林　勇，徐　茜，陳志厚，孔凡玉，白萬明*

（1.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

烤煙青枯病田間發(fā)生動態(tài)及其與氣象因素的相關(guān)性

林勇1,2，徐茜1，陳志厚1，孔凡玉2，白萬明1*

（1.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

2013—2014年對南平建陽煙田土壤青枯病菌數(shù)量和發(fā)病情況進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，分析了病害與主要氣象因子的相關(guān)性。結(jié)果表明，SMSA半選擇性培養(yǎng)分離法和熒光定量PCR法均能有效檢測土壤中青枯病菌，前者檢測的青枯病菌數(shù)量與病情指數(shù)相關(guān)性（R2=0.8191）高于后者（R2=0.7464）?？諝鉁囟?、濕度、降水和日照時數(shù)等氣象因子中，溫度是影響南平煙田青枯病菌數(shù)量和發(fā)病程度的關(guān)鍵氣象因子。5月下旬至6月初，周平均溫度高于22℃時，病害進(jìn)入始發(fā)期，此時根際土壤中病菌數(shù)量高于5.0×105cfu/mL。6月上旬至中旬，周平均溫度在22～25℃，病害處于平穩(wěn)發(fā)展期，青枯病菌數(shù)量在1.0×105～2.2×106cfu/g。6月中下旬，周平均氣溫高于25℃，病害進(jìn)入爆發(fā)期，青枯病菌數(shù)量在2.2×106cfu/g以上。溫度對于指導(dǎo)青枯病的預(yù)測預(yù)報和防治具有重要價值。

煙草；青枯??；氣象因子；相關(guān)性；南平

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起[1]的一種毀滅性病害，在南平煙區(qū)煙葉成熟期為害嚴(yán)重，具有發(fā)病急、傳播快、難控制等特點。煙草青枯病菌寄主范圍廣[2]，具有豐富的生物多樣性[3-5]，能夠以腐生或寄生的方式在土壤中存活多年。當(dāng)條件適宜時病原物通過根部傷口或次生根萌發(fā)點侵染植株[6-7]。正是由于該病菌的上述特點，煙草青枯病得以大面積流行。為了有效控制該病害，摸清南平煙區(qū)青枯病田間發(fā)生和流行規(guī)律，本研究通過定點系統(tǒng)調(diào)查，研究了南平煙區(qū)青枯病菌和病害消長動態(tài)及其與氣象因子的相關(guān)性，以期為南平煙區(qū)青枯病的防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病害系統(tǒng)調(diào)查

2013—2014年系統(tǒng)調(diào)查地點設(shè)在福建省南平市建陽莒口煙田，調(diào)查田塊常年發(fā)病。試驗地土壤類型為紅壤，土壤肥力中等，前茬作物均為水稻，調(diào)查品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩NK326，調(diào)査地塊煙草的整個生育期未噴施化學(xué)藥劑。移栽后至采烤基本結(jié)束每周調(diào)查一次病情指數(shù)，記錄田間首次發(fā)現(xiàn)病株時間。病害調(diào)查時，將調(diào)查田塊分成3個小區(qū)，每個小區(qū)采用五點取樣法定時定株調(diào)查，每個調(diào)查點調(diào)查10株，病情指數(shù)計算參照文獻(xiàn)[8]的方法。調(diào)查田塊2013年和2014年煙草移栽時間分別為3月8日和3月14日，為便于分析，對兩年度3月20日至6月22日調(diào)查和取樣數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2土壤樣品采集方法

煙草根際土的采集參照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。移栽后1周開始取樣，每個小區(qū)利用五點取樣法取5株煙根際混合土樣100 g。取樣后-20℃保存，盡快帶回實驗室處理。

1.3青枯病菌分離

采用SMSA半選擇性培養(yǎng)基[10]分離根際土壤中的茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）。土壤樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，涂布SMSA平板計數(shù)，28℃培養(yǎng)2 d后，統(tǒng)計具有青枯菌特點的菌落（流動，平滑，帶有乳白色暈圈的粉紅色菌落，底部呈馬蹄形）。

