任公平 李華洋 王書惠 佟雷

摘要：目的 觀察辣椒素對人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞線粒體膜電位（Δψm）的影響，探討其誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)NCI-H460細(xì)胞，采用不同終濃度辣椒素進(jìn)行處理，以不加辣椒素為對照。MTT法檢測NCI-H460細(xì)胞增殖反應(yīng)，計(jì)算半數(shù)抑制率；分別采用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI法、JC-1活細(xì)胞染色、免疫熒光和Western blot檢測細(xì)胞凋亡、ψm、細(xì)胞色素C（Cyt c）的分布和線粒體內(nèi)Cyt c的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，辣椒素明顯抑制NCI-H460細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡（P<0.05，P<0.01）；辣椒素顯著降低NCI-H460細(xì)胞Δψm、促進(jìn)Cyt c由線粒體釋放至胞漿及降低線粒體內(nèi)Cyt c的表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論 辣椒素對肺癌NCI-H460細(xì)胞增殖具有抑制作用，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：辣椒素；非小細(xì)胞肺癌；凋亡；線粒體膜電位；細(xì)胞色素C

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.018

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0069-05

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤，也是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。辣椒素是香草酰胺類生物堿，又名辣椒堿，是辣椒屬植物紅辣椒的活性成分。有研究表明，辣椒素可抑制肝纖維化和誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[1-2]，辣椒素可通過多種途徑在體外發(fā)揮抗癌作用，如誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和

胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡[3-4]，抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H69和H82增殖[5]。本研究前期實(shí)驗(yàn)表明，辣椒素可降低人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞侵襲能力，同時(shí)應(yīng)用Hoechst33342核染色分析也證實(shí)，辣椒素可誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡[6]。為進(jìn)一步探討辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察辣椒素對NCI-H460細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，Δψm）的影響，探討其誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物及配制

辣椒素（純度>99%，美國Sigma公司），溶解于二甲基亞砜（DMSO），配制成儲備液，-20 ℃冰箱保存，臨用時(shí)以完全培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基，美國HyClone；MTT、DMSO、牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma；AnnexinV-FITC/PI試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；JC-1檢測試劑盒、抗細(xì)胞色素C（Cyt c）小鼠單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑，美國Santa Cruz；線粒體抽提試劑盒，德國美天旎生物技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡（BX51T-32P01-FLB3），日本OLYMPUS；CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC），日本SANYO；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur），美國BD；酶標(biāo)儀（GENios Pro），瑞士TECAN；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2800），美國UNICO；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDox XRS），美國Bio-RAD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H460細(xì)胞保存在含有10%BSA RPMI-1640營養(yǎng)培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)NCI-H460細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。按照1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于超低吸附6孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細(xì)胞，經(jīng)EDTA處理制備成單細(xì)胞懸液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，備用。

2.2 MTT法檢測NCI-H460細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，按照1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)過夜。次日，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每孔加入0（對照組）、100、200、300、400、500、600 ?mol/L不同終濃度的辣椒素，每組設(shè)6個(gè)平行孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 ?L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO 150 ?L，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀波長570 nm處，以空白培養(yǎng)液調(diào)零點(diǎn)，測定OD值，取6孔平均值，計(jì)算抑制率[（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）÷對照組OD值×100%]。計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞100、200、300 ?mol/L辣椒素處理，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。1200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，1 mL PBS沖洗2次，然后加1倍上樣緩沖液490 μL混勻。最后加入50 μg/mL Annexin V-FITC和PI液各5 μL，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)60 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測NCI-H460細(xì)胞凋亡。每組設(shè)6個(gè)平行孔。

2.4 線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞100、200、300 ?mol/L辣椒素處理，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。1200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，1 mL PBS沖洗2次，加入2 μL JC-1液，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)130 min。以LSM510 META激光共聚焦顯微鏡按照J(rèn)C-1Δψm檢測試劑盒說明書步驟測量熒光信號。按照J(rèn)C-1不同形式所發(fā)射的熒光不同，以紅色/綠色熒光比值（FL2/FL1）表示Δψm的變化。Image J軟件計(jì)算FL2/FL1。每組測量6次。

2.5 免疫熒光檢測

取對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞100、200、300 ?mol/L辣椒素處理，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。待細(xì)胞爬滿爬片，取出，PBS沖洗2次，3.7%低聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2次，5%BSA室溫封閉15 min，0.2%TritonX-100處理15 min，然后與抗Cyt c小鼠單克隆抗體（1∶50稀釋）一起于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)1 h。PBS沖洗2次，加入FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（1∶400稀釋），37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)30 min，DAPI處理10 min，LSM510 META激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。每組設(shè)6個(gè)平行孔。

