喬恩楠，張傳杰,2，顏 超，劉 云，崔 莉，朱 平*,2

（1. 武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學(xué) 新型紡織材料綠色加工及其功能化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073）

結(jié)構(gòu)蛋白—豬皮膠原的提取及其理化特性的表征

喬恩楠1，張傳杰1,2，顏 超1，劉 云1，崔 莉1，朱 平*1,2

（1. 武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學(xué) 新型紡織材料綠色加工及其功能化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073）

以豬皮為原料，采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合的方法提取膠原，以提取率為指標(biāo)，進(jìn)行提取條件優(yōu)化，并通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、黏度法和熒光光譜等分析方法對(duì)提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、變性溫度、特征黏度、等電點(diǎn)等理化特性進(jìn)行了表征。結(jié)果表明：豬皮膠原的最佳提取工藝為：料液比1:4、m胃蛋白酶:m豬皮=1:80、pH值2～3、溫度4℃、時(shí)間60h，此時(shí)膠原提取率為18.87%。提取物的結(jié)構(gòu)為豬皮I型膠原，變性溫度為37.5℃，特性黏度為4.0230dL/g，等電點(diǎn)pI=6.0。

豬皮膠原；胃蛋白酶；特性黏度；等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞、組織的重要組成部分，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，它約占人體重量的16%-20%。結(jié)構(gòu)蛋白作為蛋白質(zhì)眾多種類中的一種，它是構(gòu)成動(dòng)物結(jié)締組織和細(xì)胞間質(zhì)的一類蛋白，不僅具有維持細(xì)胞形態(tài)、機(jī)械支持和負(fù)重等功能[1]，而且還在防御、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用，主要包含膠原、彈性蛋白和蛋白多糖3種成分。其中，膠原特有的空間結(jié)構(gòu)[2-3]賦予其優(yōu)異的理化性質(zhì)和生物活性——生物相容性、生物可降解性和低抗原性等[4-6]，從而成為目前研究和應(yīng)用最為廣泛的一類結(jié)構(gòu)蛋白，在食品[7-8]、化妝品[9]、組織工程[10-11]和生物醫(yī)學(xué)材料[12-14]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前，從動(dòng)物組織中提取膠原的方法主要有單獨(dú)使用或聯(lián)用酸法[15-16]、堿法[17]、酶解法[18-19]及熱水抽提法[20]。其中酸法、堿法和熱水抽提法膠原溶出率很低，且酸法、堿法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，水抽提法得到的往往是膠原的變性產(chǎn)物；而酶法專一性強(qiáng)、破壞性小，能更好的獲得活性膠原，但水解不夠徹底[21]。因此，通常采用酸、酶結(jié)合的方法[22-23]來(lái)提取動(dòng)物膠原，這樣不僅膠原溶出率高，而且最大程度的保存了其天然生物活性。

本文以豬肉生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的豬皮下腳料為原料，采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合的方法提取豬皮I型膠原。利用正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，對(duì)酶用量、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，以便得到最佳提取工藝條件。然后，采用紫外光譜、紅外光譜、黏度法和熒光光譜等方法對(duì)提取的膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，并與I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行對(duì)比。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮豬皮（武昌關(guān)山菜市場(chǎng)）；透析袋（生化級(jí) SIGMA公司）。

胃蛋白酶（U=1:3000, High Purity Grade AMRESCO）；I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣（曲阜海昕實(shí)業(yè)有限公司）；醋酸、十二水合磷酸氫二鈉、異丙醇、乙酸乙酯、硝酸銀、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器公司）；LGJ-10-10B冷凍干燥機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；F-320型熒光分光光度計(jì)（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；TU-1950紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DCD-216K冰箱（青島海爾股份有限公司）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；JB90-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)（上海標(biāo)本模型廠制造）；BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；TENSOR27紅外光譜儀（德國(guó)布魯克光譜儀器公司）；PHS-25B型數(shù)字酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豬皮預(yù)處理