1.4青枯病菌RT-PCR檢測

按照操作說明，用試劑盒（Ultra Clean DNA Isolation kit，MOBIO）提取和純化土壤DNA。參照陳巧玲方法[11]進(jìn)行青枯病菌RT-PCR檢測。將純化的土壤樣品DNA為模板，擴增反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5mmol/l)2 μL、引物（10 mmol/L）1 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL，rTaq DNA 酶0.3 μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至25μL。根據(jù)已報道的青枯菌fliC基因設(shè)計并合成引物f：-GAACGCCAACGGTGCGAACT，r：5?-GTGGGG TTCGCCTGATTTT-3?。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共30次循環(huán)；72℃ 10 min。獲得擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，計算樣品初始基因拷貝數(shù)，換算每克樣品的基因拷貝數(shù)。

1.5氣象資料獲取

溫度、降雨、日照時數(shù)和相對濕度等氣象資料均采用建陽市氣象站數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1煙草根際青枯病菌群消長動態(tài)

如圖1所示，SMSA半選擇培養(yǎng)基法和RT-PCR法均能有效檢出煙草根際土壤中青枯菌。RT-PCR法檢測限低，在土壤中青枯菌含量1000 cfu/g時即可檢出，因此檢出時間較SMSA培養(yǎng)法早7～14 d。SMSA半選擇性培養(yǎng)分離法檢測青枯病菌數(shù)量與病情指數(shù)相關(guān)性（R2=0.8191）高于熒光定量PCR法(R2=0.7464)。兩種方法均具有較好的相關(guān)性（2013年和2014年R2值分別為0.9958和0.9742），說明檢測結(jié)果較為可靠。在莒口煙田煙草根際土壤青枯病菌的生物量測定中，SMSA平板檢測和RT-PCR檢測青枯病原菌數(shù)量發(fā)生趨勢基本一致。移栽后1個月（4月上旬），青枯菌開始少量檢出。雖然2013年移栽較2014年早7 d，但2014年青枯菌的初次檢出時間比2013年早7～14 d。4月中旬至5月中旬為病原菌積累期，青枯菌數(shù)量緩慢增長。5月下旬至6月下旬屬于病原菌爆發(fā)期，煙草根際土壤青枯菌數(shù)量急劇增加。

圖1　煙草根際土壤青枯菌群密度Fig.1　Population density of R.solanacearum in tobacco rhizospheric soil

2.2煙草青枯病田間消長動態(tài)

從連續(xù)2年的調(diào)查結(jié)果來看（圖2），南平煙草青枯病發(fā)生發(fā)展具有發(fā)病急、流行快的特點。2013年和2014年田間病株初次發(fā)現(xiàn)時間分別為6月3日和5月28日，說明5月底至6月初為病害的始發(fā)期。6月上旬至中旬為病害快速發(fā)展期，病情指數(shù)在10以下。6月中旬至下旬為病害爆發(fā)流行期，病情指數(shù)快速上升至30以上，田間危害嚴(yán)重。從年度間發(fā)病情況來看，青枯病2014年較2013年發(fā)病早、危害重。

圖2　煙草青枯病病情指數(shù)動態(tài)變化Fig.2　Disease index of tobacco infected by R.solanacearum

2.3青枯病發(fā)生與青枯菌數(shù)量的關(guān)系

煙草青枯病發(fā)生與根際土壤青枯菌數(shù)量呈正相關(guān)。利用SMSA培養(yǎng)基和RT-PCR檢測方法，青枯菌數(shù)量與病情指數(shù)的R2值分別為0.8191（圖3）和0.7464（圖4）。煙草青枯病田間初次發(fā)病時，煙株根際土壤病菌檢出數(shù)量2013年為2.5～5.0×105cfu/mL，2014年為2.7～5.2×105cfu/mL。

2.4青枯菌數(shù)量與氣象因素的關(guān)系

圖3　SMSA培養(yǎng)基檢測青枯菌數(shù)量與病指相關(guān)性Fig.3　Correlation between population of R.solanacearum detected by SMSA and disease index

圖4　RT-PCR檢測青枯菌數(shù)量與病指相關(guān)性Fig.4　Correlation between population of R.solanacearum detected by RT-PCR and disease index

