王國東，陳朝銀，李金晶，普麗梅，關瑞攀，葛 鋒，劉迪秋

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500）

漾濞大泡核桃JsWRKY1過表達增強轉基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性

王國東，陳朝銀，李金晶，普麗梅，關瑞攀，葛 鋒，劉迪秋

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500）

為進一步研究JsWRKY1的生物學功能，構建JsWRKY1的植物超表達載體并轉入煙草中過表達。再生的JsWRKY1轉基因煙草與野生型煙草在表型上無明顯差異。JsWRKY1過表達上調(diào)了轉基因煙草體內(nèi)幾個防衛(wèi)相關基因MnSOD、Cu/ZnSOD、CN、NADPH oxidase和PR1的轉錄水平。與野生型煙草相比，JsWRKY1轉基因煙草體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶活性在正常生長以及膠孢炭疽菌接種后均顯著增強。平板抑菌試驗結果顯示，JsWRKY1轉基因煙草葉片總蛋白對病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長具有不同程度的抑制作用。此外，用膠孢炭疽菌接種煙草葉片，轉基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性明顯增強。顯然，JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正調(diào)控病害防衛(wèi)反應的轉錄因子。

漾濞大泡核桃；WRKY轉錄因子；防衛(wèi)相關基因；抗氧化酶類；膠孢炭疽菌

WRKY轉錄因子是植物特有的轉錄因子超家族，主要參與植物體內(nèi)的轉錄調(diào)控及信號轉導過程［1］。WRKY轉錄因子通過調(diào)控植物體內(nèi)抗病相關基因的表達提高植物體的抗性。WRKY轉錄因子中包含一個或更多高度保守的WRKY結構域，WRKY結構域由大約60個氨基酸殘基組成，其中在N末端有高度保守的7個氨基酸殘基WRKYGQK。多數(shù)WRKY轉錄因子的DNA結合域中還含有一個鋅指結構，C2H2型（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）或C2HC型（C-X7-C-X23-H-X1-C）鋅指結構［2］。根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量及所含鋅指結構的特征可以將WRKY轉錄因子分為三大類，第Ⅰ類含有2個WRKY結構域以及C2H2型鋅指結構，第Ⅱ類含有1個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，第Ⅲ類也含有1個WRKY結構域和一個C2HC型鋅指結構［2］。

WRKY基因最早于1994年從甘薯（Impoea batatas）中分離出來［3］。至今為止，已經(jīng)在很多種植物中發(fā)現(xiàn)了WRKY基因的存在。WRKY轉錄因子是植物對病原體防衛(wèi)反應的關鍵組成部分，在植物防衛(wèi)反應中起重要作用。水稻（Oryza sativa）Os-WRKY13的超表達無論在苗期還是成株期都增強了轉基因植株對白葉枯?。╔anthomonas campestris pv. Oryzae）和稻瘟?。∕agnaporthe oryzae）的抗性［4］。OsWRKY22缺失的水稻突變體對稻瘟病的敏感性增強，而超表達OsWRKY22則可以提高轉基因水稻對稻瘟病的抗性［5］。在水稻中過表達OsWRKY53也增強了對稻瘟病的抗性［6］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達AtWRKY28增強對甘藍鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性［7］。過表達Pt-WRKY23的轉基因楊樹（Populus tremula）對Melampsora spp.的抵抗能力顯著增加［8］。PtWRKY14超表達則可增強煙草（Nicotiana tabacum）對TMV侵染的抵抗能力［9］。研究表明，一些WRKY轉錄因子負調(diào)控植物對生物和非生物脅迫有防衛(wèi)反應。擬南芥AtWRKY38和AtWRKY62與組蛋白去乙?；?9共同作用負調(diào)控擬南芥的基本防御［10］。

