惠　宇，周　峰，雷洪恩，楊璧鋮，辛鐘成，侯建全

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇蘇州　215006；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院男科中心，北京　100034)

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·基礎(chǔ)研究·

褪黑素對糖尿病性勃起功能障礙大鼠的神經(jīng)保護作用及可能的機制研究

惠宇1，周峰1，雷洪恩2，楊璧鋮2，辛鐘成2，侯建全1

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇蘇州215006；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院男科中心，北京100034)

摘要：目的探討褪黑素(melatonin，MT)對糖尿病性勃起功能障礙大鼠的神經(jīng)保護作用及可能機制。方法28只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，8周后，糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠隨機分為DM組和MT組，分別每天腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)和MT。另外12只正常大鼠為N組，每天腹腔注射PBS。治療4周后，檢測各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓、平均動脈壓、陰莖背神經(jīng)(dorsal penile nerve，DPN)和盆神經(jīng)節(jié)(major pelvic ganglion，MPG)病變情況。對陰莖海綿體纖維化情況、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、p38和p-p38水平也進行了測定。結(jié)果DM組糖尿病大鼠勃起功能明顯下降，DPN和MPG發(fā)生了明顯的神經(jīng)退行性病變，同時陰莖海綿體內(nèi)膠原蛋白沉積增多，氧化應(yīng)激和p-p38蛋白水平升高。褪黑素治療顯著提高了糖尿病大鼠的勃起功能，改善DPN和MPG神經(jīng)病變，減少膠原纖維沉積并且降低了氧化應(yīng)激與p-p38蛋白水平。結(jié)論MT治療可以有效提高糖尿病大鼠的勃起功能，改善陰莖背神經(jīng)、盆神經(jīng)節(jié)病變，減輕陰莖纖維化情況。其機制可能是通過降低糖尿病大鼠陰莖內(nèi)氧化應(yīng)激水平以及抑制p38MAPK信號通路。

關(guān)鍵詞:勃起功能障礙；糖尿??；褪黑素；神經(jīng)保護作用；抗氧化；p-p38

勃起功能障礙(erectiledysfunction，ED)和糖尿病(diabetesmellitus，DM)都是棘手的健康問題，DM是ED的危險因素，約50%的男性DM患者會發(fā)生ED[1]。糖尿病性勃起功能障礙(diabetesmellitusinducederectiledysfunction，DMED)的機制復(fù)雜，涉及到內(nèi)皮損傷、神經(jīng)病變、微血管及纖維肌肉的改變等。DM容易發(fā)生微血管病變，引起神經(jīng)缺血導(dǎo)致周圍神經(jīng)和自主神經(jīng)癥狀。持續(xù)高血糖狀態(tài)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的氧自由基，進一步影響神經(jīng)、平滑肌和內(nèi)皮功能[2]。因而DMED癥狀往往比非糖尿病性ED更嚴重，需要更積極的治療[1]。褪黑素(melatonin，MT)主要由松果體分泌，具有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。近來，MT在神經(jīng)保護方面的作用受到了越來越積極的關(guān)注[3]。糖尿病性神經(jīng)病變在DEMD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，因此減少神經(jīng)氧化應(yīng)激損傷、促進恢復(fù)神經(jīng)功能不失為治療DMED的良好策略[4]。本實驗在建立DMED大鼠模型基礎(chǔ)上給予MT治療，觀察MT干預(yù)治療對糖尿病性勃起功能障礙大鼠神經(jīng)病變及相關(guān)信號通路的影響，以探討MT改善糖尿病勃起功能障礙的機制。

1材料與方法

1.1實驗試劑與儀器MT，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司)，水合氯醛(蘇州大學(xué)實驗動物中心提供)，總蛋白提取試劑盒、Masson染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，OCT冰凍包埋劑(美國Sakura公司)，抗神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)、抗神經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF)、抗p38及p-p38抗體(美國Abcam公司)，抗GAPDH抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),抗兔熒光二抗(美國InvitrogenLife公司),超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，MP150多導(dǎo)電生理儀(美國Biopac公司)，光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2實驗動物分組及處理本實驗取8周大Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質(zhì)量275～300g，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供。隨機選12只大鼠作為正常對照(N組)，其余28只大鼠禁食后腹腔注射STZ(60mg/kg)造糖尿病模型，3d后檢測血糖確認25只大鼠成模。8周后，隨機分為糖尿病組(DM組，n=12)和MT治療組(MT組，n=13)，N組和DM組給予每天腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液(10mL/kg)，MT組每天腹腔注射MT(10mg/kg)。治療4周后10%水合氯醛麻醉，測定勃起功能，處死并取材。

