王雙玲　　劉峰　　陳江聲作者單位：515000　　汕頭　　汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液腫瘤科

姜黃素對急性早幼粒白血病細(xì)胞增殖分化及cofilin表達(dá)的影響

王雙玲劉峰陳江聲
作者單位：515000汕頭汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液腫瘤科

【摘要】目的 探討姜黃素對急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞（以下簡稱“HL-60細(xì)胞”）增殖、分化及絲切蛋白（cofilin）表達(dá)的影響。方法 以不同濃度（6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L）姜黃素作用于HL-60細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照組。作用24 h后，采用MTT法檢測姜黃素對細(xì)胞增殖能力的影響，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，雙向電泳與質(zhì)譜分析檢測cofilin蛋白表達(dá)。結(jié)果 不同濃度姜黃素作用24 h后，空白對照組細(xì)胞生長抑制率為0，6.25 μmol/L組、12.5 μmol/L組和25 μmol/L組分別為（6.46±0.73）%、（9.79±1.36）%和（79.48±7.99）%，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨藥物濃度遞增，抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性（P＜0.05）；倒置相差顯微鏡觀察可見典型細(xì)胞生長阻滯的形態(tài)改變；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)姜黃素濃度為12.5 μmol/L時，細(xì)胞阻滯在G2/M期；雙向電泳與質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)姜黃素可下調(diào)HL-60細(xì)胞cofilin的表達(dá)。結(jié)論 姜黃素可在體外抑制急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性，且在一定血藥濃度時可使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，從而阻滯細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能與姜黃素下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cofilin的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白血?。唤S素；急性早幼粒白血病細(xì)胞；絲切蛋白

姜黃素（curcumin，CUR）是從姜科姜黃屬植物姜黃（curcumalonga）根莖中提取的一種酚性色素。多項(xiàng)研究表明，姜黃素不僅具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化等作用，同時還顯示出廣泛的抗腫瘤作用［1～3］。本研究在體外研究姜黃素對急性早幼粒白血病細(xì)胞增殖、分化的影響，并探討其初步作用機(jī)制，以期為姜黃素用于臨床治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　材料和方法

1.1儀器與試劑

姜黃素購自美國Sigma公司，分子式為C21H20O6，相對分子量為368.39，純度＞99%，用二甲基亞砜（DMSO）稀釋，微孔濾膜（0.22 μm）除菌，等量分裝，-20℃保存，使用前解凍。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞（以下簡稱“HL-60細(xì)胞”）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），HL-60細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，每48 h換液傳代1次。HL-60細(xì)胞懸浮生長，實(shí)驗(yàn)前24 h半量換液，取處于對數(shù)生長期、細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3方法

1.3.1MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心后加入含有不同濃度（6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L）姜黃素的培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照組。調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×105/L，96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入異丙醇三聯(lián)液100 μL，溫箱孵育12 h，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測492 nm波長處OD值，最后結(jié)果取5個復(fù)孔均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）× 100%。

1.3.2倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心后加入含有不同濃度（6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L）姜黃素培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照組，培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，同時記錄拍照。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。1 000 r/min離心5 min，去除無血清培養(yǎng)基，加入含有不同姜黃素濃度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，重懸于70%冷乙醇中，4℃保存。檢測前再次離心，去除固定液，加入RNase（終濃度為50 μg/mL），37℃孵育30 min后，加入終濃度為50 μg/mL的PI，4℃避光染色30 min，篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀測定DNA含量的變化，ModFit軟件計(jì)算細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4雙向電泳與質(zhì)譜分析取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心去除無血清培養(yǎng)基，離心后加入含有12.5 μmol/L姜黃素培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照組。培養(yǎng)24 h，裂解細(xì)胞，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，通過固相pH梯度（IPG）等電聚焦和梯度聚丙烯酰胺雙向電泳分離蛋白質(zhì)，分析電泳圖像，挑選差異顯著（2倍以上）的斑點(diǎn)做膠內(nèi)酶切。利用基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）鑒定蛋白，即將標(biāo)記的差異性蛋白斑點(diǎn)從凝膠上取出后進(jìn)行蛋白質(zhì)提純。提純后的蛋白質(zhì)在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀（4800 plus，ABI）進(jìn)行分析，每一種斑點(diǎn)的蛋白質(zhì)均有肽指紋譜，分析軟件根據(jù)肽指紋譜結(jié)合生物信息庫比對，從而得出與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩者間的關(guān)系采用直線回歸相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1姜黃素對HL-60細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素作用24 h后，空白對照組細(xì)胞生長抑制率為0，6.25 μmol/L組、12.5 μmol/L組和25 μmol/L組分別為（6.46±0.73）%、（9.79±1.36）%和（79.48±7.99）%，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且隨著藥物濃度遞增，其對HL-60細(xì)胞的生長抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性（P＜0.05）。

