蔡曼波，曾益新，邵建永，左建宏，3

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院放療科，衡陽421001；2.中山大學腫瘤防治中心，廣州　510060；3.南華大學醫(yī)學院腫瘤研究所，衡陽　421001）

腫瘤微環(huán)境中Treg細胞和Th17細胞對鼻咽癌進展和預后的影響

蔡曼波1，曾益新2，邵建永2，左建宏1，3

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院放療科，衡陽421001；2.中山大學腫瘤防治中心，廣州510060；3.南華大學醫(yī)學院腫瘤研究所，衡陽421001）

【摘要】目的：研究免疫微環(huán)境中Treg細胞和Th17細胞對鼻咽癌（Nasopharyngealcarcinoma，NPC）進展和預后的影響。方法：收集2001年1月～2003年12月在中山大學腫瘤防治中心經(jīng)病理證實為鼻咽癌的石蠟標本557例。所有患者均為初次診斷且未進行任何治療，隨訪時間均超過5年。采用免疫組化雙染色法檢測Treg細胞分子標志物CD4和Foxp3、Th17細胞分子標志物CD4和IL-17，觀察并計數(shù)，CD4+Foxp3+Treg細胞、CD4+IL-17+Th17細胞在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達數(shù)目，統(tǒng)計分析其陽性細胞數(shù)目與臨床病理特征及與鼻咽癌患者預后的關系。結果：CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細胞主要在腫瘤間質(zhì)浸潤（中位數(shù)：2.0/HPF），然而，在557例鼻咽癌組織石蠟切片染色中均未觀察到CD4+IL-17+雙陽性信號。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計分析結果表明，間質(zhì)中的CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細胞與鼻咽癌患者的無瘤生存時間顯著正相關，而與總體生存時間雖然存在正相關趨勢，但沒有達到統(tǒng)計學意義。單因素Cox比例風險模型顯示，腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細胞高數(shù)量組發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)的風險低于數(shù)量較少的患者，能一定程度降低患者的死亡風險，但沒有達到統(tǒng)計學意義。CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細胞在NPC間質(zhì)中的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)呈負相關。結論：腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細胞浸潤數(shù)量增多與鼻咽癌患者預后呈正相關，降低局部復發(fā)，但不能降低死亡風險；在鼻咽癌腫瘤組織中未觀察到CD4+IL-17+雙陽性信號。

【關鍵詞】腫瘤微環(huán)境；鼻咽癌；CD4+Foxp3+Treg細胞；IL-17

調(diào)節(jié)性T細胞RegulatoryTcells，Treg）是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞，具有明顯的免疫抑制性，該細胞在維持機體免疫、預防免疫性疾病之中起到重要作用［1］。Foxp3分子是賦予Treg細胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特異性的可靠的標志分子［2］。近年來，關于Treg腫瘤免疫以及腫瘤免疫治療逐漸成為研究熱點。Th17細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細胞亞群，其主要效應分子IL-17，具有強烈的促炎癥作用，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用［3］。本研究采用免疫組化雙染色法檢測CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細胞、CD4+IL-17+Th17細胞，觀察并計數(shù)雙然陽性細胞在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達數(shù)目與臨床病理特征及與鼻咽癌患者預后的關系。

1　材料和方法

1.1臨床樣本選取2001年1月～2003年12月經(jīng)中山大學腫瘤防治中心病理科診斷為鼻咽癌并有相應臨床隨訪資料的組織標本557例。入選條件：（1）所收集蠟塊均為患者首次就診診斷為鼻咽癌的活檢標本。（2）觀察HE切片，選擇癌巢較大的鼻咽癌石蠟標本。（3）標本齊全，有完整臨床隨訪資料。（4）死于其它疾病（非鼻咽癌）或意外死亡的病人被剔除。