用菜刀將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，蒸餾水徹底洗凈后，將其切成5mm×5mm的小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水后稱重，記為m1。

1.3.2 豬皮膠原的提取及純化

參照文獻(xiàn)[24]方法對(duì)預(yù)處理后的豬皮進(jìn)行脫脂處理。在35℃條件下，用體積比為3:1的異丙醇和乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑按照料液比1:4（m/V）對(duì)豬皮顆粒脫脂4h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無(wú)有機(jī)溶劑氣味，瀝干水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在酸性條件下，采用胃蛋白酶對(duì)脫脂后的豬皮進(jìn)行酶解提取，以酶用量（A）、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)為影響因素，膠原提取率為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定最佳提取工藝。然后用NaCl碾細(xì)粉末對(duì)酶解提取的膠原進(jìn)行鹽析兩次，使NaCl最終濃度分別為4.4mol/L和1.7mol/L，并析出膠原絮狀沉淀[25]。將膠原絮狀沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液中，注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的Na2HPO4溶液和蒸餾水中透析2-3天，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無(wú)渾濁現(xiàn)象為止。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.3 膠原提取率

純化后的膠原經(jīng)真空冷凍干燥后，稱其質(zhì)量，記為m2。采用公式（1）計(jì)算膠原提取率，重復(fù)5次，取平均值。

式中：m1是脫脂瀝干水后豬皮質(zhì)量/g；m2是凍干膠原樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 紫外光譜（UV）測(cè)試

將凍干膠原樣品和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣分別溶于0.5mol/L醋酸溶液中，配制成1.0mg/mL的溶液，采用TU-1950型紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.5 等電點(diǎn)測(cè)定

由于膠原分子中含有天然熒光效應(yīng)的氨基酸（酪氨酸），且在等電點(diǎn)處熒光強(qiáng)度最大，黏度最低。采用熒光光度法測(cè)定膠原等電點(diǎn)。參照文獻(xiàn)[26]方法，用0.5mol/L醋酸溶液分別配制質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的豬皮膠原溶液和豬皮I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值，并分別測(cè)定pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0時(shí)豬皮膠原溶液和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣溶液的熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的黏度值，在熒光強(qiáng)度最大處和黏度最小處所對(duì)應(yīng)的同一pH值即為膠原的等電點(diǎn)。

1.3.6 變性溫度測(cè)定

熱變性溫度（Td）為黏度變?yōu)樽畲笾狄话霑r(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。參照文獻(xiàn)[27]方法，采用黏度法測(cè)定膠原熱變性溫度。用0.5mol/L醋酸溶液精確配制1.0mg/mL膠原溶液，用烏氏黏度計(jì)測(cè)定20～45℃（間隔5℃）范圍內(nèi)的增比黏度ηsp，各溫度點(diǎn)恒溫30min，測(cè)定樣品溶液在不同溫度下流出時(shí)間t，每組數(shù)據(jù)測(cè)5次，取平均值，計(jì)算公式如（2）所示：

式中：t為膠原樣品溶液流出時(shí)間/s；t0為溶劑流出時(shí)間/s。

1.3.7 紅外光譜（FT-IR）測(cè)試

明膠、I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣及實(shí)驗(yàn)提取的I型膠原樣品經(jīng)徹底烘干，與溴化鉀混合研磨成細(xì)粉后壓片制樣，采用TENSOR27紅外光譜儀測(cè)試樣品的紅外光譜，設(shè)定掃描范圍4000～400cm-1，分辨率4cm-1，掃描32次。

1.3.8 特性黏度測(cè)定

用0.5 mol/L醋酸溶液精確配制0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)膠原、實(shí)驗(yàn)提取膠原及明膠溶液，在25℃恒溫水浴中，采用烏氏黏度法分別測(cè)定它們?cè)诓煌瑵舛认铝鞒鰰r(shí)間ti，每組數(shù)據(jù)測(cè)5次，取平均值。按照公式（2）分別計(jì)算ηsp，再以ηsp/C對(duì)C作圖，當(dāng)C→0時(shí)，直線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)即為該膠原的特性黏度[η]。

