天放

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的遺傳多態(tài)性

汪穩(wěn), 林威敏, 陳靜, 胡宇平, 毛小鴻, 肖天放

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

摘要:以莆田黑鴨為材料，對其主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ基因外顯子2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA測序，分析其遺傳多態(tài)性及變異特征，為進(jìn)一步尋求抗病分子提供依據(jù).結(jié)果表明，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2處有豐富的遺傳多態(tài)性，核苷酸變異以顛換為主，同義替換率大于非同義替換率，總GC含量較高，為59%，其中，密碼子第3位的GC含量最高，為82.7%.莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼的氨基酸有明顯的疏水性，對維持MHC分子的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用.聚類分析結(jié)果表明，禽類分支中，莆田黑鴨與家鵝的親緣關(guān)系較近，與雞的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

關(guān)鍵詞:莆田黑鴨; 主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ); DNA測序; 遺傳多態(tài)性

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)作為一類具有遺傳多態(tài)性的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白，與許多疾病的抗性、易感性、選擇性、免疫應(yīng)答及生產(chǎn)性能和遺傳進(jìn)化有著密切的關(guān)系[1].其中，絕大多數(shù)疾病與MHCⅠ類等位基因有關(guān)，Ⅰ類位點(diǎn)編碼的蛋白位于分子頂端的肽類結(jié)合區(qū)域，其復(fù)雜性和遺傳多態(tài)性使個(gè)體間的免疫應(yīng)答有所不同[2].劉志方等[3]研究表明，哈薩克綿羊MHCⅠ類基因第2、3外顯子序列具有豐富的遺傳多態(tài)性，堿基組成具有一定的不平衡性，并且經(jīng)過了自然選擇的作用，與NCBI數(shù)據(jù)庫中牛的序列比對分析顯示了跨物種遺傳多態(tài)性.胡丹丹等[4]研究表明，魚類MHC基因的遺傳多態(tài)性主要取決于群體內(nèi)MHC基因的大量等位基因及等位基因間高度的序列變異.因此，通過對MHCⅠ基因外顯子2序列遺傳多態(tài)性的研究來實(shí)現(xiàn)對MHC的初步分型具有重要的生產(chǎn)意義.

目前在MHC基因的研究中，對人和鼠的研究最為透徹[5-8]，為哺乳動物MHC基因的研究提供了理論基礎(chǔ).隨著哺乳動物MHC基因研究的不斷深入，人們對鳥類、魚類、兩棲類和爬行類等非哺乳動物的MHC基因研究也逐漸展開[9-12].但在水禽中，關(guān)于MHC基因的研究很少，尤其對家鴨的研究更為缺乏.此外，MHC是個(gè)多基因家族，其Ⅱ類基因的遺傳多態(tài)性比Ⅰ類基因明顯[13]，有關(guān)Ⅱ類基因遺傳多態(tài)性的研究報(bào)道較多，而Ⅰ類較少.鑒于此，本試驗(yàn)對莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序、比對和生物信息學(xué)分析，探究其分子特征、蛋白質(zhì)的理化特性及對外源性疾病的抗性或易感性，旨在為進(jìn)一步研究鴨的免疫系統(tǒng)發(fā)生機(jī)制及抗病機(jī)理提供參考.

1材料與方法

1.1材料

動物來源于福建石獅水禽保種中心.隨機(jī)選取成年莆田黑鴨50只(公∶母=2∶3)，翅靜脈采血，加入ACD抗凝(ACD∶血液=1∶6)，并置冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取參照酚氯仿法提取基因組DNA.采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行檢測，置冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.2.2引物設(shè)計(jì)參照GenBank提供的莆田黑鴨MHCⅠ基因(AB119993)外顯子2序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成.

表1　莆田黑鴨MHCⅠ基因位點(diǎn)及引物序列

1.2.3PCR擴(kuò)增建立總體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系，具體組成如下：2.5 μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、0.5 μL 10 mmol·L-1dNTP、20 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL、2.0 μL DNA模板、0.5 μL 2 U·μL-1Taq DNA聚合酶，加ddH2O至25 μL.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，56.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min.

