馬淑云，馮志紅，唐陽(yáng)芳，楊　洋，嚴(yán)佳佳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安　710077）

納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究

馬淑云，馮志紅，唐陽(yáng)芳，楊洋，嚴(yán)佳佳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安710077）

【摘要】目的：探討納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞Skov3增殖和凋亡的影響及其潛在分子機(jī)制。方法：采用機(jī)械研磨法制備納米雄黃；以Skov3細(xì)胞為靶細(xì)胞，分別采用MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和凋亡情況；同時(shí)，利用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：納米雄黃能夠顯著抑制細(xì)胞增殖能力；40mg/L 和80mg/L納米雄黃處理Skov3細(xì)胞48小時(shí)，細(xì)胞凋亡顯著增加；40mg/L納米雄黃處理Skov3細(xì)胞48小時(shí)，Skov3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著增加。結(jié)論：納米雄黃能夠顯著抑制Skov3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的作用。

【關(guān)鍵詞】卵巢癌；納米雄黃；增殖；凋亡；分子機(jī)制

卵巢癌最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤第3位［1］。早期卵巢癌治療效果較好，然而由于卵巢癌早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)多處于晚期，目前仍缺乏有效的治療方法，導(dǎo)致卵巢癌死亡率高居?jì)D科腫瘤第1位［1］。因此，進(jìn)一步探索尋找新的更為有效的治療方法，對(duì)于改善卵巢癌患者預(yù)后具有重要意義。

中藥雄黃是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，其主要成分為三硫化二砷、四硫化四砷等［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：雄黃可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用［3］。然而，傳統(tǒng)雄黃制劑在生物利用度低較低的缺點(diǎn)，影響其治療效果的進(jìn)一步提高。隨著新型藥物制備工藝的提高，納米雄黃越來(lái)越多的用于抗腫瘤藥物的研究［4，5］。本研究旨在研究納米雄黃對(duì)于卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖凋亡能力的調(diào)控作用，并探討潛在分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑人卵巢癌細(xì)胞Skov3購(gòu)自美國(guó)ATCC；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；β-actin、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記鼠及兔二抗單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；青霉素/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；雄黃原藥粉購(gòu)自陜西康惠制藥股份有限公司；Bcl-2及BAX多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CellSigalingTechnology公司；星式球磨機(jī)購(gòu)自南京大學(xué)儀器廠。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將卵巢癌Skov3細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素），置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)。待穩(wěn)定傳代2-3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。

1.3納米雄黃制備利用星式球磨機(jī)對(duì)雄黃原藥研磨納米化，制備的雄黃納米顆粒呈圓形，大小均勻，平均直徑69.98±21.18nm，符合納米藥物制劑的要求。將其溶解于KCl飽和硝酸銀溶液，用NaOH調(diào)節(jié)PH值為7.0，并配置成2mg/ml的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力將100ul的Skov3細(xì)胞（5x104/mL）接種于96孔培養(yǎng)板中。分別加入終濃度為10、20、40和80mg/L的納米雄黃，培養(yǎng)24h、48h和72h后每孔加入5mg/mLMTT溶液10ul孵育4h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150ul，于室溫輕微溶解結(jié)晶15min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置陰性對(duì)照孔。利用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔于490nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡利用納米雄黃處理Skov3細(xì)胞48h后，用0.01mol/LPBS洗滌細(xì)胞，1000r/min離心5min后棄去上清，用1×Bindingbuffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，每管加入500ul細(xì)胞懸液、5ul AnnexinV-FITC和10ulPI?；靹蚴覝乇芄夥跤?0min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6Westernblot利用RIPA蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并利用BCA蛋白定量試劑盒（BCAkit）檢測(cè)蛋白樣品濃度。取30ug蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，利用濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉2h后，加入TBST稀釋的p53多克隆抗體（1∶1000）、Bcl-2多克隆抗體（1∶1000）及β-actin單克隆抗體（mAb，1：1500）4℃孵育過(guò)夜后，加HRP標(biāo)記二抗（1：10000），室溫孵育2h。最后利用ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，使用SPPSS13.0和GraphPadPrism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1納米雄黃抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖活性MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10mg/L的納米雄黃處理細(xì)胞后，在各時(shí)間段對(duì)細(xì)胞增殖均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；20mg/L的納米雄黃處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞增殖未被顯著抑制（P＞0.05），而處理48h及72h后，細(xì)胞增殖活力受到顯著抑制（P＜0.05）；用40mg/L及80mg/L納米雄黃處理細(xì)胞24h后，即可見(jiàn)細(xì)胞增殖被顯著抑制（P＜0.05），而處理48h和72h后，細(xì)胞增殖的抑制作用更加顯著（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1　不同濃度納米雄黃對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率（%）