表1　南平建陽市2013和2014年主要氣象因子數(shù)據(jù)Table 1　Meteorological data in Jianyang of Nanping between 2013 and 2014

煙草青枯病試驗取樣與調(diào)查期間建陽市氣象數(shù)據(jù)如表1所示。以SMSA培養(yǎng)基檢測青枯病菌數(shù)量為因變量（Y），周平均日照時數(shù)（X1）、周平均氣溫（X2）、周平均相對濕度（X3）和周平均降水量（X4）為自變量，通過逐步回歸分析方法建立方程Y=-753.748699+0.27723384829X1+25.024981268X2+3.555471505X3-0.14285654450X4， 相 關(guān) 系 數(shù)r=0.7840。如表2所示，煙草根際青枯病菌數(shù)量與周平均日照時數(shù)、周平均氣溫、周平均相對濕度和周平均降水量呈正相關(guān)。偏相關(guān)分析結(jié)果表明，周平均溫度偏相關(guān)系數(shù)最大（0.7465），說明溫度可能是青枯病菌數(shù)量的關(guān)鍵影響因子。通徑分析的決定系數(shù)R2=0.6143，剩余通徑系數(shù)為0.6208，說明上述4個氣象因子對煙草青枯病菌數(shù)量影響的比重達(dá)62.08%。

2.5青枯病病情指數(shù)與氣象因素的關(guān)系

以煙草青枯病病情指數(shù)為因變量（Y），周平均日照時數(shù)（X1）、周平均氣溫（X2）、周平均相對濕度（X3）和周平均降水量（X4）為自變量，通過逐步回歸分 析 方法建立方程 Y=-331.134402-0.3915367684X1+10.935617168X2+0.9093703211X3+ 0.05259075419X4，相關(guān)系數(shù)r=0.906481。煙草根際青枯病菌數(shù)量與周平均氣溫和周平均降水量呈正相關(guān)。周平均溫度偏相關(guān)系數(shù)最大（0.7465），其次為周平均降水量（0.5234），說明溫度和降水是病害發(fā)生的關(guān)鍵影響因子。通徑分析的決定系數(shù)R2=0.8217，剩余通徑系數(shù)為0.4223，說明上述4個氣象因子對煙草青枯病菌數(shù)量影響的比重達(dá)82.17%。

表2　青枯病菌與主要氣象因素相關(guān)性分析Table 2　Correlation between R.solanacearum and meteorological factors

表3　影響煙草青枯病菌數(shù)量和病情指數(shù)的主要氣象因子通徑分析Table 3　Path analysis of climatic factors on pathogen population and disease index

3　討論

青枯菌為土壤習(xí)居菌，在植物發(fā)病以前已經(jīng)在土壤中開始大量積累。平板劃線分離法是目前檢測土壤中青枯菌數(shù)量最常用的方法，培養(yǎng)基主要為紅四氮唑非選擇培養(yǎng)基（TZC）[12]和改良SMSA半選擇培養(yǎng)基[13]。近年來快速發(fā)展的熒光定量PCR技術(shù)開始廣泛用于植物青枯菌檢測[14-16]。本研究分別采用改良SMSA半選擇培養(yǎng)基分離法和熒光定量PCR法對南平煙區(qū)煙草根際青枯病菌進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果表明，這兩種方法均能有效檢測土壤中的青枯病菌，其中熒光光定量PCR法檢測限更低。2013—2014年連續(xù)2年的監(jiān)測結(jié)果表明，煙草移栽后7～10 d即可在煙草根際檢測到青枯病菌，并在整個生長季節(jié)不斷積累。

綜合2年調(diào)查結(jié)果來看，5月底至6月初為南平煙區(qū)煙草青枯病的始發(fā)期，6月上旬至中旬為病害發(fā)展期，6月中下旬為病害爆發(fā)流行期。與前人研究結(jié)果基本一致[17]，煙草根際土壤青枯病菌數(shù)量與病情指數(shù)呈正相關(guān)，SMSA半選擇培養(yǎng)基分離法則在病原菌數(shù)量與病情指數(shù)相關(guān)性方面略高于熒光定量PCR法。在田間首次發(fā)現(xiàn)病株時，利用SMSA半選擇培養(yǎng)基分離法檢測到煙草根際土壤青枯菌含量為5.0×105至5.2×105cfu/mL，而在病害爆發(fā)期，煙草根際土壤青枯菌數(shù)量則高達(dá)2.2×106cfu/mL以上。

