王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，楊嚴(yán)格，王勇勝，卿素珠

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

?

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進(jìn)展及其在動(dòng)物基因編輯研究中的應(yīng)用

王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，楊嚴(yán)格，王勇勝，卿素珠*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

摘要：CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)系統(tǒng)是由一種短小RNA調(diào)控的對(duì)DNA修飾的基因編輯工具，是一種較鋅指核酸酶(Zinc-fingers nuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like (TAL) effector nucleases，TALEN)打靶更加快速、高效、精準(zhǔn)的新型基因組編輯工具，它易于設(shè)計(jì)，且具有特異性。本文回顧了CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，概述了Cas9的設(shè)計(jì)策略、影響Cas9基因編輯效率的因素、脫靶檢測(cè)分析方法及其在動(dòng)物基因編輯研究中的應(yīng)用。基于CRISPR/Cas9已經(jīng)在多種動(dòng)物上成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯，它有望成為建立動(dòng)物模型和研究疾病防治的一種新型可行性途徑。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因編輯；sgRNA；基因敲除；基因敲入；動(dòng)物模型

1CRISPR/Cas的興起

1987年，日本科研人員[1]在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了一系列相互間隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)，這種短回文序列可以給細(xì)菌與古細(xì)菌提供獲得性免疫[2]，當(dāng)時(shí)有研究者預(yù)測(cè)了 CRISPR/Cas可能是一種新的DNA修復(fù)系統(tǒng)[3-4]。CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于原核生物中，87%的古細(xì)菌和48%的細(xì)菌中都含有此種蛋白免疫系統(tǒng)[5]。最初，CRISPR/Cas系統(tǒng)無法應(yīng)用在人和動(dòng)物上，經(jīng)過改造，它作為一種以核酸酶為核心的基因編輯技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用。

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

2.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)

目前有3種CRISPR/Cas系統(tǒng)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，Cas9核酸蛋白酶主要構(gòu)成和表達(dá)Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。每個(gè)系統(tǒng)包含一群與CRISPR相關(guān)的基因、非編碼RNA和一個(gè)獨(dú)特陣列的正向重復(fù)元件，其中最常見是的肺炎鏈球菌S.pneumoniaeCas9(spCas9)系統(tǒng)，即Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)至少需要3個(gè)組件：一個(gè)CRISPR相關(guān)核酸酶、一個(gè)特異性CRISPR RNA(CRISPR RNAs，crRNA)和一個(gè)反式激活CRISPR RNA(Transactivating crRNA，tracrRNA)[6]。有研究人員為了精簡(jiǎn)這一技術(shù)，設(shè)計(jì)出了代替crRNA- tracrRNA復(fù)合物的單鏈向?qū)NA(Singleguide RNA，gRNA)[7]，它可以將Cas9核酸酶引導(dǎo)到目標(biāo)打靶位點(diǎn)對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割。此外，tracrRNA上還有一個(gè)結(jié)構(gòu)叫做tracrRNA尾巴(TracrRNA tail)，該結(jié)構(gòu)有利于增強(qiáng)Cas9核酸酶的表達(dá)[8]。

CRISPR是一些相互間隔的短回文重復(fù)序列，序列長(zhǎng)度為21～48 bp，這些重復(fù)序列常常產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而且發(fā)卡結(jié)構(gòu)的重復(fù)次數(shù)可達(dá)200次以上[5]。每個(gè)重復(fù)序列都被外源性DNA靶點(diǎn)中與之結(jié)構(gòu)相似的短重復(fù)序列所隔開，叫做典型間隔區(qū)域(Protospacer)，這些間隔區(qū)域序列決定了CRISPR系統(tǒng)的種類以及靶基因的識(shí)別位點(diǎn)[9]。在DNA靶點(diǎn)之內(nèi)，每個(gè)典型間隔區(qū)域始終與典型間隔相鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)相鄰，PAM可以根據(jù)特異性CRISPR系統(tǒng)而變化[10]。常用的PAM有3種類型，分別為NGG、NAG和NNGG[11]。Cas9蛋白含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是HNH結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是RuvC樣結(jié)構(gòu)域。HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域分別切割目標(biāo)DNA鏈的一條單鏈[12]。這樣的單鏈切割容易產(chǎn)生突變，可能是由于HNH和RuvC的存在[13]。