2　結(jié)果與分析

2.1 膠原的最佳提取工藝

表2　酸酶法提取豬皮膠原的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可以看出，試驗(yàn)極差因素A>C>B，即影響膠原提取率的因素主次順序?yàn)槊赣昧?時(shí)間>溫度，這說(shuō)明酶用量是影響豬皮膠原提取率的主要因素。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)水平組合為A2B1C3，由于實(shí)驗(yàn)中因素C對(duì)膠原提取率影響相對(duì)較小，所以為了縮短實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間，選擇60h為實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間，優(yōu)組合為A2B1C1。因此，膠原最佳提取工藝為：酶用量 0.0125mg/g，提取溫度4℃，時(shí)間60h。在此工藝條件下，膠原提取率為18.87%。

2.2 紫外光譜（UV）分析

膠原肽鏈中含有-C=O、-CONH、-COOH等敏感的生色基團(tuán)，可在近紫外區(qū)檢測(cè)到特征吸收峰。從圖1可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原在230nm處有特征吸收峰，與圖中豬皮I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣特征吸收峰位置基本一致，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取物是I型膠原。

圖1　實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣紫外吸收光譜

2.3 等電點(diǎn)分析

圖2　pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)提取豬皮I型膠原黏度和熒光強(qiáng)度的影響

圖3　pH值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)I型膠原黏度和熒光強(qiáng)度的影響

由于膠原是一種有多個(gè)氨基酸組成的兩性聚電解質(zhì)。在膠原每個(gè)肽鏈的兩端都含有α-羧基和α-氨基，當(dāng)膠原溶液pH發(fā)生變化時(shí)，會(huì)影響其在溶液中的存在狀態(tài)，成為帶有許多正電荷或負(fù)電荷離子的蛋白質(zhì)，此時(shí)溶液黏度和熒光強(qiáng)度也會(huì)隨之變化；當(dāng)溶液pH值在膠原等電點(diǎn)附近時(shí)，膠原分子呈電中性，分子收縮，此時(shí)黏度最小，熒光強(qiáng)度最大。

從圖2和圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原的等電點(diǎn)在pI=6.0左右，I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣等電點(diǎn)在pI=5.3處，兩種膠原蛋白的等電點(diǎn)非常接近，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原是I型膠原。

2.4 變性溫度分析

熱變性溫度是反映膠原生物活性的重要指標(biāo)之一。從圖4豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣熱變性溫度曲線可以看出，隨著水浴溫度的升高，提取的膠原的相對(duì)粘度ηr值呈逐漸減小趨勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)提取的膠原比I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣變化要快，當(dāng)溫度從35℃升到40℃時(shí)，兩曲線斜率變化都很大。根據(jù)熱變性溫度的定義，實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣的熱變性溫度分別在37.5℃和38℃左右，這與文獻(xiàn)敘述的變性溫度在37～39℃范圍內(nèi)一致，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取的是豬皮I型膠原。

圖4　實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣熱變性溫度曲線

圖5　明膠、豬皮膠原樣品及豬皮I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣的紅外光譜

2.5 FT-IR分析

圖5是明膠、豬皮膠原樣品及豬皮I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣的紅外光譜曲線。從圖中可以看出，實(shí)驗(yàn)提取膠原特征吸收譜帶:1660cm-1，1550cm-1分別是酰胺Ⅰ帶中酰胺C=O的伸縮振動(dòng)峰和酰胺Ⅱ帶中N-H彎曲振動(dòng)峰[28-29]，在3310cm-1和3076cm-1處分別是酰胺A帶和酰胺B帶吸收峰。1456～1232 cm-1附近的吸收峰是膠原具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[30-31]，從圖5可以看出實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和標(biāo)準(zhǔn)I型膠原在此處均有吸收峰；而明膠是膠原熱變性的產(chǎn)物，其在1446～1232cm-1基本無(wú)吸收峰，說(shuō)明三股螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，這進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取的膠原是I型膠原且保持了完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.6 特性黏度