2.6 Western blot檢測

取對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100、200、300 ?mol/L辣椒素，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。將NCI-H460細(xì)胞線粒體與胞漿分離，提取線粒體。線粒體提取過程嚴(yán)格按照線粒體抽提試劑盒說明操作。Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。取20 ?g蛋白質(zhì)加入2×上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。隨后進(jìn)行7.5%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 ?m硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉PBST（25 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween20）封閉1 h，加入抗Cyt c小鼠單克隆抗體（1∶100稀釋）4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次×5 min。加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（1∶800稀釋）室溫孵育2 h，PBST洗滌3次×5 min。按相同方法與GAPDH抗體孵育。ECL試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測線粒體內(nèi)Cyt c的表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)計(jì)量資料數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 辣椒素對NCI-H460細(xì)胞增殖的影響

不同濃度（100、200、300、400、500、600 ?mol/L）辣椒素分別作用于NCI-H460細(xì)胞24 h和48 h，隨終濃度的增大和作用時(shí)間的延長，其對細(xì)胞的抑制率也明顯增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間依賴性，600 ?mol/L辣椒素組細(xì)胞抑制率略有下降；200、300、400、500、600 ?mol/L辣椒素組24、48 h OD值與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。辣椒素作用NCI-H460細(xì)胞24、48 h的IC50分別為366.2、328.9 ?mol/L。結(jié)果見表1。

4.2 辣椒素對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響

辣椒素終濃度為200、300 μmol/L時(shí)，與對照組比較，NCI-H460細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 μmol/L時(shí)，與對照組比較，NCI-H460細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

4.3 辣椒素對NCI-H460細(xì)胞線粒體膜電位的影響

辣椒素終濃度為200、300 μmol/L時(shí)，出現(xiàn)明顯紅綠熒光變化。與對照組比較，F(xiàn)L2/FL1顯著減小，Δψm降低（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 μmol/L時(shí)，與對照組比較，F(xiàn)L2/FL1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

4.4 辣椒素對NCI-H460細(xì)胞色素C分布的影響

對照組NCI-H460細(xì)胞胞漿內(nèi)僅見微弱的熒光信號；辣椒素終濃度為200、300 μmol/L時(shí)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的熒光信號。與對照組比較，Cyt c分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 μmol/L時(shí)，與對照組比較，Cyt c分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖3。

4.5 辣椒素對NCI-H460細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響

辣椒素終濃度為200、300 μmol/L時(shí)，與對照組比較，線粒體內(nèi)Cyt c蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 μmol/L時(shí)，與對照組比較，Cytc蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖4、圖5。

3.辣椒素200 ?mol/L組；4.辣椒素300 ?mol/L組

5 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒素對NCI-H460細(xì)胞增殖有一定抑制作用，提示辣椒素可作為抗非小細(xì)胞肺癌的潛在藥物。同時(shí)本研究流式細(xì)胞術(shù)再次證實(shí)，辣椒素可誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路和基因調(diào)控的一種生理性死亡過程，對保持自身平衡十分重要，腫瘤的生長速率很難控制，這與凋亡能力的減弱和增殖能力的提升密切相關(guān)[7]。多種抗腫瘤藥物如青蒿琥酯、高三尖杉酯堿等均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。目前發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡途徑主要有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，其中線粒體途徑和死亡受體途徑為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑[10]。線粒體是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，在凋亡過程中有重要的調(diào)控作用，其Δψm是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標(biāo)之一[11]。

Cyt c是一種水溶性小分子物質(zhì)，位于線粒體中，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是最早被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白[12]。Δψm的破壞被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一[13]。當(dāng)Δψm降低后，線粒體膜腫脹、通透性增高，Cyt c從內(nèi)膜脫落出來并釋放到胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子及Caspase-9前體相互作用，形成復(fù)合物，激活下游的效應(yīng)Caspase，從而誘導(dǎo)凋亡[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的過程中，也檢測到Δψm的平行下降，表明辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡可能與Δψm有關(guān)。以上結(jié)果初步提示，辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

為了進(jìn)一步證實(shí)在辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡過程中是否有Cyt c由線粒體釋放至胞漿，本研究采用免疫熒光和Western blot分析相結(jié)合的方法檢測Cyt c的分布和表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCI-H460細(xì)胞胞漿Cyt c熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，線粒體內(nèi)Cyt c表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果提示，在辣椒素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡過程中確實(shí)存在Cyt c由線粒體釋放至胞漿，參與誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，辣椒素具有明顯抑制NCI-H460細(xì)胞增殖的作用，誘導(dǎo)其凋亡，其誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡機(jī)制可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。至于Caspase-9是否參與此過程，本研究將做進(jìn)一步探討。

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