2.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制

如圖1所示，PAM序列引起Cas9蛋白識(shí)別，使得與tracrRNA相連的單鏈向?qū)NA(Single guide RNA，sgRNA)與目標(biāo)位點(diǎn)(Target sequence)識(shí)別，保證了Cas9蛋白和基因組穩(wěn)定地結(jié)合，引起目標(biāo)位點(diǎn)的切割，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks，DSB)[14]。DNA雙鏈斷裂后引起非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)或者同源性定向修復(fù)(Homology-directed repair，HDR)，各個(gè)單鏈通過高精確度的堿基切除修復(fù)機(jī)制(Base-excision repair，BER)進(jìn)行修復(fù)[15-16]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行高效的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knock-in)編輯，如圖2所示，只需對(duì)目的片段進(jìn)行切割，通過NHEJ機(jī)制修復(fù)而引入插入或缺失的突變，就可以達(dá)到Knockout的效果。Knock-in則是將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因的同源序列中，通過HDR修復(fù)，進(jìn)行Knock-in或者點(diǎn)突變，使插入基因組得以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[17]，高效地對(duì)特定位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行Knockout和Knock-in是Cas9系統(tǒng)的一種特色，只需要改變供體載體(Donor vector)上的外源基因即可。

圖1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制Fig.1　Mechanism of CRISPR/Cas9 system

2.3Cas9與傳統(tǒng)技術(shù)的對(duì)比

早期的基因編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)。ZFNs是由鋅指序列組成，F(xiàn)okI核酸酶結(jié)構(gòu)域通過二聚體作用產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性從而切開DNA雙鏈。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)與 ZFNs的構(gòu)建原理相似，設(shè)計(jì)更加優(yōu)化，靶向特異性更加明確。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第3代的人工核酸酶技術(shù)，與ZFNs和TALENs相比，其優(yōu)勢(shì)在于打靶位點(diǎn)多，平均8個(gè)堿基就有一個(gè)打靶位點(diǎn)，ZFNs幾乎到500個(gè)堿基才有一個(gè)合適的打靶位點(diǎn)[18]。其次是Cas9載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，只需根據(jù)特異性打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，而ZFNs 和TALENs則需要對(duì)每個(gè)打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和組裝一對(duì)核酸酶。再者就是Cas9可以高效地進(jìn)行多位點(diǎn)編輯，而ZFNs和TALENs的一對(duì)核酸酶一次只能切割一個(gè)位點(diǎn)，很難提高突變率。但是Cas9的脫靶率要高于ZFNs和TALENs[19]。

圖2　Cas9核酸酶的切割和修復(fù)機(jī)制[17]Fig.2　Cleavage by nucleases and repair mechanism of Cas9 nucleases

3Cas9的設(shè)計(jì)策略

3.1單鏈向?qū)NA的設(shè)計(jì)

sgRNA從5′開始到3′依次為DNA互補(bǔ)區(qū)、crRNA和tracrRNA，其中DNA互補(bǔ)區(qū)的設(shè)計(jì)對(duì)打靶效率有至關(guān)重要的影響[20]。sgRNA中有一個(gè)12個(gè)堿基組成的毗鄰PAM上游的獨(dú)特序列，被稱作“種子區(qū)”[21]，“種子區(qū)”發(fā)生錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別影響更大[22]。sgRNA和目的片段之間一定數(shù)量的錯(cuò)配是可以被容忍的，特別是當(dāng)這些錯(cuò)配離PAM較遠(yuǎn)的情況下[23]，因此在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)需要注意發(fā)生錯(cuò)配的序列位置。針對(duì)基因組設(shè)計(jì)sgRNA的一般標(biāo)準(zhǔn)是：緊鄰著PAM序列(5′-NGG-3′)的12個(gè)堿基的種子區(qū)的3′端最多允許出現(xiàn)1個(gè)錯(cuò)配；在單鏈向?qū)NA(sgRNA)5′末端8個(gè)堿基的區(qū)域允許出現(xiàn)5個(gè)錯(cuò)配[21]。總的來說就是要嚴(yán)格遵守堿基互補(bǔ)原則來設(shè)計(jì)靠近PAM的12個(gè)堿基序列，盡量保證該序列內(nèi)沒有突變或者錯(cuò)配。但是相對(duì)于前人的研究，第7到第12個(gè)堿基也沒有一些特別的序列[24-25]。也有研究表明，增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)和3′尾部結(jié)構(gòu)可以加強(qiáng)向?qū)NA的穩(wěn)定性，有利于Cas9形成正確構(gòu)象[26]。

3.2關(guān)于DNA打靶序列

目前仍然不能確定設(shè)計(jì)打靶序列的精確標(biāo)準(zhǔn)[27]，只是根據(jù)一些常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，在眾多打靶位點(diǎn)中選擇出較好的打靶位點(diǎn)。目前設(shè)計(jì)打靶序列的在線軟件：http：//zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx、http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html、http：//www.rgenome.net/，http：//crispr.mit.edu/、https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/。這幾款在線軟件中，前兩個(gè)的主要功能是尋找打靶序列，之后需要進(jìn)行人工篩選，結(jié)果較為可靠。http：//www.rgenome.net/ 這個(gè)軟件可用來尋找打靶序列并且設(shè)計(jì)向?qū)NA，而且還可以設(shè)定所需的堿基錯(cuò)配數(shù)。http：//crispr.mit.edu/和https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/可以對(duì)生成的sgRNA進(jìn)行排名以供選擇，唯一不足是其數(shù)據(jù)庫內(nèi)的物種有限[28]。

