孟令聰，宋廣樹(shù)，2，呂慶雪，劉宏偉，2，張志軍，2，李春雷，王 敏，劉文國(guó)，2

（1.吉林吉農(nóng)高新技術(shù)發(fā)展股份有限公司，吉林公主嶺 136100；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130124）

花粉致死基因ZmAA1對(duì)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究

孟令聰1，宋廣樹(shù)1，2，呂慶雪1，劉宏偉1，2，張志軍1，2，李春雷1，王 敏1，劉文國(guó)1，2

（1.吉林吉農(nóng)高新技術(shù)發(fā)展股份有限公司，吉林公主嶺 136100；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130124）

為了研究花粉致死基因ZmAA1的功能，進(jìn)而創(chuàng)制轉(zhuǎn)ZmAA1基因玉米不育新材料。在GenBank中找到花粉致死基因ZmAA1及啟動(dòng)子Pg47，并在目的片段的上下游設(shè)計(jì)増加酶切位點(diǎn)，基因合成構(gòu)建到克隆載體puc57上，采用傳統(tǒng)酶切連接的方法構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系鄭58萌動(dòng)胚。成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar；共獲得94株除草劑抗性植株，其中47株目的片段PCR呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)溫室中表現(xiàn)為花粉敗育的PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行目的片段及篩選標(biāo)記bar基因RT-PCR與蛋白免疫學(xué)試紙條檢測(cè)，結(jié)果表明，花粉致死基因ZmAA1及啟動(dòng)子Pg47已經(jīng)整合到玉米基因組并表達(dá)。

玉米；ZmAA1基因；啟動(dòng)子Pg47；遺傳轉(zhuǎn)化

近幾十年來(lái)，雜種優(yōu)勢(shì)在玉米生產(chǎn)上已取得了舉世矚目的成就，雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是選育作物雄性不育系。但是傳統(tǒng)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系存在不育機(jī)理復(fù)雜［1-5］，對(duì)環(huán)境因素影響敏感，存在周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢、雜交不親和組合選育局限大等問(wèn)題，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段，利用基因工程獲得植物雄性不育已成為主流，為植物雄性不育開(kāi)辟了嶄新的途徑［6］。基因工程雄性不育是專(zhuān)一性地影響花藥花粉的正常發(fā)育，導(dǎo)致雄蕊失去其自身功能?；蚬こ谭椒ū苊鈧鹘y(tǒng)雜交育種的生殖隔離及遠(yuǎn)緣雜交分離的現(xiàn)象，能夠保持優(yōu)良性狀的遺傳和表達(dá)［7-9］。因此，利用基因工程創(chuàng)造雄性不育已成為利用的熱點(diǎn)。利用基因工程獲得雄性不育植株可以避免植物花粉、種子、果實(shí)等對(duì)環(huán)境造成的污染，對(duì)維持人體健康具有顯著意義［10］?；蚬こ滩挥€能有效控制外源基因通過(guò)花粉或種子逃逸到自然環(huán)境中，有利于轉(zhuǎn)基因植物的田間釋放及商業(yè)化生產(chǎn)［11］。

基因工程創(chuàng)建雄性不育系的經(jīng)典方法是以對(duì)細(xì)胞具有毒性作用的蛋白質(zhì)或酶基因作為目的基因，與花藥或花粉特異表達(dá)的啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，導(dǎo)入受體植株影響花粉正常發(fā)育導(dǎo)致雄性不育［12］。目前，Zmc13、5126和Pg47是從玉米中克隆的研究比較詳細(xì)的花粉致死基因的特異啟動(dòng)子。利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)，將花粉致死基因的特異啟動(dòng)子與目的基因連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化后使其在花粉中特異表達(dá)引起植物花粉敗育，獲得雄性不育系。ZMAA1基因是玉米基因編碼的α淀粉酶蛋白，屬于家族糖基水解酶，催化水解多糖分子（1-4）-α-D-糖苷鍵，并通過(guò)花粉發(fā)育后期特異啟動(dòng)子Pg47驅(qū)動(dòng)該基因表達(dá)，水解淀粉使花粉不育。通過(guò)基因工程創(chuàng)造植物雄性不育系已在一些作物上獲得了成功，利用雄性不育系制種是提高玉米雜交種種子質(zhì)量最有效的途徑之一。

