徐芳 黃娜 陳燕 李晨陽 趙軍 譚為

摘要：目的 建立黑種草子總皂苷滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 以黑種草皂苷A為對照品，采用薄層色譜法對滴丸中的黑種草子進行定性鑒別，采用比色法對滴丸中總皂苷的含量進行測定，采用高效液相色譜法對滴丸中黑種草皂苷A的含量進行測定。結(jié)果 薄層鑒別圖譜斑點清晰，陰性對照無干擾；總皂苷含量測定中平均回收率為102.6%，RSD=1.96%（n=6），滴丸中總皂苷平均含量為18.13%；黑種草皂苷A含量測定中平均回收率為103.2%，RSD=1.16%（n=6），滴丸中黑種草皂苷A平均含量為14.71%。結(jié)論 本研究制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)確可靠、簡便易行，可用于黑種草子總皂苷滴丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：腺毛黑種草子；總皂苷；滴丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.026

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0101-04

黑種草子為毛茛科黑種草屬植物腺毛黑種草Nigella glandulifera Freyn et Sint.的干燥成熟種子[1]。黑種草子作為維吾爾族習(xí)用藥材，主產(chǎn)于我國新疆和云南[2-4]。在維吾爾醫(yī)中，黑種草子被稱為“斯亞旦”，藥性三級干熱，味辛，具有生干生熱、烏發(fā)生發(fā)、增強色素、強筋健肌、祛寒止痛等功效，主治濕寒性或黏液質(zhì)性疾病[2-3，5]。本課題組前期研究結(jié)果表明，黑種草子總皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛和治療關(guān)節(jié)炎的作用，而且安全性好[6-8]，故將其制成滴丸劑，以滿足快速起效和穩(wěn)定性的要求。本研究采用薄層色譜法對黑種草子總皂苷滴丸中的黑種草子進行定性鑒別，采用比色法對滴丸中總皂苷的含量進行測定，采用高效液相色譜法（HPLC）對滴丸中黑種草皂苷A的含量進行

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目（201130105-4）

測定，建立黑種草子總皂苷滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，并為黑種草子的進一步深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可見檢測器（日本島津公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；UV-754型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；WHF-203B暗箱式三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；ZBS-6G智能崩解試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；8002型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

黑種草子總皂苷滴丸（批號20141215、20141216、20141217），新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植物化學(xué)研究室制備；黑種草皂苷A對照品（常春藤皂苷元3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→3）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）- β-D-吡喃葡萄糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，含量>95%），新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植物化學(xué)研究室制備；聚乙二醇4000（PEG4000），天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇6000（PEG6000），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品為棕褐色的滴丸，味微苦。

2.2 薄層鑒別

取黑種草子總皂苷滴丸15丸，加甲醇10 mL，超聲使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取黑種草皂苷A對照品，加甲醇制成每1 mL含3 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述2種溶液各5 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點，并且陰性對照無干擾。

2.3 檢查

按照《中華人民共和國藥典》滴丸劑項下要求進行重量差異、溶散時限的檢查。結(jié)果黑種草子總皂苷滴丸平均每粒丸重為35 mg，3批重量差異變異系數(shù)分別為4.55%、4.78%、3.62%，均小于12%，符合藥典規(guī)定。3批黑種草子總皂苷滴丸溶散時間分別為5、5、4 min，均符合藥典規(guī)定（<30 min）。

2.4 總皂苷含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取干燥的黑種草皂苷A對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3 mg的黑種草皂苷A對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取黑種草子總皂苷滴丸4丸，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 陰性對照溶液的制備 按處方稱取基質(zhì)，不加黑種草子總皂苷提取物，按滴丸制備工藝制成陰性制劑，按“2.4.2”項下方法制備，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取黑種草皂苷A對照品溶液0.1、0.16、0.22、0.28、0.34 mL，分別置于具塞試管中，用氮氣吹干溶劑，精密加入8%香草醛-無水乙醇溶液0.2 mL，1 min后再加入77%硫酸溶液10 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中恒溫加熱20 min，取出后立即置冰水浴中冷卻5 min，同法做空白，于529 nm波長處測定吸光度，以對照品含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.114 3X-0.107 5（r=0.998 4），表明黑種草皂苷A在0.3～1.02 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 空白干擾試驗 為明確滴丸中基質(zhì)對總皂苷含量測定是否有影響，取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液及總皂苷提取物樣品溶液，按“2.4.4”項下方法操作，于400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明供試品溶液、對照品溶液和總皂苷提取物樣品溶液在529 nm波長處有最大吸收，而陰性對照溶液在400～800 nm波長范圍內(nèi)基本無吸光度，因此可以確定基質(zhì)對滴丸中總皂苷的含量測定沒有影響。

2.4.6 精密度試驗 精密量取同一份供試品溶液0.2 mL 6份，按“2.4.4”項下方法操作，于529 nm處測定吸光度，結(jié)果吸光度的RSD=1.16%，表明本法精密度較好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液0.2 mL，按“2.4.4”項下方法操作，分別于0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min時在529 nm處測定吸光度，結(jié)果總皂苷平均含量為18.10%，RSD=1.07%，表明供試品溶液顯色后在1 h內(nèi)測定均可。