1.3海綿體內(nèi)壓(intracavernouspressure,ICP)與平均動脈壓(meanarterialpressure，MAP)測定10%水合氯醛麻醉大鼠后，備皮消毒，通過下腹正中切口，暴露盆神經(jīng)節(jié)和陰莖海綿體神經(jīng)，打開陰莖部皮膚暴露大鼠陰莖，暴露左側(cè)頸總動脈，穿刺陰莖和頸總動脈，與MP150電生理儀連接。電極刺激陰莖海綿體神經(jīng)，參數(shù)為20Hz、0.2ms、1.5mA，刺激50s，測量ICP及MAP。

1.4超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測用總蛋白提取試劑盒提取陰莖組織蛋白，喹啉酸法進行蛋白定量。SOD活性用黃嘌呤氧化法顯色，在450nm測定吸光度來定量檢測SOD。MDA含量通過硫代巴比妥酸法顯色，在535nm測定吸光度來定量檢測MDA。操作步驟均嚴格遵照試劑盒說明進行。

1.5免疫熒光將陰莖組織及盆神經(jīng)節(jié)在PBS配制的4%多聚甲醛中固定4h，隨后浸入30%蔗糖4 ℃過夜。用OCT包埋后切成5μm厚冰凍切片，按組別編號。PBS清洗3次，用0.3%Triton-100及1%羊血清通透封閉30min，加入一抗為nNOS抗體(濃度1∶400)和NF抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入熒光二抗AlexaFluor594避光反應(yīng)80min，清洗后DAPI染細胞核，封片，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果用Image-ProPlus6.0分析。

1.6Masson染色陰莖組織用4%多聚甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋后，切成4μm厚石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水，Masson復(fù)合染液染色5min，0.125%醋酸水溶液清洗2次，隨后用5%磷鎢酸染色5min，清洗后亮綠染色5min，醋酸水洗2次。梯度乙醇脫水，二甲苯透明封片，用光學(xué)顯微鏡觀察記錄，結(jié)果用Image-ProPlus6.0分析。

1.7蛋白免疫印跡法(Westernblot)測定提取各組陰莖組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將樣品和Marker加入10%濃度的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，隨后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯濾膜上，用含5%牛奶TBST封閉2h，加入一抗nNOS(1∶400)、p38(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)和GAPDH(1∶20 000)在4℃過夜。復(fù)溫1h，TBST清洗3次，加入二抗常溫反應(yīng)1h，隨后清洗3次，加入發(fā)光液用C-digit儀器進行電化學(xué)發(fā)光，ImageJ圖像分析軟件分析條帶的整合密度值(IntegratedDensity)。

1.8統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，進行正態(tài)性和方差齊性的檢驗，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準差，兩組間的比較采用t檢驗的方法，以P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動物情況DM組及MT組各有1只大鼠死亡，予以剔除，N組大鼠無死亡情況。表1示各組初始體重及初始血糖均無顯著差異(P>0.05)。與N組相比，DM組和MT組大鼠的終末體重均顯著降低(P<0.05)，DM組和MT組大鼠的終末血糖均顯著升高(P<0.05)，DM組與MT組之間無顯著差別(P>0.05)。

表1各組大鼠體重、血糖變化

體重及血糖NDMMT初始體重(g)289.6±11.8290.8±9.6292.1±10.9最終體重(g)602.3±42.7381.0±24.6*392.5±29.4*初始血糖(mmol/L)7.0±0.66.8±0.76.6±0.8最終血糖(mmol/L)6.9±0.528.5±6.5*27.6±4.8*