氣象條件是影響煙草青枯病發(fā)生流行的重要因素，其中溫度被認(rèn)為是影響青枯病發(fā)生和流行的關(guān)鍵氣象因子。鄭向華等[18]研究表明，煙草青枯病菌最適宜生長的溫度范圍為28～34℃。徐世典[19]發(fā)現(xiàn)青枯病在低于20℃的土壤溫度條件下不能發(fā)生。陳順輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土溫穩(wěn)定在20℃持續(xù)5～10 d，煙草感病品種就開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀。與上述研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，周日照時數(shù)、周平均氣溫、周相對濕度和周降水量等4個氣象因子中，溫度是影響煙草青枯病菌數(shù)量和田間發(fā)病程度的關(guān)鍵因子。進(jìn)入5月下旬，周平均氣溫高于22℃時，田間開始出現(xiàn)發(fā)病植株。6月上旬至中旬，周平均氣溫穩(wěn)定在22～25℃，病害處于平穩(wěn)發(fā)展期。6月中下旬，周平均氣溫高于25℃，此時伴隨著降雨，病害進(jìn)入爆發(fā)流行期。

綜上所述，南平煙草青枯病具有發(fā)病急、流行快等特點，尤其是在采烤期，病害正處于流行階段，常會造成大面積災(zāi)害。溫度是煙草青枯病菌繁殖及病害發(fā)生的關(guān)鍵影響因子，對于指導(dǎo)青枯病的預(yù)測預(yù)報和防治具有重要的實際意義。生產(chǎn)上建議煙苗要早移栽，盡量使煙草采收期避開發(fā)病高峰，最大限度減輕病害損失。此外，監(jiān)測土壤病原菌數(shù)量動態(tài)變化也對病害的預(yù)測預(yù)報及防治具有一定的指導(dǎo)作用。

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The Epidemic Dynamics of Tobacco Bacterial Wilt and Analysis of Related Climate Factors

LIN Yong1,2,XU Qian1,CHEN Zhihou1,KONG Fanyu2,BAI Wanming1*
(1.Nanping Branch of Fujian Tobacco Company,Nanping,Fujian 353000,China;2.Pest Integrated Management Key Laboratory of China Tobacco,Tobacco Research Institute of ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao 266101,China)

The population of Ralstonia solanacearum and disease index of tobacco bacterial wilt in Nanping were investigated with systematic survey method.The correlations between tobacco bacterial wilt and climate factors were also analyzed.The results showed that semi selective cultures and fluorescent quantitative PCR were both effective in detecting R.solanacearum in soil. However the correlation between the pathogen population and disease index by the method of semi selective cultures(R2=0.8191) was higher than that by fluorescent quantitative PCR(R2=0.7464).The temperature was the key factor among precipitation, temperature sunlight and humidity which contribute to pathogen population and disease index.In late May to early June when the 7 d average of temperature was higher than 22℃,tobacco bacterial wilt entered initial stage with the amount of pathogen population higher than 5.0×105cfu/mL.Then disease entered a stable period of development from the first ten days to the second ten days of June,At this stage,the average temperature of 7 d ranged from 22 to 25℃,the pathogen population varied between 1.0×105and 2.2×106cfu/g.The epidemic outbreak of tobacco bacterial wilt was in the middle and the last ten-day period of June when the average of temperature was higher than 25℃.At this stage,the pathogen population was higher than 2.2×106cfu/g.Therefore,the temperature is important in forecasting and prevention of tobacco bacterial wilt in Nanping.

tobacco;bacterial wilt;climate factor;correlation;Nanping

S435.72

1007-5119（2016）03-0057-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.010

中國煙草總公司重點項目（110200902065）；福建省煙草公司南平市公司科技計劃項目（NY201203）

林勇（1984-），男，碩士，助理農(nóng)藝師，主要從事煙葉生產(chǎn)技術(shù)研究。E-mail：linyongnp@126.com。*通信作者，E-mail：baiwmnp@163.com

2016-01-27

2016-05-06