1.2.4PCR產(chǎn)物的SSCP檢測取PCR產(chǎn)物與甲酰胺上樣緩沖液按3∶8的比例混合,于98 ℃變性10 min后迅速冰浴10 min.將變性好的PCR產(chǎn)物用微量注射器加到12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中，先于200～250 V高壓電泳5 min，后于140 V電壓電泳12～16 h，電泳結(jié)束后銀染顯色.

1.2.5測序經(jīng)PCR-SSCP分析后，將擴(kuò)增效果好的PCR產(chǎn)物按照回收試劑盒使用說明進(jìn)行回收純化操作.純化產(chǎn)物送天根生化科技有限公司進(jìn)行測序.

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Mega 4.1軟件比對DNA序列和相對應(yīng)的氨基酸序列，確定突變位點(diǎn)的位置和突變類型，用DnaSP5軟件計(jì)算簡約信息位點(diǎn)數(shù)和單個(gè)突變位點(diǎn)數(shù)，利用Mega 4.1軟件構(gòu)建多個(gè)物種間MHCⅠ基因外顯子2的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，分析親緣關(guān)系.

2結(jié)果與分析

2.1莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對不同個(gè)體莆田黑鴨基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.凝膠成像結(jié)果(圖1)顯示，特異性擴(kuò)增良好，片段大小位于260 bp左右，與預(yù)期大小(259 bp)相近.初步判斷所得片段為目的片段，可直接進(jìn)行測序.

2.2莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的核苷酸分析

2.2.1序列比對結(jié)果將測序所得的莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2序列與GenBank上莆田黑鴨MHCⅠ基因(AB119993)外顯子2序列進(jìn)行比對，得到18種不同的DNA序列，比對結(jié)果見圖2.

2.2.2突變位點(diǎn)將莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的18種DNA序列進(jìn)行比對.結(jié)果表明：18種核苷酸序列的共同保守區(qū)有173個(gè)位點(diǎn)；多態(tài)變異位點(diǎn)有84個(gè)，其中，簡約信息位點(diǎn)73個(gè)，單個(gè)突變位點(diǎn)11個(gè)，堿基插入或缺失位點(diǎn)3個(gè). 采用Mega 4.1軟件中的Kumar方法計(jì)算得到平均非同義替換率為0.144，平均同義替換率為0.173，平均非同義替換率與平均同義替換率的比值為0.832.

2.2.3核苷酸序列堿基組成莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2各基因型序列堿基組成(表2)顯示，該位點(diǎn)A、T、C和G的平均含量分別為22.3%、18.8%、25.4%和33.6%，G含量最高，GC含量為59.0%，AT含量為41.0%.由此可見，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的GC含量較高.

表2　莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的堿基組成

密碼子第1位A、T、C和G的平均含量分別為26.6%、20.0%、22.3%和31.5%，其中，G含量最高；密碼子第2位A、T、C和G的平均含量分別為35.9%、24.0%、19.5%和21.0%，其中，A含量最高，AT含量為59.9%，高于GC含量；密碼子第3位A、T、C和G的平均含量分別為4.2%、13.0%、34.4%和48.3%，其中，G含量最高，A含量最低，GC含量為82.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AT含量(17.2%).

2.2.4序列變異位點(diǎn)類型莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的突變類型和密碼子變異情況(表3)顯示，該位點(diǎn)的顛換頻率大于轉(zhuǎn)換頻率，密碼子第1位的轉(zhuǎn)換頻率與顛換頻率幾乎相同，密碼子第2和3位的顛換頻率大于轉(zhuǎn)換頻率.

表3　莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2 的轉(zhuǎn)換和顛換頻率1)

1)ii=同義替換數(shù)；si=轉(zhuǎn)換數(shù)；sv=顛換數(shù)；R=轉(zhuǎn)換數(shù)/顛換數(shù).

2.3莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的氨基酸序列

2.3.1氨基酸序列比對將莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的18種DNA序列翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比對.結(jié)果(圖3)顯示，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼86個(gè)氨基酸殘基，其中，多態(tài)變異位點(diǎn)有41個(gè)，簡約信息位點(diǎn)34個(gè)，單突變位點(diǎn)7個(gè).