核桃（Juglans）是世界重要的堅果類果樹和木本油料樹種，我國核桃栽培歷史已有2 000多年，現(xiàn)出口量居世界第2位。漾濞大泡核桃（J.sigillata Dode），原產(chǎn)云南省漾濞縣，現(xiàn)廣泛分布于云南10余個縣，以及貴州、四川等省份的部分地區(qū)，為云南的早期無性優(yōu)良品種。漾濞大泡核桃具有果大、殼薄、仁厚、味香、含油率高等優(yōu)點，是云南省重要的經(jīng)濟林樹種之一，對云南的核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展起著重要的作用［11］。然而，隨著核桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，病蟲害問題日益凸顯，尤其是真菌病害。常見的核桃病害主要有灰斑病、黑斑病、炭疽病等。前期研究中，從漾濞大泡核桃中克隆獲得一個Ⅱc類WRKY基因JsWRKY1，水楊酸、茉莉酸、H2O2和乙烯等幾種逆境脅迫相關信號分子處理均上調(diào)JsWRKY1在漾濞大泡核桃葉片中的表達量，同時JsWRKY1快速響應膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的侵染，膠孢炭疽菌接種后4 h，轉錄物在葉片中大量富集［12］。為進一步研究JsWRKY1的生物學功能，構建了JsWRKY1的植物超表達載體將其轉入煙草中超表達，并對轉基因煙草中幾個防衛(wèi)相關基因的表達以及抗氧化酶活性進行分析，還檢測了JsWRKY1轉基因煙草在體外對幾種病原真菌的抗性，尤其是JsWRKY1轉基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

遺傳轉化所用無菌煙草苗由生物資源開發(fā)與利用實驗室培養(yǎng)。將煙草（N.tabacum L.cv Xanthi）種子表面消毒后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)的幼苗繼代培養(yǎng)8周后用于轉基因。所用病原真菌葡萄座腔菌（Botrosphaeria dothidea）、串珠狀赤霉菌（Gibberella moniliformis）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）均由本實驗室分離鑒定并保存，使用前接種于PDA培養(yǎng)基上進行活化。

1.2 JsWRKY1植物超表達載體構建

本試驗采用pCAMBIA2300S作為植物超表達載體，其T-DNA區(qū)含有2個花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子，并具有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。在擴增JsWRKY1 ORF的特異引物的5′端分別添加限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ的識別位點，并合成特異性引物5′-GGATCCTGTAAAAC CTATTCGGACATTCTTC-3′和5′-GAATTCACCGAG GAGGGAGGCAGGT-3′擴增JsWRKY1的ORF。擴增產(chǎn)物首先連接到pMD-18T載體（TaKaRa，Japan）中。重組載體pMD-18T-JsWRKY1經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切后獲得JsWRKY1的ORF，并與用同樣的限制性內(nèi)切酶消化后的pCAMBIA2300S空載體進行連接。將連接產(chǎn)物pCAMBIA2300S-JsWRKY1（圖1）轉入大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株中，并通過PCR篩選獲得陽性克隆。

1.3 煙草遺傳轉化

采用凍融法將重組載體pCAMBIA2300SJsWRKY1轉入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。用含重組載體pCAMBIA2300S-JsWRKY1的農(nóng)桿菌LBA4404菌液浸染煙草無菌苗的葉盤。在無菌條件下將幼嫩的煙草葉片剪成約1 cm2的葉盤，將葉盤浸入農(nóng)桿菌菌液中，浸染15 min后用無菌濾紙將葉盤表面的菌液吸干，把葉盤平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)48 h。暗培養(yǎng)結束后，將葉盤轉至煙草篩選培養(yǎng)基上并放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃，光照16 h/d）。分化再生的幼苗轉入含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L頭孢霉素的煙草生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

圖1 JsWRKY1基因表達框Fig.1 The exp ression cassette of JsWRKY1

1.4 陽性轉基因煙草篩選

采用CTAB法提取再生煙草植株的基因組DNA，取1μL所提取的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性并測其濃度。并以再生煙草植株的基因組DNA為模板用JsWRKY1的特異引物進行PCR反應。分別以pMD-18T-JsWRKY1質粒和野生型煙草（W ild type，WT）的基因組DNA為陽性對照和陰性對照。PCR反應結束后，取8μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并挑選陽性轉基因煙草植株。T0陽性轉基因煙草于溫室中培養(yǎng)，獲得T1轉基因煙草。