2.2倒置相差顯微鏡觀察HL-60細(xì)胞形態(tài)變化

不同濃度姜黃素作用24 h后，空白對照組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞膜完整，形態(tài)較一致，呈圓形。但隨著姜黃素作用濃度增加，細(xì)胞碎片逐漸增加，形態(tài)不一，出現(xiàn)典型的細(xì)胞出芽和凋亡小體。見圖1。

圖1　　倒置相差顯微鏡下HL-60細(xì)胞形態(tài)的改變（×200）

2.3姜黃素對HL-60細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素作用24 h后，當(dāng)藥物濃度為6.25 μmol/L和25 μmol/L時，與空白對照組比較，G1/G0期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞則顯著增多，G2/M期細(xì)胞無明顯變化；當(dāng)藥物濃度為12.5 μmol/L時，G2/M期細(xì)胞為空白對照組的20倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。見圖2。

圖2　　不同濃度姜黃素作用HL-60細(xì)胞24 h后的細(xì)胞周期流式圖

2.4姜黃素對HL-60細(xì)胞絲切蛋白（cofilin）表達(dá)的影響

挑選雙向電泳圖像差異顯著的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定該蛋白為cofilin蛋白。作用24 h后，12.5 μmol/L姜黃素組的cofilin蛋白表達(dá)較空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3　　雙向電泳圖譜cofilin蛋白的表達(dá)

3　　討論

急性早幼粒細(xì)胞白血病是急性髓系白血病的一種特殊類型，約占其發(fā)病率的10%，常見于成人。急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療方法主要有化療、全反式維甲酸、砷劑及造血干細(xì)胞移植等，其中化療聯(lián)合砷劑或全反式維甲酸是主要的治療方法，但目前臨床上所用的化療藥物毒副作用較大且治療效果不佳。近年來，中藥姜黃素因其廣泛的抗腫瘤作用、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為受關(guān)注的新型抗腫瘤藥物。研究發(fā)現(xiàn)［4，5］，姜黃素對多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均有不同程度地生長抑制、細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用，但作用機(jī)制不盡相同。胡輝等［6］報(bào)道姜黃素通過下調(diào)食管癌EC-109細(xì)胞cyclin D1、cyclin E的表達(dá)，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。有研究［7～10］報(bào)道姜黃素通過以下幾方面發(fā)揮抗白血病作用：⑴通過內(nèi)外源途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡；⑵通過逆轉(zhuǎn)多耐藥增強(qiáng)抗白血病作用；⑶誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬和分化；⑷抑制白血病細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。

本研究以不同濃度姜黃素作用HL-60細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖抑制情況、顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制HL-60細(xì)胞生長，且隨著藥物濃度增加，其抑制細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，同時發(fā)現(xiàn)姜黃素濃度為12.5 μmol/L時，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而阻滯了該細(xì)胞分化，與Tan等［11］報(bào)道結(jié)果基本一致。為了進(jìn)一步研究姜黃素作用下細(xì)胞發(fā)生周期阻滯時細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化，本研究選取12.5 μmol/L姜黃素濃度組和空白對照組細(xì)胞行雙向電泳及質(zhì)譜鑒定分析，最終鑒定為cofilin，由此推測cofilin可能參與調(diào)控姜黃素對HL-60細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用。

cofilin是一種低分子量的肌動蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在于多種組織，參與多種生理活動，通過對肌動蛋白的解聚作用促使肌動蛋白纖維循環(huán)使用，改變細(xì)胞及其胞外基質(zhì)黏附，影響細(xì)胞運(yùn)動及遷移，參與細(xì)胞質(zhì)分裂、細(xì)胞凋亡等過程。研究表明，在形態(tài)變化和轉(zhuǎn)移中均表達(dá)上調(diào)的基因，基本集中于cofilin通路及其下游的感受器，cofilin成為抑制轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)［12］。許多類型的侵襲性腫瘤細(xì)胞中cofilin活性或表達(dá)均發(fā)生改變，如人前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、星型細(xì)胞瘤等均高表達(dá)［13～15］。綜上認(rèn)為，降低cofilin蛋白表達(dá)可能是治療腫瘤的有效方法。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素使細(xì)胞發(fā)生周期阻滯時，cofilin蛋白的表達(dá)含量較空白對照組明顯下降，說明cofilin蛋白可能為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，姜黃素可能通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cofilin的表達(dá)發(fā)揮抑制HL-60細(xì)胞生長增殖的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可在體外抑制急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性，且在一定的血藥濃度時可使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，從而阻滯細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能與姜黃素下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cofilin的表達(dá)有關(guān)。但由于本研究僅檢測12.5 μmol/L姜黃素濃度作用下急性早幼粒白血病細(xì)胞內(nèi)cofilin的表達(dá)情況，而不同濃度作用下cofilin的表達(dá)情況尚未清楚，有關(guān)方面有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 黃小華，孫永，沈能，等.雙親姜黃素衍生物減輕大鼠肝纖維化與抗炎抗氧化作用的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（4）：470-475.