1.2免疫組化方法分子標記物CD4、Foxp3和IL-17采用免疫組化雙染法檢測。將組織芯片置入56℃恒溫箱，烘片30-60min，將切片取出后，常規(guī)脫蠟、脫水；雙內(nèi)源酶阻斷劑阻斷6分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原修復后，PBS清洗后，滴加一抗（第一種），4℃過夜。PBS清洗后，Polymer/HRP37℃孵育30分鐘，PBS清洗后，滴加顯色劑DAB（DAB用SubstrateBuffer 按1：50稀釋）顯色，自來水終止。PBS清洗后，雙染阻斷劑室溫孵育4分鐘，PBS清洗后，滴加一抗（第二種），4℃過夜，PBS清洗后，Rabbit/MouseLINK）室溫孵育11分鐘，PBS清洗后，Polymer/AP37℃孵育30分鐘，PBS清洗后，滴加顯色劑PermanentRed（用SubstrateBuffer 按1：100稀釋）顯色，自來水終止。蘇木素復染1分鐘，自來水終止顯色，鹽酸酒精分化，蘇木素復染，晾干或吹干后中性樹膠封片。

1.3免疫組織化學結果判斷免疫組化結果判定采用雙盲法，由三名對病例資料完全不知情的病理醫(yī)生對結果進行判定，CD4陽性信號定位于淋巴細胞胞膜，IL-17陽性信號定位于淋巴細胞胞漿，F(xiàn)OXP3陽性信號定位于淋巴細胞胞核。所有計數(shù)均在400倍高倍顯微鏡下隨機觀察5個不重復且具代表性的視野，計數(shù)每個視野下陽性細胞個數(shù)，取其平均值即為各免疫細胞亞群的密度。

1.4統(tǒng)計分析應用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料的檢驗采用X2檢驗，相關性分析采用Pearson法，Kaplan-Meier法比較生存情況（log-rank檢驗），Cox比例風險模型進行預后的多因素分析，并計算風險比（hazardratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），最終得到可以獨立預測預后的參數(shù)。所有統(tǒng)計分析均以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1CD4、FOXP3、IL-17在鼻咽癌組織中的表達情況

在鼻咽癌組織中，CD4表達于淋巴細胞胞膜，F(xiàn)oxp3表達于淋巴細胞胞核，IL-17表達于淋巴細胞胞漿。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞主要在腫瘤間質(zhì)浸潤（箭頭表示）（中位數(shù)：2.0/HPF），極少在腫瘤癌巢中浸潤。然而，我們應用免疫雙染的方法很少發(fā)現(xiàn)CD4與IL-17的共定位（箭頭表示），故未計數(shù)CD4+IL-17+TH17細胞在鼻咽癌微環(huán)境的密度。

圖1　CD4+Foxp3+　Treg細胞和CD4+Foxp3+TH17細胞在鼻咽癌癌巢和間質(zhì)中的表達

2.2CD4+Foxp3+Treg細胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量與鼻咽癌患者預后的影響結合患者的臨床隨訪資料，進一步分析這些免疫細胞是否會影響患者的預后。以ROC曲線建立的cutoff值為臨界值，將巨噬細胞的數(shù)量分為高/低表達數(shù)量組。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計分析結果表明，間質(zhì)中的CD4+Foxp3+Treg細胞與鼻咽癌患者的無瘤生存時間（P＜0.01）顯著正相關，而與總體生存時間雖然存在正相關趨勢，但沒有達到統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2　間質(zhì)組織CD4+Foxp3+　調(diào)節(jié)性T細胞與患者的Kaplan-Meier累計生存曲線

2.3CD4+Foxp3+Treg細胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量對鼻咽癌患者進展的影響采用單因素Cox比例風險模型評價CD4+Foxp3+Treg細胞對患者治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險比（表1）。腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)T細胞高數(shù)量組發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)（HR，0.655；95% CI：0.491-0.875，P=0.009）的風險顯著低于低數(shù)量組的患者，能一定程度上降低患者的死亡風險，但未達到統(tǒng)計學意義（HR，0.76；95%CI：0.551-1.047，P=0.093）。

表1　CD4+Foxp3+Treg細胞的總生存和無瘤生存的單因素Cox比例風險模型

2.4間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細胞與各項臨床參數(shù)之間的相關性腫瘤微環(huán)境中的CD4+Foxp3+Treg細胞能顯著影響患者的預后，浸潤數(shù)量增多能明顯降低患者治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡風險。我們進一步分析間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細胞與各項臨床參數(shù)之間的相關性。結果如表2所示，CD4+Foxp3+Treg細胞在NPC間質(zhì)中的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)呈負相關（Pearson’sR=-0.105，P=0.013）。