1.5 煙草葉片RNA提取及qRT-PCR（Quan tita-tive reverse transcrip tion-PCR）

采用異硫氰酸胍一步法提取T1轉基因煙草葉片的總RNA，并采用GoScriptTMReverse試劑盒（Promega）將總RNA逆轉錄成第一鏈cDNA。接著采用Real-time PCR分析JsWRKY1在T1煙草葉片中的表達水平。此外，還通過qRT-PCR分析7個防衛(wèi)相關基因（MnSOD、CN、NADPH oxidase、Cu/ZnSOD、MYC、PR1和Osmotin）在T1轉基因煙草植株和WT煙草葉片中的轉錄水平。反應條件為：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)，之后進行熔解曲線分析。以煙草Actin基因作為內(nèi)參基因，qRT-PCR中每個反應均設置3次重復，并采用2-ΔΔCT法計算得出相對表達水平?；虻囊镄蛄幸姳?。

1.6 酶活性測定

取正常生長及膠孢炭疽菌接種后10 d的煙草葉片，提取粗酶液，酶液中的蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法。煙草葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性測定參照Gay和Tuzun［13］的方法。試管中依次加入50 mmol/L PBS（pH值7.8） 0.8 mL、26 mmol/L L-蛋氨酸（L-methionine）1.5 mL、0.75 mmoL/L四唑氮藍（NBT）0.3 m L、粗酶液0.1 m L，20μmol/L核黃素（Riboflavin）0.3 m L，充分搖勻，以25℃暗反應作為空白對照，在25℃、光強為45 000 lux的培養(yǎng)箱內(nèi)光照15 m in后迅速取出在560 nm波長下測定OD值，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活單位。抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbateperoxidase，APX）活性的測定參照Nakano和Asada［14］的方法。取1.5 m L 50 mmol/L（pH值7.0）磷酸鈉緩沖液加入50μL粗酶液，混勻，作為控制參照。最后在其他比色皿中加入1.5 m L 50 mmol/L反應液，并加入100μL 1 mmol/L H2O2啟動反應，在290 nm處每20 s測定一次OD值。過氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活測定采用愈創(chuàng)木酚法［15］，取試管加入3 mL反應液以及30μL酶液，以PBS為對照調(diào)零，在波長為470 nm處每隔40 s測一次OD值。以每1 m in OD值變化0.01為1個酶活單位（U）。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 The prim er sequences used in qRT-PCR

1.7 轉基因煙草粗蛋白的體外平板抑菌試驗

參照Li等［16］的方法提取4個T1轉基因煙草和WT植株葉片的總蛋白。幾種供試病原真菌活化培養(yǎng)后取適量菌絲接種于新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，待真菌菌落直徑生長至大約2～3 cm時，在菌落周圍均勻放置直徑約為0.8 mm的無菌濾紙片，并將所提取的煙草粗蛋白濃度分別稀釋到5 mg/m L，分別取20μL蛋白溶液滴到濾紙片上，以蛋白提取緩沖液為空白對照。置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，培養(yǎng)期間觀察轉基因及野生型煙草葉片總蛋白對幾種真菌生長的抑制情況。

1.8 轉基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性分析

將膠孢炭疽菌接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)5～7 d，用無菌水洗脫分生孢子，并制成孢子懸液。以溫室栽培的JsWRKY1轉基因煙草和野生型煙草為試材，用砂紙在葉片上輕輕摩擦出同等規(guī)格的傷口，接上200μL的孢子懸液，然后用保鮮膜包裹葉片保持濕度。10 d后，收集接種葉片，觀察JsWRKY1轉基因煙草葉片和野生型煙草葉片受膠孢炭疽菌侵染的發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 JsWRKY1轉基因煙草產(chǎn)生與篩選

在前期研究中，基于轉錄組測序結果從漾濞大泡核桃中分離克隆了一個WRKY轉錄因子基因JsWRKY1，本試驗成功構建了JsWRKY1的植物表達載體pCAMBIA2300S-JsWRKY1，并采用凍融法轉入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。利用攜帶有JsWRKY1表達框的根癌農(nóng)桿菌LBA4404分12次浸染200多個煙草葉盤。挑選生長良好的具有卡那霉素抗性的轉基因煙草再生植株49株，經(jīng)PCR分析檢測獲得具有目的基因JsWRKY1的陽性轉基因煙草35株，即為JsWRKY1的T0轉基因煙草，部分煙草轉基因植株的PCR檢測結果如圖2所示。將JsWRKY1的T0轉基因煙草種于溫室中培養(yǎng)并獲得 T1植株。JsWRKY1超表達的陽性轉基因煙草植株與WT煙草的生長發(fā)育及形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。隨后，隨機選取8個轉基因株系W 8、W 11、W 14、W 15、W 17、W 18、W 33和W 43進行基因表達分析。