與N組相比，*P<0.05。

2.2ICP/MAP檢測結(jié)果圖1示DM組大鼠最大ICP值與ICP/MAP值均顯著低于N組大鼠(P<0.05)，MT治療后ICP及ICP/MAP顯著升高(P<0.05)，MT組大鼠最大ICP與ICP/MAP值仍低于N組大鼠(P<0.05)。

2.3褪黑素治療對DMED大鼠陰莖海綿體SOD及MDA的影響圖2示DM組大鼠陰莖海綿體內(nèi)SOD活性顯著低于N組大鼠(P<0.05)，MT治療后，SOD活性得到了顯著的提高(P<0.05)，仍沒有達到N組大鼠水平(P<0.05)。DM組大鼠陰莖海綿體中MDA含量顯著高于N組大鼠(P<0.05)，MT治療后，MDA含量明顯降低(P<0.05)。MT組大鼠陰莖海綿體中MDA含量仍高于N組大鼠(P<0.05)。

圖1各組大鼠ICP及ICP/MAP

與DM組相比，*P<0.05；與N組相比，&P<0.05。

圖2　各組大鼠陰莖SOD及MDA含量

2.4褪黑素治療對DMED大鼠陰莖背神經(jīng)nNOS、NF含量及盆神經(jīng)節(jié)nNOS陽性細胞數(shù)的影響圖3為各組大鼠陰莖蛋白免疫印跡及免疫熒光結(jié)果，顯示DM組大鼠陰莖背神經(jīng)(DPN)的nNOS陽性表達較N組大鼠明顯減少(P<0.05)，MT治療可以顯著提高DMED大鼠陰莖背神經(jīng)nNOS的表達(P<0.05)。圖4免疫熒光結(jié)果顯示DM組大鼠陰莖背神經(jīng)NF陽性纖維數(shù)及盆神經(jīng)節(jié)nNOS陽性細胞數(shù)與N組大鼠相比均明顯下降(P<0.05)，MT治療能顯著增加大鼠陰莖背神經(jīng)NF(P<0.05)及盆神經(jīng)節(jié)中nNOS陽性數(shù)(P<0.05)，MT組大鼠這些指標(biāo)均沒有恢復(fù)到N組大鼠的水平(P<0.05)。

圖3各組大鼠陰莖nNOS表達情況

與DM組相比，*P<0.05；與N組相比，&P<0.05。

圖4　各組大鼠陰莖背神經(jīng)NF及盆神經(jīng)節(jié)nNOS陽性表達情況

2.5褪黑素治療對DMED大鼠陰莖海綿體膠原纖維沉積的影響圖5為各組大鼠陰莖Masson染色，結(jié)果顯示DM組大鼠陰莖海綿體平滑肌與膠原纖維比例與N組大鼠相比明顯下降(P<0.05)，MT治療能夠顯著增加DMED大鼠海綿體平滑肌與膠原纖維比例(P<0.05)，MT組大鼠陰莖海綿體平滑肌與膠原纖維比例低于N組大鼠(P<0.05)。

圖5各組陰莖MASSON染色

與DM組相比，*P<0.05；與N組相比，&P<0.05。

2.6褪黑素治療對DMED大鼠陰莖p38MAPK通路的影響圖6蛋白免疫印跡結(jié)果顯示DM組糖尿病大鼠陰莖p-p38水平較N組大鼠明顯升高(P<0.05)，MT治療能顯著降低p-p38水平(P<0.05)，MT組大鼠陰莖p-p38水平仍高于N組大鼠(P<0.05)。