2.3.2氨基酸組成從莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的氨基酸組成(表4)可以看出：該位點(diǎn)18種DNA序列中的第1～6、9～10和12～18類不編碼半胱氨酸，第1～4、9、12和14～15，18類不編碼賴氨酸，第5類不編碼甲硫氨酸；該位點(diǎn)編碼的氨基酸中半胱氨酸和賴氨酸所占比率最小，分別為0.32%和0.65%，精氨酸所占比率最多(11.15%).

表4　莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的氨基酸組成

通過計(jì)算可知，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼的中極性氨基酸與非極性氨基酸，帶正電荷的氨基酸與帶負(fù)電荷的氨基酸幾乎達(dá)到平衡.非極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)占35.81%；不帶電荷的極性氨基酸(甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)占36.89%；帶正電荷的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)占13.88%；帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占13.42%.

莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼的氨基酸中，疏水氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸)占39.12%，親水氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸)占30.92%，疏水氨基酸所占比率大于親水氨基酸.可見，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼的氨基酸有明顯的疏水性.

2.4莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2與其他物種的聚類分析

應(yīng)用Mega 4.1軟件中的Kimura雙參數(shù)遺傳距離法構(gòu)建莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2與其他物種的系統(tǒng)發(fā)育樹.結(jié)果(圖4)顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹分為3個(gè)分支，禽類為一個(gè)分支，禽類中的黑鴨(Anasrubripes)與家鵝(Anserdomestica)的親緣關(guān)系最近，其次為灰雁(Anseranser)，與雞(Gallusdomesticus)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；馬(Equuscaballus)和人(Homosapiens)為一個(gè)分支；家鼠(Musmusculus)單獨(dú)作為一個(gè)分支.

3討論

MHC基因區(qū)域的遺傳多態(tài)性已經(jīng)在很多脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，并主要由自然選擇來維持，由長期進(jìn)化過程中等位基因的積累、融合和擴(kuò)增形成，產(chǎn)生遺傳多態(tài)性的機(jī)制主要是突變和基因轉(zhuǎn)換[14-15].趙淑娟[16]對突變體黑羽鵪鶉MHCⅠ基因遺傳多態(tài)性的研究表明，其第4外顯子具有較高的遺傳多態(tài)性，在296 bp片段上有18個(gè)突變位點(diǎn)，運(yùn)用病毒感染后產(chǎn)生的抗體與第4外顯子遺傳多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的方法，尋找到抗病力強(qiáng)的基因型，這些基因可作為抗病力的主要候選基因，這一思路可以運(yùn)用到莆田黑鴨MHCⅠ外顯子2免疫功能的研究上，為鴨的抗病育種提供免疫遺傳學(xué)基礎(chǔ).

本試驗(yàn)利用PCR-SSCP技術(shù)對莆田黑鴨MHCⅠ基因的外顯子2進(jìn)行檢測，由于其遺傳多態(tài)性較豐富，判型比較困難，不適合SSCP分型進(jìn)而使用DNA測序，這一結(jié)果與劉瑩瑩[17]對江豚MHC-DQB外顯子2遺傳多態(tài)性的研究結(jié)果相似.本試驗(yàn)在50只莆田黑鴨中共檢測出18種不同的DNA序列類型，其位點(diǎn)編碼86個(gè)氨基酸殘基，其中，多態(tài)變異位點(diǎn)有41個(gè)，簡約信息位點(diǎn)34個(gè)，單突變位點(diǎn)7個(gè)，說明在MHC基因存在變異且遺傳多態(tài)性豐富，可以作為分子標(biāo)記，為家禽的抗病育種研究提供重要依據(jù).核苷酸突變分析結(jié)果表明，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2以顛換為主，這與李齊發(fā)等[18]對牛亞科MHCDRB3基因外顯子2序列變異的分析結(jié)果一致.一般認(rèn)為，自然選擇主要在蛋白質(zhì)水平上起作用，同義突變不造成氨基酸順序的任何變化，因而，同義突變被當(dāng)作選擇上呈中性突變的侯選者.本試驗(yàn)中，非同義替換率小于同義替換率，比值為0.832，說明莆田黑鴨在進(jìn)化過程中受負(fù)選擇的影響，這與劉志方等[3]對新疆哈薩克綿羊MHCⅠ基因外顯子2序列遺傳多態(tài)性的分析結(jié)果相似.說明非同義位點(diǎn)的進(jìn)化速度要高于同義位點(diǎn)，這一特點(diǎn)也可能使得新的基因變異產(chǎn)生和遺傳多態(tài)性增加，也為MHC基因適應(yīng)不斷變化的抗原創(chuàng)造了條件[19].

莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2突變位點(diǎn)為84個(gè)，GC含量為59%，突變率高，其高度的突變率表明MHCⅠ類分子與內(nèi)源性抗原的呈遞有關(guān)；而外顯子2作為其抗原結(jié)合區(qū)，證實(shí)了免疫系統(tǒng)的抗原多樣性，從而可以與疾病的抗性相關(guān)聯(lián).莆田黑鴨MHCⅠ基因密碼子第3位的GC含量為82.7%，表明該位點(diǎn)密碼子第3位受到突變壓的制約，其含量越大，受到的突變壓也相應(yīng)較大，這說明與維持MHC抗原分子的功能相關(guān).在氨基酸組成中，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2的極性氨基酸與非極性氨基酸，帶正電荷的氨基酸與帶負(fù)電荷的氨基酸幾乎達(dá)到平衡，疏水性氨基酸大于親水性氨基酸.由此可見，莆田黑鴨MHCⅠ基因外顯子2編碼的氨基酸有明顯的疏水性,而氨基酸的極性、帶電性和疏水性決定了MHC抗原的穩(wěn)定性和功能性，疏水性這一特征使得MHC抗原進(jìn)一步折疊，形成更緊密的空間結(jié)構(gòu)，從而與相應(yīng)抗原決定簇發(fā)生特異結(jié)合，發(fā)揮抗原呈遞作用.本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究MHCⅠ類分子的遺傳多態(tài)性與疾病抗性之間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為抗原表位疫苗的研發(fā)做了前期工作.

本試驗(yàn)對莆田黑鴨MHCⅠ基因的單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了PCR檢測和測序，尚未對多個(gè)位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性作出分析，存在一定的局限性.因此，繼續(xù)研究莆田黑鴨MHCⅠ基因的不同區(qū)域以找到更多的遺傳多態(tài)性位點(diǎn)是下一步工作的重點(diǎn).

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

收稿日期：2015-11-19修回日期：2016-05-04

基金項(xiàng)目:福建省高等學(xué)?？萍柬?xiàng)目(JA09082)；福建省高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目(2012N5001).

作者簡介:汪穩(wěn)(1991-)，女，碩士研究生.研究方向：動物遺傳育種.Email：1196867380@qq.com.通訊作者肖天放(1964-)，男，教授.研究方向：動物遺傳育種.Email：tfxiao@163.com.

中圖分類號:S834.89； S813．1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1671-5470(2016)04-0420-07

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.04.009

Genetic polymorphism of exon 2 inMHCⅠ gene of Putian black duck

WANG Wen, LIN Weimin, CHEN Jing, HU Yuping, MAO Xiaohong, XIAO Tianfang

(College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:To establish theoretical basis for duck breeding of disease-resistance species, genetic polymorphism analysis was conducted by PCR amplification and DNA sequencing of exon 2 in MHCⅠ gene from Putian black duck (hereafter referred to as exon 2). Results showed that exon 2 had high degree of genetic polymorphism, whose nucleotide variance was mainly attributed to transversion, and higher rate of synonymous substitution than non-synonymous substitution. The total content of GC in exon 2 was 59%, with the highest portion coming from the 3rd codon (82.7%). Amino acid composition analysis illustrated that exon 2 had high level of hydrophobicity, which might play a significant role in maintaining the structure and function of MHC. Moreover, cluster analysis showed that Putian black duck had a closer relationship with goose, and farther with chicken.

Key words:Putian black duck; major histocompatibility complex Ⅰ(MHCⅠ); DNA sequencing; genetic diversity