圖2 轉基因煙草的PCR檢測Fig.2 PCR analysis of som e JsWRKY1 transgenic tobacco p lantlets w ith resistance to K anam ycin

2.2 JsWRKY1在T1轉基因煙草中大量表達

利用qRT-PCR檢測8個轉基因煙草株系中JsWRKY1的表達水平，試驗結果表明，JsWRKY1在8個陽性轉基因煙草株系中均檢測到JsWRKY1轉錄物的積累，而在WT中未檢測出JsWRKY1（圖3）。就相對表達水平而言，JsWRKY1在W 43株系中的表達量最高，在W15株系中的表達量最低，在W 17和W 18株系中也大量表達?？梢娛蹸aMV 35S啟動子控制的JsWRKY1基因在T1轉基因煙草中穩(wěn)定表達。挑選JsWRKY1表達水平相對較高的4個轉基因株系W 8、W 17、W18、W 43進行后續(xù)試驗。2.3 幾個防衛(wèi)相關基因在JsWRKY1轉基因煙草中的表達

圖3 JsWRKY1在轉基因T1植株中的表達水平分析Fig.3 qRT-PCR analysis for JsWRKY1 expression levels in several transgenic T1 tobacco lines

利用qRT-PCR分析7個抗逆相關基因（Mn-SOD、C N、Cu/ZnSOD、NADPH oxidase、MYC、PR1和Osmotin）在JsWRKY1轉基因煙草中表達水平的變化，試驗如圖4所示。與野生型煙草（WT）相比，Osmotin在4個JsWRKY1轉基因煙草株系中的表達量明顯降低。然而其他6個基因在JsWRKY1轉基因煙草中的表達水平均表現(xiàn)出不同程度地上調(diào)。而且，不同轉基因煙草株系中同一個基因的表達水平也不盡相同。MYC和Cu/ZnSOD在各轉基因煙草株系中表達水平的上調(diào)幅度較為一致，分別約為WT的3.5～4.5，11.0～13.5倍；另外4個抗逆相關基因在幾個JsWRKY1轉基因煙草株系中表達水平差異較大，尤其是PR1，PR1在轉基因煙草株系W 17中的表達水平約為WT的10.3倍，而在轉基因煙草株系W 18中的表達水平約為WT的86.5倍。上述結果表明，JsWRKY1在轉基因煙草中的過量表達提高了MnSOD、C N、NADPH oxidasec、Cu/ZnSOD、MYC和PR1等防衛(wèi)相關基因的轉錄水平。

圖4 幾個抗病相關基因在JsWRKY1轉基因煙草中的表達水平分析Fig.4 qRT-PCR analysis of several disease resistance-related genes in the JsWRKY1 transgenic tobacco lines

2.4 JsWRKY1過表達增強轉基因煙草中3種抗氧化酶的酶活性

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是細胞正常氧代謝的副產(chǎn)物，并在細胞信號傳遞和保護機體方面起到重要作用，但是在遭受逆境脅迫后，植物細胞中會積累大量ROS。當ROS的積累量超出活性氧清除系統(tǒng)的能力時，植物體內(nèi)蛋白質、膜脂以及其他細胞組分受到氧化損傷，從而使植物產(chǎn)生各種不良的生理反應，嚴重者甚至會造成植株死亡。細胞表達的POD、SOD和APX等抗氧化酶類，他們協(xié)同作用可以將植物體內(nèi)的活性氧維持在穩(wěn)定水平，從而保證植物的正常生長代謝。為了研究轉基因株系中JsWRKY1是否調(diào)控這些抗氧化酶的活性，筆者測定了轉基因株系W8、W17、W18、W 43和WT煙草中的POD、SOD和APX酶活（圖5）。正常生長情況下，與野生型煙草相比，幾個JsWRKY1轉基因煙草株系中POD、SOD、APX顯著提高，尤其是POD，在所有供試JsWRKY1轉基因煙草株系中均極顯著上調(diào)。接種膠孢炭疽菌后，轉基因煙草及野生型煙草中POD、SOD、APX均明顯增強，但所有轉基因株系中3種抗氧化酶的活力遠高于野生型煙草。上述結果無疑表明，POD、SOD和APX活性在轉基因煙草株系中的顯著增強與JsWRKY1的超表達緊密相關。