表2　CD4+Foxp3+　Treg細胞與臨床病理參數(shù)的相關性

3　討論

鼻咽癌是在中國華南地區(qū)非常常見的一種惡性腫瘤，它與EB病毒（EBV）的感染相關，其腫瘤組織局部存在大量淋巴細胞和其它免疫浸潤［4］。以往對腫瘤基礎研究較多注重腫瘤細胞內(nèi)發(fā)生的一系列分子事件。然而，腫瘤的發(fā)生發(fā)展，既緣于細胞的“內(nèi)因”；但越來越多的研究表明，該過程不僅涉及腫瘤細胞內(nèi)發(fā)生的分子事件，更重要的是一個涉及到腫瘤微環(huán)境的復雜的生物學行為，包括腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境中的各種間質(zhì)細胞的相互作用［5-7］。在腫瘤發(fā)展過程中，機體的免疫系統(tǒng)常常呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)。T細胞是淋巴細胞中數(shù)量最多、功能最復雜的一類細胞。CD4和CD8是區(qū)分成熟T細胞亞群的主要表面標志。其中CD4+T細胞通過分泌不同的細胞因子，對免疫系統(tǒng)的整體功能具有重要的調(diào)控作用。目前確定的CD4+T細胞亞群主要包括1型輔助性T細胞Thelpertype1cells，Th1）、2型輔助性T細胞Thelpertype2cells，Th2）、17型輔助性T細胞Thelpertype17cells，Th17）、濾泡輔助性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞regulatoryTcells，Treg）等。其中，Treg細胞是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫抑制功能的重要CD4細胞亞群。無論鼠類還是人類Treg細胞都特征性表達FOXP3分子，作為核轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix叉頭樣/翼狀螺旋）家族的成員，其編碼基因位于X染色體。Foxp3分子是賦予Treg細胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特異性的可靠的標志分子［1］。

作為腫瘤免疫逃逸的機制之一，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）主要是通過抑制效應細胞的免疫反應來抑制機體的抗腫瘤免疫應答。目前，有報道在多種腫瘤患者外周血和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Treg細胞數(shù)目增多和比例升高，且與患者的臨床預后存在相關性，但在不同類別腫瘤中情況又有所不同。課題組之前發(fā)現(xiàn)FOXP3+TIL細胞浸潤數(shù)目與鼻咽癌患者T分期負相關，與總生存期和無瘤生存期呈正相關［8］。調(diào)節(jié)性T細胞對鼻咽癌進展和預后的影響僅為初步探討，未針對鼻咽癌微環(huán)境中CD4+FOXP3+Treg細胞進行觀察，且當時研究的臨床病例數(shù)較少（106例），調(diào)節(jié)性T細胞對鼻咽癌患者預后需進一步觀察。因此，在本研究中，我們收集了557例鼻咽癌患者5年完整隨訪資料，首次應用免疫組化雙染法檢測了鼻咽癌組織局部浸潤的CD4+FOXP3+Treg細胞和CD4+IL-17+Th17細胞。通過對各免疫細胞亞群進行計數(shù)統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織局部主要是以在腫瘤間質(zhì)浸潤的CD4+FOXP3+Treg細胞為主，很少有CD4+IL-17+雙陽性的Th17細胞，在癌巢中較少有Treg細胞浸潤。在我們研究結果中，CD4+FOXP3+Treg的細胞數(shù)目與鼻咽癌腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)呈負相關，能降低治療后的鼻咽癌患者的轉(zhuǎn)移復發(fā)風險，一定程度患者的死亡風險，與鼻咽癌患者的無瘤生存時間顯著正相關，而與總體生存時間雖然存在正相關趨勢，但沒有達到統(tǒng)計學意義。與課題組之前研究的CD8+FOXP3+Treg對鼻咽癌患者的預后一致［8］，也與EBV相關的濾泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的報導相同［9］。此外，在少數(shù)實體瘤中也有類似報道，如頭頸癌和結腸癌［10-11］。研究提示，鼻咽癌間質(zhì)浸潤的CD4+FOXP3+Treg細胞是患者預后良好的指標，其原因可能這類細胞并不具有免疫抑制功能，而為促進腫瘤患者的免疫應答功能。