2.2納米雄黃促進(jìn)卵巢癌Skov3細(xì)胞的凋亡如圖1所示：用40mg/L和80mg/L納米雄黃處理Skov3細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率（%）分別為：21.83±3.25和25.33±3.46，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為7.92±2.76，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　納米雄黃對(duì)Skov3細(xì)胞的凋亡的影響

2.3納米雄黃抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)Bcl-2是細(xì)胞內(nèi)一種重要的凋亡相關(guān)因子，具有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能；而Bax蛋白是另一種凋亡相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生的生物學(xué)功能［6］。Westernblot結(jié)果提示：利用40mg/L的納米雄黃處理Skov3細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，而Bax蛋白的表達(dá)顯著增加。如圖2。

圖2　納米雄黃對(duì)Skov3細(xì)胞中Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達(dá)的影響

3　討論

納米雄黃是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要藥物之一，可用于治療癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹疼、驚癇、瘧等功用［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：納米雄黃能夠發(fā)揮抑制肺癌、宮頸癌及肝癌等惡性腫瘤的生物學(xué)功能［7-9］。納米雄黃可抑制細(xì)胞DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能等多種生物學(xué)作用發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。然而，納米雄黃在卵巢癌是否能夠發(fā)揮抑癌作用以及具體分子信號(hào)機(jī)制，目前尚不明確。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性的死亡，具有高度的保守性，可以通過(guò)死亡受體、凋亡抑制蛋白、線粒體和Caspase酶等多個(gè)水平實(shí)現(xiàn)。其中，Bcl-2家族蛋白和P53蛋白等在調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著非常重要的角色［6］。多種研究表明：腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和凋亡減少是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征。因此，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要策略。本研究從納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用為切入點(diǎn)，探討其在卵巢癌生物學(xué)功能及潛在分子機(jī)制。MTT實(shí)驗(yàn)表明：納米雄黃對(duì)卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖能力具有顯著抑制作用，并且納米雄黃對(duì)Skov3細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物濃度的增加及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明：納米雄黃對(duì)Skov3細(xì)胞的凋亡具有顯著促進(jìn)作用。因此，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：納米雄黃能夠通過(guò)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡而發(fā)揮抑制卵巢癌的作用。

Bcl-2/Bax是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一種重要凋亡相關(guān)因子。既往研究表明［6］：Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，而Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生的功能。本研究通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)：納米雄黃能夠抑制Skov3細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：納米雄黃能夠通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

綜上，本研究表明：納米雄黃能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的生物學(xué)功能。納米雄黃對(duì)于卵巢癌具有潛在的治療價(jià)值，其治療效果需要未來(lái)更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及前期臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

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通迅作者：馬淑云，E-mail：mashuyun36@163.com

【中圖分類號(hào)】R737.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-016X（2016）03-0014-03

收稿日期：2016-02-12

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012JM4051）

The regulation of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell and the underlying mechanisms

Ma Shu-yun, Feng Zhi-hong, Tang Yang-fang, Yang Yang, Yan Jia-jia
（Department of gynaecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shanxi, China）

［Abstract］Objective To elucidate the effects of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of SKOV3 human ovarian carcinoma cells and the underlying mechanisms. Methods Preparation of Realgar Nanoparticle was mechanical milled using a high-energy planetary ball mill. The MTT assay and flow cytometry were used to evaluate the proliferation and apoptosis of SKOV3 cells, respectively. Western blot was employed to determine the expression level of Bcl-2 and Bax in SKOV-3 cells. Results Realgar Nanoparticle could significantly inhibit the proliferation of SKOV3 cells, and treating SKOV3 cells with Realgar Nanoparticle （40mg/L and 80mg/L） resulted in significantly increased apoptosis. After being incubated with the Realgar Nanoparticle （40mg/L） for 48h, the expression level of Bcl-2 was significantly reduced and Bax expression level was significantly increased in the SKOV3 cells. Conclusion Realgar Nanoparticle can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of Skov3 cells, and the inhibitory effects of Realgar Nanoparticle on ovarian carcinoma are probably exerted by decreasing the expression of Bcl-2 protein and increasing the expression of Bax protein.

［Key words］Ovarian carcinoma； Realgar Nanoparticle； Proliferation； Apoptosis； Molecular mechanisms