2.5 JsWRKY1轉基因煙草葉片總蛋白在體外抑菌活性

提取4個JsWRKY1 T1轉基因煙草葉片及WT煙草葉片的總蛋白進行體外平板抑菌試驗，結果如圖6所示，蛋白提取緩沖液（空白對照）對病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的生長沒有抑制作用。WT煙草的葉片總蛋白對4種病原真菌的菌絲生長具有較弱的抑制作用。盡管各個株系對不同病原菌的抑菌作用不盡相同，但是4個JsWRKY1轉基因煙草葉片總蛋白對這4種病原真菌菌絲的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

圖5 W T及JsWRKY轉基因煙草中POD、SOD和APX的酶活Fig.5 The antioxidant enzym e activity of W T and JsWRKY1 transgenic tobacco lines

圖6 JsWRKY1轉基因煙草株系葉片總蛋白的體外抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of the crude p rotein extract of JsWRKY1 transgenic tobacco lines

圖7 JsWRKY1轉基因煙草株系增強對膠孢炭疽菌的抗性Fig.7 Resistance of JsWRKY1 transgenic tobacco lines against C.gloeosporioides in vivo inoculation assay

2.6 JsWRKY1轉基因煙草增強對膠孢炭疽菌的抗性

用膠孢炭疽菌侵染JsWRKY1轉基因煙草葉片和野生型煙草葉片，接種10 d后，野生型煙草葉片出現(xiàn)了嚴重的褪綠黃化，接種部位腐爛，而4個JsWRKY1轉基因煙草葉片接種后褪綠黃化現(xiàn)象并不明顯，接種部位只表現(xiàn)出輕微的腐爛，可見JsWRKY1轉基因煙草增強了對膠孢炭疽菌的抗性（圖7）。

3 討論與結論

在與病原微生物的長期斗爭過程中植物形成了復雜的防衛(wèi)反應網(wǎng)絡以應對病原菌的攻擊。植物防衛(wèi)反應由相互聯(lián)系的2個分支組成，一是病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）激發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI），二是效應物激發(fā)的免疫（Effector-triggered immunity，ETI）［17］。PTI以及ETI激活局部抗性及系統(tǒng)獲得抗性（System ic acquired resistance，SAR）。WRKY轉錄因子是植物防衛(wèi)反應相關轉錄因子網(wǎng)絡中的一個調(diào)控蛋白基因家族，主要參與植物免疫系統(tǒng)應對多種不同的生物和非生物脅迫［18-19］。WRKY蛋白與靶基因啟動子區(qū)的順式作用元件核心結構是TTGAC（C/T）的W-box特異結合，即所有啟動子中含W-box的基因都可能是WRKY的靶基因，包括WRKY本身［20］。WRKY結構域由4股β折疊構成，保守的WRKYGQK殘基對應于N端的β折疊（Strandβ-1），能夠進入DNA溝并與DNA上的W盒發(fā)生作用［21］。

已經(jīng)明確WRKY轉錄因子家族是PTI以及ETI的關鍵調(diào)控因子，正向或負向調(diào)控植物的防衛(wèi)反應和信號轉導途徑［18，22-23］。OsWRKY13通過激活水楊酸（SA）的生物合成以及SA反應相關基因的表達同時抑制茉莉酸（JA）信號途徑調(diào)控水稻對細菌病害白葉枯病以及真菌病害稻瘟病的抗性［4，24］。Os-WRKY30超表達的轉基因水稻提高了對稻瘟病以及紋枯病菌的抗性，抗性的提高與JA生物合成相關基因、PRs基因的表達激活以及內(nèi)源JA積累的增強相關［25］。本試驗對漾濞大泡核桃的一個WRKY轉錄因子基因JsWRKY1的功能進行分析，JsWRKY1超表達的轉基因煙草株系中，幾個逆境脅迫相關基因C N、NADPH oxidasec、MYC和PR1的轉錄水平明顯上調(diào)，暗示JsWRKY1正調(diào)控這些防衛(wèi)相關基因的表達。