本試驗(yàn)以ZMAA1基因及花粉致死基因的特異啟動(dòng)子Pg47為研究對(duì)象，構(gòu)建植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌侵染萌動(dòng)胚方法進(jìn)行玉米的遺傳轉(zhuǎn)化，旨在創(chuàng)制轉(zhuǎn)Pg47-ZmAA1基因玉米不育系新材料，為玉米雜種優(yōu)勢(shì)利用創(chuàng)建基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 供試材料

植物材料：優(yōu)良玉米自交系鄭58。菌株與質(zhì)粒：農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404及EHA105，puc-Pg47-ZmAA1質(zhì)粒及載體質(zhì)粒pCAMBIA3300為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉致死基因ZmAA1表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 用Hin dⅢ和Eco RⅠ對(duì)puc-Pg47-ZmAA1質(zhì)粒和pCAMBIA3300載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接回收的目的片段和載體片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)及核苷酸序列測(cè)定并繪制質(zhì)粒圖譜［13］，重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar。采用傳統(tǒng)熱擊法將重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404及EHA105中，并對(duì)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.2 ZmAA1基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化 侵染液的準(zhǔn)備：挑取LBA4404及EHA105菌株（含目的質(zhì)粒），于100 m L液體YEP培養(yǎng)基中（含有100 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平），28℃200 r/m in搖菌12 h，侵染前將菌液濃度稀釋至OD600≈0.8，用以侵染玉米萌動(dòng)胚。

試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：20%次氯酸鈉消毒鄭58玉米種子10 min，無(wú)菌水沖洗3次，在超凈臺(tái)里用解剖刀破壞玉米萌動(dòng)胚的生長(zhǎng)點(diǎn)約1～3 mm后浸泡于無(wú)菌水中，37℃水浴約4～5 h。

農(nóng)桿菌侵染萌動(dòng)胚：在超凈臺(tái)里將無(wú)菌水倒凈，將制備好的加入100μmol/L AS的農(nóng)桿菌工程菌液倒入其中，28℃220 r/min侵染24 h，然后把種子放在MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～4 d。

移栽：用高溫滅菌水洗掉菌體，移栽至花盆中，待長(zhǎng)到三葉期噴灑5 mg/L PPT進(jìn)行篩選，培養(yǎng)7 d左右，除去矮化、生長(zhǎng)緩慢的植株，選擇抗性植株移栽到溫室中。

1.2.3 轉(zhuǎn)化植株T0的PCR檢測(cè) 按照CTAB法提取玉米植株雄穗發(fā)育的小花分化期的DNA。針對(duì)Pg47基因及ZmAA1基因連接部位設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列為：PZ-F：5′-CAGGCAACAAG AGACACGA-3′；PZ-R：5′-CTGGATGGGTGAGGATG TA-3′。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株T0的RT-PCR檢測(cè)及蛋白免疫學(xué)試紙條檢測(cè) 對(duì)溫室中表現(xiàn)為花粉敗育的PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)。以玉米雄穗發(fā)育的小花分化期的RNA為模板，合成cDNA第一鏈。取2μL反應(yīng)液為模板，針對(duì)目的片段及篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。引物序列為：bar-F：5′-ACAAGCACGGTCAA CTTCC-3′PZ-F；bar-R：5′-ACTCGGCCGTCCAGTCG TA-3′PZ-R。