圖6各組大鼠陰莖p38及p-p38蛋白表達情況

與DM組相比，*P<0.05；與N組相比，&P<0.05。

3討論

陰莖海綿體神經(jīng)末梢及內(nèi)皮細胞釋放的一氧化氮(nitricoxide,NO)可以刺激環(huán)磷酸鳥苷(cyclicguanosinemonophosphate,cGMP)產(chǎn)生，cGMP的積累會舒張海綿體平滑肌，促進血液供應(yīng)，導(dǎo)致勃起[5]。DM可以通過多種病理生理途徑導(dǎo)致ED，包括神經(jīng)病變、肌肉結(jié)構(gòu)功能改變以及內(nèi)皮功能紊亂等。其中神經(jīng)病變是DM患者發(fā)生ED的重要促成因素。糖尿病可以導(dǎo)致選擇性神經(jīng)退行性病變，降低神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)的活性，從而使NO釋放減少，影響陰莖海綿體肌肉的舒張，形成勃起功能障礙，因此氮能神經(jīng)的完整性對于維持陰莖正常勃起十分重要。我們的前期研究表明誘發(fā)糖尿病3個月后，大鼠陰莖背神經(jīng)叢nNOS陽性纖維數(shù)減少，盆神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張，線粒體腫脹、空泡變性，線粒體嵴溶解斷裂及溶酶體減少等神經(jīng)退行性改變[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠陰莖背神經(jīng)叢的神經(jīng)病變可能同時發(fā)生在細胞體及軸突，糖尿病前期發(fā)生的多為神經(jīng)功能性改變，而隨著病程延長更容易發(fā)生氮能神經(jīng)不可逆的結(jié)構(gòu)改變[7]。本實驗中，我們選取檢測陰莖背神經(jīng)及大鼠盆神經(jīng)節(jié)來反映DMED大鼠的神經(jīng)退變情況。免疫熒光結(jié)果顯示DM組糖尿病大鼠陰莖背神經(jīng)及盆神經(jīng)節(jié)均發(fā)生不同程度退行性改變，陰莖背神經(jīng)nNOS及神經(jīng)絲蛋白表達量均明顯減少，盆神經(jīng)節(jié)nNOS陽性細胞數(shù)減少，勃起功能顯著降低，提示糖尿病性神經(jīng)退行性病變影響勃起功能。

褪黑素(MT)是一種松果體分泌的胺類激素，具有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。MT能直接進入細胞或者細胞器清除自由基，來保護細胞核DNA和胞質(zhì)蛋白，也可以間接刺激增強抗氧化酶的活性和相關(guān)基因的表達來發(fā)揮抗氧化作用。而氧化應(yīng)激被認為是神經(jīng)退行性病變的病理生理機制[4]。在本實驗中，DMED大鼠陰莖海綿體內(nèi)SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著增高，提示陰莖海綿體發(fā)生了氧化損傷，MT治療后SOD活性顯著升高，并且MDA含量減少，說明MT治療在陰莖海綿體內(nèi)產(chǎn)生了有效的抗氧化作用。這與先前報道的MT治療可以部分改善糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖氧化應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)果一致[8]。我們還觀察到MT治療顯著增加了糖尿病大鼠陰莖背神經(jīng)nNOS及神經(jīng)絲蛋白含量，恢復(fù)了大鼠盆神經(jīng)節(jié)nNOS陽性細胞數(shù)量。這些結(jié)果表明，褪黑素治療在DMED大鼠神經(jīng)退變中起到了良好的神經(jīng)保護與恢復(fù)作用。

另外，MT可以抑制氧化應(yīng)激所激活的多種通路，包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)和哺乳動物雷帕霉素靶向基因(mammaliantargetofrapamycingene，mTOR)通路等[9]。p38MAPK是MAPKs超家族的重要成員，其廣泛分布于生物體內(nèi)，能被諸多細胞應(yīng)力激活包括氧化應(yīng)激、糖尿病高血糖及炎癥等[10]。p38MAPK信號通路在糖尿病神經(jīng)退行性病變中也起著重要的作用，p38磷酸化為p-p38參與了糖尿病及多種并發(fā)癥的形成過程[11]。也有研究表明p-p38激活與糖尿病性氮能神經(jīng)血管功能障礙密切相關(guān)，并且這種功能障礙能夠被p38MAPK信號通路抑制劑所部分逆轉(zhuǎn)[12]。在本實驗中，Westernblot結(jié)果顯示DMED大鼠陰莖p-p38水平顯著升高，表明糖尿病及其氧化應(yīng)激狀態(tài)可以刺激p38MAPK信號通路激活，這可能是糖尿病發(fā)生神經(jīng)退變及血管并發(fā)癥的機制。有意義的是褪黑素治療后，DMED大鼠陰莖p-p38水平下降，提示褪黑素可能通過抑制p38MAPK信號通路改善糖尿病性神經(jīng)退行性病變。