植物受病原物侵染過程中，活性氧是一類很重要的信號分子，活性氧分子可以誘導植物對病原物的抗性。但是，氧爆發(fā)時植物體內(nèi)將會產(chǎn)生大量的活性氧，過多的活性氧積累將會對植物產(chǎn)生毒害，并可破壞植物細胞的正常代謝。本試驗中，qRT-PCR結果顯示2個編碼SOD的基因MnSOD以及Cu/Zn-SOD在幾個JsWRKY1轉基因煙草株系中的表達水平較野生型而言明顯上升。此外，轉基因株系的3種抗氧化酶酶活，即SOD、APX、POD在正常生長情況下及接種膠孢炭疽菌接種后顯著增強。顯然，JsWRKY1在煙草中過量表達不僅調(diào)控幾個SOD基因的轉錄水平，還激活了體內(nèi)的SOD、APX、POD酶活性。

目前已從模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中分離了大量WRKY轉錄因子。AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY33作為正調(diào)控因子對死體營養(yǎng)型真菌Alternaria brassicicola以及Botrytis cinerea具有抗性［26-27］。WRKY轉錄因子基因家族的多個成員正調(diào)控水稻對稻瘟病菌、紋枯病菌等的抗性［4，24-25，28］。在非模式植物中關于WRKY轉錄因子調(diào)控植物抗病防衛(wèi)反應的研究也越來越多，如毛白楊（Populus tomentosa）PtoWRKY60、毛果楊（P.trichocarpa）PtrWRKY73、麝香葡萄（Muscadinia rotundifolia）M rWRKY30等WRKY轉錄因子均正調(diào)控植物的抗病防衛(wèi)反應［29-31］。本試驗中，JsWRKY轉基因煙草葉片粗蛋白在體外能夠抑制病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長，并且葉片接種試驗結果也顯示JsWRKY轉基因煙草對膠孢炭疽病的抗性明顯增強。上述試驗無疑表明JsWRKY1是漾濞大泡核桃中參與應對膠孢炭疽菌防衛(wèi)反應的重要調(diào)控因子。

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Overexpression of a WRKY Transcription Factor Gene from Juglans sigillata Dode Confers Resistance to Colletotrichum gloeosporioides in Transgenic Tobacco Plants

WANG Guodong，CHEN Chaoyin，LI Jinjing，PU Limei，GUAN Ruipan，GE Feng，LIU Diqiu
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

To investigate the function of JsWRKY1，a constitutive expression vector of JsWRKY1 was constructed and transferred into Nicotiana tabacum L.cv Xanthi.There were no visible differences between the positive transgenic plants and WT.The expression levels of several defense-related genes MnSOD，Cu/ZnSOD，CN，NADPH oxidase，and PR1 resistance gene were up-regulated in the transgenic tobacco lines，and the SOD，APX and POD showed significantly higher activities in the transgenic lines than in wild type under normal conditions or after inoculation with C.gloeosporioides.The crude protein extract of transgenic tobacco lines inhibited the hyphal growth of the following four fungi，Botrosphaeria dothidea，Gibberella moniliformis，C.gloeosporioides and Fusarium oxysporum at different degrees.The antifungal activity in vitro plates demonstrated that the activities of SOD in the transgenic tobacco lines were significantly higher than those in WT.Moreover，the transgenic tobacco plants showed strong resistance after inoculation with C.gloeosporioides in the leaves.In conclusion，the JsWRKY1 is a positive transcription factor of J.sigiuata regulating the defense response to pathogens.

Juglans sigillata dode；WRKY transcription factor；Defense-related genes；Antioxidant enzyme；Colletotrichum gloeosporioides

Q78；S436.62 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0155-08

10.7668/hbnxb.2016.03.023

2016-03-11

科技部支撐計劃項目（2011BAD46B00）

王國東（1993-），男，云南普洱人，主要從事生物工程研究。

劉迪秋（1979-），女，湖北建始人，教授，博士，主要從事植物抗病基因工程研究。