在某些腫瘤患者的外周血、腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結內(nèi)可以檢測到Th17細胞［3］。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)Th17細胞的數(shù)量與患者的預后呈正相關，而與疾病進展呈負相關關系［12］；肝癌中也有報道Th17細胞的數(shù)量與患者的預后負相關［13］。本研究首次在鼻咽癌芯片組織中檢測了CD4+IL-17+雙陽性Th17細胞的表達數(shù)目，但在腫瘤癌巢和間質(zhì)均未檢查到明顯CD4+IL-17+雙陽性Th17細胞浸潤。

本研究是首次在鼻咽癌中應用免疫組化雙染法來檢測腫瘤浸潤CD4+FOXP3+Treg細胞和CD4+IL-17+Th17細胞亞群的表達情況，分析其各自的表達數(shù)目與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關性及對預后的影響，在一定程度上切實反映了鼻咽癌局部腫瘤微環(huán)境中免疫狀況及其對患者臨床轉(zhuǎn)歸的影響。免疫微環(huán)境中的CD4+FOXP3+Treg細胞在間質(zhì)中的浸潤在鼻咽癌中傾向于促進機體的免疫應答，抑制腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，這為臨床研究鼻咽癌的免疫治療提供了新思路。

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【中圖分類號】R739.63

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-016X（2016）03-0001-04

收稿日期：2016-01-10

基金項目：國家基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2013CB910301）,國家自然科學基金項目（81272960）,湖南省衛(wèi)生廳項目（B2014-051）,湖南省自然基金項目（S2016J504B）和湖南省重點項目（2013WK2010）

通訊作者：左建宏,E-mail:632138414@qq.com

Influence of Treg and Th17 Cell in the Tumor Microenvironment on Progression and Prognosis
of Nasopharyngeal Carcinoma

Cai Man-bo1, Zeng Yi-xin2, Shao Jian-yong2, Zuo Jian-hong3
（1. The First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, China； 2. State Key Laboratory of Oncology in South China, Cancer Center, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510060, 3. Institute of Oncology, School of Medicine of University of South China, Hengyang 421001）

［Abstract］Objective This study was to investigate the influence of Treg and Th17 Cell on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma NPC）. Methods 557 nasopharyngeal carcinoma paraffin specimens were collected from January 2001 and December 2003 in cancer center of Sun yat-sen university. All the patients without treatment and with 5 yeas followup were included. Double immunohistochemical staining was performed with CD4/FOXP3 and CD4/IL-17 in 557 patients, statistis analyzed the relationship between the positive cells from different parts with the clinical pathological characteristics and the prognosis of NPC patients. Results We found that CD4+Foxp3+ Treg cell infiltration mostly in the stroma of nasopharyngeal carcinoma median: 2.0/HPF）. No co-expression of IL-17 and CD4 was found in NPC TILs by double immunohistochemical staining. Kaplan-Meier survival curve and the log-rank statistical analysis results show that the number of CD4+Foxp3+ Treg cell in stroma were significantly positive correlation with disease-free survival time. Although there is positive correlation with overall survival time trend, but did not reach statistical significance. Single factor Cox proportional hazards model shows that the recurrent and metastasis transfer risk is lower with the more infiltration of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma than a small number of patients after treatment. CD4+Foxp3+ Treg cell reduce the risk of death to a certain extent in patients, but didnot reach statistical significance. More number of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma has lower recurrence and metastasis of transfer of patients after treatment in patients than a small number. Conclusion The number of CD4+Foxp3+Treg infiltration in the and stroma of the immune microenvironment was positively related with the prognosis of NPC patients, and it reduce the risk of local recurrence and distant metastasis.

［Key words］the tumor microenvironment； Nasopharyngeal carcinoma； CD4+Foxp3+Treg cell； IL-17