選用Envirologix公司的bar免疫學(xué)試紙條，以非轉(zhuǎn)基因植株為空白對(duì)照，對(duì)溫室中表現(xiàn)為花粉敗育的PCR陽(yáng)性植株T0轉(zhuǎn)化體進(jìn)行免疫學(xué)蛋白檢測(cè)。取玉米雄穗發(fā)育的小花分化期的花藥放在1.5 m L的Eppendorf管中。液氮將材料速凍，用鉆頭將材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL樣品提取緩沖液，將標(biāo)記的末端插入至離心管中，3～5 min內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)控線，最長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmAA1基因玉米單子葉植物表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

用Hin dⅢ和Eco RⅠ對(duì)puc-Pg47和載體質(zhì)粒pCAMBIA3300進(jìn)行雙酶切處理，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別回收4 407 bp目的基因片段和8 377 bp載體大片段。T4連接酶連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，活化單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及核苷酸序列測(cè)定（圖1-2）。結(jié)果表明，表達(dá)載體pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar中的Pg47、ZmAA1基因與原始基因序列完全一致，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3。將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404及EHA105中，并對(duì)轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出1 232 bp的目的片段，結(jié)果表明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中（圖1）。

圖1 載體pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar的構(gòu)建Fig.1 Construction of vector pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar

2.2 Zm AA1基因轉(zhuǎn)化玉米的結(jié)果

本試驗(yàn)轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系鄭58共2 200個(gè)萌動(dòng)胚，其中LBA4404菌株侵染1 000個(gè)萌動(dòng)胚及EHA105菌株侵染1 200個(gè)萌動(dòng)胚，共獲得94株除草劑抗性再生植株。由表1可見(jiàn)，2種菌株的抗性率存在差異，分別為5.30%和3.42%，轉(zhuǎn)化過(guò)程見(jiàn)圖4。

圖2 部分序列比對(duì)結(jié)果示意圖Fig.2 Partial sequence com parison between digested fragm ent and original gene

圖3 pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Sketch m ap of construction of pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar

表1 Zm AA1基因轉(zhuǎn)化玉米鄭58的結(jié)果Tab.1 The resu lts of Zm AA1 transgenic m aize

2.3 轉(zhuǎn)化植株T0的PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)94株除草劑抗性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。其中的47株擴(kuò)增出1 232 bp的目的片段，初步證明Pg47、ZmAA1 2個(gè)基因已經(jīng)整合到玉米花藥中（圖5）。

圖4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.4 Agrobacterium-m ediated transform ation of m aize germ inating em bryos

圖5 目的片段PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR am p lification resu lts of Pg47-Zm AA1 gene

2.4 轉(zhuǎn)化植株T0的RT-PCR檢測(cè)及蛋白免疫學(xué)試紙條檢測(cè)結(jié)果

圖6 T0轉(zhuǎn)基因玉米株系的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.6 RT-PCR am p lification resu lts of transgenic p lants in T0 generation

圖7 bar基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 RT-PCR am p lification resu lts of bar gene

對(duì)溫室中9株表現(xiàn)為花粉敗育的PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，5株花藥能夠擴(kuò)增出1 232 bp的目的片段（圖6），其中3株能擴(kuò)增出bar基因175 bp目的基因片段，試驗(yàn)結(jié)果表明篩選標(biāo)記bar基因轉(zhuǎn)化植株中已經(jīng)正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖7），9株表現(xiàn)為花粉敗育T0轉(zhuǎn)基因玉米bar蛋白免疫學(xué)試紙條檢測(cè)，結(jié)果表明篩選標(biāo)記bar基因轉(zhuǎn)化植株中，進(jìn)一步驗(yàn)證了Pg47、ZmAA1 2個(gè)基因已在T0轉(zhuǎn)基因玉米花藥中表達(dá)（圖8）。

3 討論

圖8 再生植株免疫學(xué)試紙條檢測(cè)Fig.8 bar imm unological test strip test of T0 transgenic p lants