我們前期在DMED大鼠模型中觀察到了陰莖海綿體平滑肌減少、膠原纖維沉積的現(xiàn)象，這可能與陰莖海綿體轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平升高有關(guān)[13]。陰莖平滑肌及膠原蛋白比例失調(diào)是DMED發(fā)生的重要因素，糖尿病性神經(jīng)退行性病變可以影響平滑肌細胞的舒張，p38MAPK信號通路的激活也可以使多種致纖維化細胞因子增多，這些因素可能會加重陰莖海綿體纖維化[14]。因此抑制p38MAPK通路、恢復(fù)神經(jīng)功能有可能改善膠原纖維沉積。本實驗中，Masson染色結(jié)果顯示，與N組正常大鼠相比，DM組糖尿病大鼠陰莖海綿體平滑肌與膠原蛋白比例明顯下降，陰莖海綿體纖維化加重。褪黑素治療后平滑肌與膠原蛋白比例顯著上升，提示褪黑素治療能夠改善陰莖纖維化，保護陰莖平滑肌的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)果進一步支持了褪黑素抑制DMED大鼠陰莖p38MAPK通路，并發(fā)揮了良好的神經(jīng)保護作用。

褪黑素雖然能夠顯著提高DMED大鼠的勃起功能，但其恢復(fù)效果并沒有完全達到正常組大鼠水平，糖尿病高血糖并沒有得到治療，可能對DMED大鼠產(chǎn)生持續(xù)性損傷，因此褪黑素合并胰島素控制血糖治療會是更好的治療DMED的途徑[15]。本實驗證明褪黑素治療顯著改善DMED大鼠陰莖背神經(jīng)及盆神經(jīng)節(jié)病變，有效減輕陰莖膠原蛋白沉積，其機制可能是通過抗氧化作用及抑制p38MAPK信號通路。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-10-24修回日期：2015-4-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.81300478),江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK20130269),江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項目(No.H201312),蘇州市科學(xué)發(fā)展計劃項目(No.SYS201450)

通訊作者：侯建全，教授、主任醫(yī)師.E-mail：xf192@163.com

作者簡介:惠宇(1989-)，男(漢族)，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：泌尿外科(男科).E-mail：huiyfishing@126.com

中圖分類號:R698.1

文獻標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.04.018

Neuroprotective effects and the possible mechanism of melatonin on erectile dysfunctionin streptozotocin-induced diabetic rats

HUI Yu1, ZHOU Feng1, LEI Hong-en2, YANG Bi-cheng2, XIN Zhong-cheng2, HOU Jian-quan1

(1.DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006; 2.MolecularBiologyLaboratoryofAndrologyCenter,FirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China)

ABSTRACT:Objective To explore the neuroprotective effects and possible mechanism of melatonin (MT) on erectile dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. MethodsA total of 28 SD rats received intraperitoneal injection of streptozotocin. After 8 weeks, the determined diabetic rats were randomly divided into 2 groups: DM group (which received intraperitoneal injection of phosphate buffer solution (PBS) daily), and MT group (which received MT injection). Another 12 normal rats served as controls and received PBS treatment daily. After 4 weeks, intracavernous pressure (ICP), mean arterial pressure (MAP), pathological changes in penis and major pelvic ganglion (MPG) were measured in all rats. Malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), p38 and p-p38 levels in penis were detected. ResultsDiabetic rats showed significant decreases of erectile function accompanied with serious neuropathy in dorsal penile nerve (DPN) and MPG; meanwhile, collagen deposition, oxidative stress and p-p38 levels in penis were elevated. Melatonin treatment partially but significantly improved the erectile function, ameliorated neuropathy in DPN and MPG, decreased collagen deposition, oxidative stress and p-p38 levels in diabetic rats. ConclusionsMelatonin treatment can improve erectile function, ameliorate neuropathy and fibrosis in diabetic rats. The underlying mechanism may involve regulating oxidative stress and inhibiting p38MAPK signaling pathway.

KEY WORDS:erectile dysfunction; diabetes mellitus; melatonin; neuroprotective; antioxidation; p-p38