2.4.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品6份，分別制成供試品溶液，分別精密量取各供試品溶液0.2 mL，按“2.4.4”項下方法操作，于529 nm處測定吸光度，結(jié)果總皂苷平均含量為18.08%，RSD=1.21%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知總皂苷含量的樣品6份，再分別精密加入黑種草皂苷A對照品溶液適量，按“2.4.4”項下方法操作，于529 nm處測定吸光度，結(jié)果平均回收率為102.6%，RSD=1.96%（n=6），見表1。

2.5 黑種草皂苷A含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent-Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm；理論塔板數(shù)按黑種草皂苷A峰計算應(yīng)不低于3000。

2.5.2 對照品溶液的制備 取干燥的黑種草皂苷A對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含2 mg的黑種草皂苷A對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取黑種草子總皂苷滴丸2丸，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 陰性對照溶液的制備 按處方稱取基質(zhì)，不加黑種草子總皂苷提取物，按滴丸制備工藝制成陰性制劑，按“2.5.3”項下方法制備，即得。

2.5.5 空白干擾試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液以及總皂苷提取物樣品溶液各20 ?L，在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果黑種草皂苷A與其他成分達到基線分離，陰性對照溶液在與黑種草皂苷A相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，因此確定基質(zhì)對滴丸中黑種草皂苷A的含量測定沒有影響。

2.5.6 線性關(guān)系考察 將對照品溶液分別配制成0.02、0.08、0.2、0.4、0.8、1.6、2 mg/mL的系列對照品溶液，精密吸取各對照品溶液20 ?L，在上述色譜條件下分別進樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程Y=2876416.24X+29 573.88（r=0.999 9），結(jié)果表明黑種草皂苷A在0.4～40 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.7 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，結(jié)果黑種草皂苷A峰面積的RSD=0.10%，表明本法精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫放置，分別于1、5、8、24、32 h時進樣測定，結(jié)果黑種草皂苷A平均含量為14.75%，RSD=0.39%，說明供試品溶液在32 h內(nèi)測定均可。

2.5.9 日間精密度試驗 在不同日期精密稱取同一批樣品制成供試品溶液，進樣測定，結(jié)果黑種草皂苷A平均含量為14.70%，RSD=0.73%，表明本法日間精密度較好。

2.5.10 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，分別制成供試品溶液進樣測定，結(jié)果黑種草皂苷A平均含量為14.52%，RSD=1.13%，表明本法重復(fù)性良好。

2.5.11 加樣回收率試驗 精密稱取已知黑種草皂苷A含量的樣品6份，分別加入黑種草皂苷A對照品溶液適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液并進行測定，結(jié)果平均回收率為103.2%，RSD=1.16%，見表3。

2.5.12 樣品中黑種草皂苷A含量測定 取3批樣品，分別按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液并進行測定，結(jié)果見表4。

3 討論

在薄層色譜鑒別中，通過對氯仿-甲醇-水（6∶4∶0.5）、環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮（5∶5∶2）、正丁醇-水-乙酸（4∶1∶5）、正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）等不同展開系統(tǒng)進行篩選，結(jié)果顯示，正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）為展開劑時斑點清晰，Rf值合適，并且陰性無干擾，故采用正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）作為展開劑。另外，供試品溶液靜置后發(fā)現(xiàn)有沉淀，因此進行離心處理，取上清液作為供試品溶液，效果較好。

在總皂苷含量測定過程中，加入的香草醛-無水乙醇溶液需新鮮配制，否則影響吸光度測定。由于濃硫酸過于黏稠，加入后需將具塞試管密閉，震蕩搖勻是關(guān)鍵。加熱后需立即冰浴，終止反應(yīng)，因此整個操作過程需要快速。

在黑種草皂苷A含量測定中，根據(jù)滴丸的溶解性，供試品溶液的制備分別考察了水和甲醇作為溶劑時的峰面積，結(jié)果表明兩者峰面積很接近，考慮到樣品的穩(wěn)定性，故選擇甲醇作為溶劑。同時，本試驗還比較了直接溶解和超聲處理對供試品溶液制備的影響，結(jié)果均得到澄清的溶液，經(jīng)測定峰面積也很接近，由于直接溶解方法更為簡單，因此采用直接溶解的方法制備供試品溶液。另外，試驗中還考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸作為流動相對樣品分離效果的影響，結(jié)果表明，乙腈-水（28∶72）為流動相時，樣品中黑種草皂苷A色譜峰峰型、分離度良好。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：324-325.

[2] 劉勇民.維吾爾藥志[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：515- 518.

[3] 肖克來提·吐達洪，木哈巴提.維吾爾藥黑種草的國內(nèi)外應(yīng)用簡介[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2002，8（3）：28.

[4] 李正洪，彭霞，姜明輝，等.傣藥黑種草籽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009，18（7）：166-167.

[5] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：維吾爾藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：364-366.

[6] ZHAO J， XU F， HUANG H， et al. Evaluation on anti-inflammatory， analgesic， antitumor， and antioxidant potential of total saponins from Nigella glandulifera seeds[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，2013：827230.

[7] 王林林，史玉柱，劉燕，等.瘤果黑種草子總皂苷治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用研究[J].中藥藥理與臨床，2014，30（3）：78-82.

[8] 劉燕，史玉柱，楊巧麗，等.瘤果黑種草子總皂苷的長期毒性研究[J].中藥藥理與臨床，2013，29（6）：68-70.