［2］ 劉全未，黃維義.姜黃素誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)與抗動脈粥樣硬化大鼠的脂質(zhì)過氧化的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27（4）：399-401.

［3］ 梅雪婷，許東暉，何雪妮，等.姜黃素固體分散體抗腫瘤的藥理學(xué)研究［J］.中藥材，2012，35（10）：1645-1649.

［4］ 曲佳，陳玲珍，詹昱，等.姜黃素對人多發(fā)性骨髓瘤ARH-77細(xì)胞外源性凋亡通路的影響［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2014，21（1）：25-30.

［5］ 孫永，方泰惠，周靜，等.姜黃素對乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲的影響及其機(jī)制探討［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（14）：66-67.

［6］ 胡輝，荊緒斌，蔡先彬，等.姜黃素對食管癌EC-109細(xì)胞增殖抑制的研究［J］.實(shí)用癌癥雜志，2011，26（3）：230-233.

［7］ Tima S，Ichikawa H，Ampasavate C，et al.Inhibitory effect of turmeric curcuminoids on Flt3 expression and cell cycle arrest in the Flt3-overexpressing Eol-1 leukemic cell line［J］.J Nat Prod，2014，77（4）：948-954.

［8］Wu LX，Wu Y，Chen RJ，et al.Curcumin derivative C817 inhibits proliferation of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia cells with wild-type or mutant Bcr-Abl in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2014，35 （3）：401-409.

［9］Wu JC，Lai CS，Badmaev V，et al.Tetrahydrocurcumin，a major metabolite of curcumin，induced autophagic cell death through coordinative modulation of PI3K/Akt-mTOR and MAPK signaling pathways in human leukemia HL-60 cells［J］.Mol Nutr Food Res，2011，55（11）：1646-1654.

［10］陳唐勇，徐芬，孔蘊(yùn)源，等.姜黃素聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)耐藥的急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（4）：895-898.

［11］Tan TW，Tsai HR，Lu HF，et al.Curcumin-induced cell cycle arrest and apoptosis in human acute promyelocytic leukemia HL-60 cells via MMP changes and caspase-3 activation［J］.Anticancer Res，2006，26（6B）：4361-4371.

［12］Tsai CH，Lin LT，Wang CY，et al.Over-expression of cofilin-1 suppressed growth and invasion of cancer cells is associated with upregulation of let-7 microRNA［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1852 （5）：851-861.

［13］Nagai S，Moreno O，Smith CA，et al.Role of the cofilin activity cycle in astrocytoma migration and invasion［J］.Genes Cancer，2011，2（9）：859-869.

［14］Collazo J，Zhu B，Larkin S，et al.Cofilin drives cell-invasive and metastaticresponsestoTGF-β in prostate cancer［J］.Cancer Res，2014，74（8）：2362-2373.

［15］ Ferraro A，Boni T，Pintzas A.EZH2 regulates cofilin activity and colon cancer cell migration by targeting ITGA2 gene［J］.PLoS One，2014，9（12）：e115276.

［2016-02-29收稿］［2016-03-25修回］［編輯羅惠予］

【中圖分類號】R733.7

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1674-5671（2016）03-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-5671.2016.03.02

Effects of curcumin on acute promyelocytic leukemia cells：proliferation，differentiation and cofilin expression

Wang Shuangling，Liu Feng，Chen Jiangsheng（Department of Hematology and Oncology，the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou 515000，P.R.China）

【Abstract】Objective To investigate the effects of curcumin on the proliferation and differentiation of HL-60 early immature leukemia cells as well as on their expression of silk protein（cofilin）.Methods HL-60 cells were treated for 24 h with curcumin（6.25，12.5，and 25 μmol/L）or not（control）.Then cultures were examined using the MTT assay to detect effects of curcumin on proliferation，inverted microscopy to detect changes in cell morphology，flow cytometry to detect alterations in the cell cycle，and two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry to detect cofilin protein expression.Results The apoptotic rate of HL-60 cells increased with increasing curcumin concentration at 24 h，the rate in each concentration group were as follows：（6.46±0.73）%，6.25 μmol/L；（9.79±1.36）%，12.5 μmol/L；and（79.48±7.99）%，25 μmol/L，（P＜0.05）；they were higher with higher curcumin concentration（P＜0.05）.Inverted microscopy showed morphological changes typical for cell growth arrest.Flow cytometry showed that curcumin at 12.5 μmol/L arrested cells at the G2/M transition of the cell cycle.Twodimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis showed that curcumin down-regulated cofilin expression in HL-60 cells.Conclusion These in vitro studies suggest that curcumin can inhibit the proliferation of HL-60 promyelocytic leukemia cells in a concentration-dependent manner.Sufficiently high concentrations can arrest the cell cycle and block differentiation.At least some of these curcumin effects may occur via down-regulation of intracellular cofilin expression.

【Key words】Leukemia；Curcumin；Acute promyelocytic leukemia cells；Cofilin