圖6是實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣在不同質(zhì)量濃度下黏度的變化曲線。從圖中可見(jiàn)，兩者膠原黏度都隨質(zhì)量濃度的增大而增大，基本呈線性關(guān)系，I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣和實(shí)驗(yàn)中用酸酶結(jié)合法提取的膠原的特性黏度分別為5.746dL/g和4.0230dL/g。其中，實(shí)驗(yàn)提取膠原的特性黏度比文獻(xiàn)[32]中用熱水抽提法提取的膠原的變性產(chǎn)物明膠特性黏度大，但又比文獻(xiàn)[15]中用酸法提取的羅非魚(yú)皮膠原的特性黏度小，說(shuō)明不同提取方法及膠原來(lái)源的不同對(duì)膠原的黏度有一定的影響。

圖6　實(shí)驗(yàn)提取的豬皮膠原和I型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣的特性粘度

4　結(jié)論

（1）利用正交優(yōu)化法得出醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合方法提取豬皮膠原的最佳工藝為：料液比1:4、m胃蛋白酶:m豬皮=1:80、pH值2～3、溫度4℃、時(shí)間60h，在此工藝條件下膠原提取率約為18.87%。

（2）實(shí)驗(yàn)提取的膠原在230nm處有紫外特征吸收峰，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取的膠原是豬皮I型膠原。在280nm處有弱吸收峰，說(shuō)明該膠原中含有一定量的像色氨酸和苯丙氨酸等具有苯環(huán)共軛雙鍵的氨基酸，說(shuō)明純度還可以進(jìn)一步提高。紅外圖譜進(jìn)一步說(shuō)明了該膠原是I型膠原，且保持了完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

（3）實(shí)驗(yàn)提取膠原變性溫為37.5℃，在37-39℃范圍內(nèi)，符合I型膠原特性。熒光光度法和黏度法結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)提取膠原pI=6.0左右，與I型膠原pI=5.3很接近，進(jìn)一步佐證了提取物是豬皮I型膠原。

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Structural Protein-Extraction and Characterization of Physcial and Chemical Properties of Porcine Skin Collagen

QIAO En-nan1，ZHANG Chuan-jie1，2，YAN Chao1，LIU Yun1，CUI Li1，ZHU Ping1，2
（1 School of Chemistry and Chemical Engineering，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073，China；2 Key Laboratory of Green Processing and Functional Textiles of New Textile Materials of Ministry of Education，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073，China）

In this paper，collagen was extracted from porcine skin with the combination method of acetic acid and pepsin，using extraction yield of collagen as an index to optimize the extracting conditions，the chemical structure，the denaturation temperature，the characteristics of the viscosity，the physical and chemical properties such as isoelectric point of the extract were characterized by ultraviolet spectrum，infrared spectrum，viscosity method and fluorescence spectrum analysis method. The results indicated that the optimum conditions of extracting collagen as follow: the mass ratio of pepsin to porcine skin with a ratio of material to liquid of 1:4 （m/V） under the condition of 4℃ for 60 hours，the mass ratio of pepsin to porcine skin with a ratio of 1:80 （mg/g），pH value was 2 to 3，under the condition of the process，collagen yield was about 18.87%. The structure of the extract was type I collagen and denaturation temperature，isoelectric point and intrinsic viscosity were 37.5℃，6.0 and 4.0230dL/g，respectively.

porcine skin； pepsin； intrinsic viscosity； isoelectric point

TS201.12

A

2095－414X(2016)03－0058－06

朱平（1957-），男，教授，楚天學(xué)者，研究方向：天然高分子功能材料.

國(guó)家自然科學(xué)基金（51403160）.