利用人工和機(jī)械去雄，增加了制種成本，同時(shí)質(zhì)量也難以保障，提高種子純度、降低制種成本是當(dāng)前玉米生產(chǎn)上急待解決的問(wèn)題［14］。基因工程技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展和分子生物學(xué)的深入研究為創(chuàng)造植物雄性不育開(kāi)辟了一條嶄新的途徑?；蚬こ谭椒ǐ@得植物雄性不育的關(guān)鍵是影響花粉正常發(fā)育，因此，花粉或花藥特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的應(yīng)用已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)［15-16］。目前，已經(jīng)克隆到一些花藥或花粉特異性表達(dá)的基因及啟動(dòng)子，并應(yīng)用于植物雄性不育系統(tǒng)，美國(guó)杜邦先鋒公司發(fā)明了一種新型雜交種子生產(chǎn)技術(shù)體系-SPT（Seed production technology）技術(shù)，花粉致死基因ZmAA1及啟動(dòng)子Pg47應(yīng)用其中［17］。但是，大多國(guó)外的研究者開(kāi)發(fā)的基因和技術(shù)具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，因此，國(guó)內(nèi)學(xué)者克隆雄性不育新基因及創(chuàng)建新技術(shù)迫在眉睫。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化有多種受體類(lèi)型，不同玉米受體類(lèi)型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性不盡相同［18］。農(nóng)桿菌侵染玉米萌動(dòng)胚是近幾年快速發(fā)展起來(lái)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)試驗(yàn)條件要求較低，組織培養(yǎng)周期短、避免了產(chǎn)生變異不育株和轉(zhuǎn)化效率降低等現(xiàn)象，打破了基因型對(duì)于植株再生頻率的限制性［19］。王昌濤等［20］以玉米萌動(dòng)胚為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到PCR陽(yáng)性植株11個(gè)，轉(zhuǎn)化率為0.275%。張慧杰等［21］采用先水浴種子后劃胚的方法將BHMT基因?qū)胗衩谆蚪M中，轉(zhuǎn)化率為0.6%。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系鄭58萌動(dòng)胚，通過(guò)花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子Pg47驅(qū)動(dòng)獲得轉(zhuǎn)基因不育系新材料，經(jīng)過(guò)PCR和RT-PCR驗(yàn)證及蛋白免疫學(xué)試紙條檢測(cè)，初步證明外源基因已經(jīng)整合到基因組中，為玉米雜種優(yōu)勢(shì)利用創(chuàng)建基礎(chǔ)試材。

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Study on Transform ation in M aize of Pollen Lethal Gene Zm AA1

MENG Lingcong1，SONG Guangshu1，2，L Qingxue1，LIU Hongwei1，2，ZHANG Zhijun1，2，LIChunlei1，WANG Min1，LIU Wenguo1，2
（1.Jilin Jinong Agricultural New and Hi-Tech Develop Co.，Ltd，Gongzhuling 136100，China；2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130124，China）

In order to study the function of pollen lethal gene ZmAA1 and create tansgenic male sterile materials.ZmAA1 and its specific promoter Pg47 were found according to GenBank，designed to plus restriction endonuclease on the downstream and inserted them into an cloning vector puc57，construction of vector pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar used traditional construction methods digested connection.A maize inbred line Zheng 58 was infected by Agrobacterium tumefacfaciens with the vector pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，94 PPT-resistant seedlings were obtained and 47 plants were PCR positive.The pollen sterility in greenhouse RT-PCR assay for gene bar in the transgenic plant leaves and immuno strip test suggested that pollen lethal gene ZmAA1 had been integrated into the maize genome，and protein was expressed.

Maize；ZmAA1 gene；Pg47 promoter；Genetic transformation

S513.03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0101-06

10.7668/hbnxb.2016.03.015

2016-03-20

吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目（20140309005NY）；國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目（204BAD01B01）

孟令聰（1988-），女，吉林扶余人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事玉米遺傳育種研究。孟令聰、宋廣樹(shù)為同等貢獻(xiàn)作者。

劉文國(guó)（1971-），男，黑龍江牡丹江人，研究員，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。

張志軍（1972-），男，黑龍江雙鴨山人，研究員，碩士，主要從事玉米遺傳育種研究。