3.3影響Cas9打靶效率的因素

設(shè)計(jì)向?qū)NA時(shí)，GC含量一般為45%～60%為宜，超過這個(gè)范圍都會(huì)影響Cas9的靶向效率以及C堿基富集[29]。C堿基富集使得容易打靶在DNA甲基化的位置，盡量避開甲基化位點(diǎn)有利于減少表觀遺傳突變。但是與之矛盾的是有研究指出甲基化只影響ZFNs和TLAENs，并不影響Cas9的切割效率[8]。DNA聚合酶I超敏感位點(diǎn)(DHS)屬于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種狀態(tài)，可以顯著提高轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞特異性預(yù)測(cè)，將靶向序列設(shè)計(jì)在DHS內(nèi)可提高基因編輯效率[30]。此外，選擇靶向位點(diǎn)時(shí)，盡量選擇外顯子區(qū)域而非內(nèi)含子區(qū)域，這是因?yàn)閮?nèi)含子對(duì)翻譯產(chǎn)物的意義不大且比外顯子更易產(chǎn)生突變。

4切割效率和脫靶效應(yīng)的分析及檢測(cè)

人工設(shè)計(jì)的核酸酶經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生脫靶切割，在基因序列中引起突變(插入、缺失、倒置或易位)，從而使基因異常表達(dá)、細(xì)胞死亡或發(fā)生腫瘤。20 nt 的sgRNA與目的片段之間一定數(shù)目的錯(cuò)配數(shù)導(dǎo)致大量的脫靶突變產(chǎn)生[31]，因此很難徹底和有效地確認(rèn)潛在的脫靶位點(diǎn)。體外試驗(yàn)表明，不同類型的PAM可能會(huì)影響CRISPR/Cas9的切割活性，按照PAM的要求，在基因組上可以產(chǎn)生很大的打靶范圍，打靶位點(diǎn)過多會(huì)導(dǎo)致基因片段在多個(gè)位點(diǎn)被切斷，這也是Cas9容易脫靶的主要原因。

4.1檢測(cè)切割效率和脫靶效應(yīng)的主要手段

檢測(cè)切割效率和脫靶效應(yīng)的主要手段：1.SURVEYOR法或T7EN1酶切法。兩種方法都屬于利用核酸內(nèi)切酶檢測(cè)脫靶情況。SURVEYOR酶是CEL-I錯(cuò)配特異性核酸酶的一種，能準(zhǔn)確切割異源雙鏈DNA錯(cuò)配位點(diǎn)。T7EN1酶能識(shí)別并切割不配對(duì)的雙鏈DNA，將基因編輯后序列與基因編輯前序列相比較，看一定范圍內(nèi)堿基序列是否發(fā)生變化。2.SSA報(bào)告載體檢測(cè)法。該方法是建立SSA報(bào)告載體，報(bào)告載體上Luciferase蛋白失去活性后，在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生打靶后通過比對(duì)Luciferase的活性，評(píng)價(jià)核酸內(nèi)切酶的切割效率和脫靶情況[32]。該法是較為精密的測(cè)試脫靶效應(yīng)的方法。3.Sanger測(cè)序法。直接性地對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或者間接性地轉(zhuǎn)入TA克隆載體中，挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序。4.Digenome-Seq技術(shù)。提取基因組后進(jìn)行高通量測(cè)序，它屬于全基因測(cè)序的一種方法，可以全面有效地檢測(cè)脫靶效應(yīng)[33]。

4.2降低脫靶效率的方法

目前，可通過3個(gè)方面來降低Cas9基因編輯中的脫靶效應(yīng)[8]：第一，提高sgRNA的特異性：(1)盡量降低預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)與sgRNA之間的配對(duì)堿基數(shù)；(2)設(shè)計(jì)的sgRNA與預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)在“種子區(qū)”至少有2個(gè)堿基的錯(cuò)配；(3)盡量避免出現(xiàn)sgRNA與預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)序列有連續(xù)的或間隔的4個(gè)堿基配對(duì)。S.W.Cho等[34]的研究證明修飾sgRNA可以降低Cas9的脫靶效應(yīng)。(4)縮短sgRNA的長(zhǎng)度。將20 nt的sgRNA改造成17～18 nt的縮短型sgRNA，有效地降低了脫靶率[35]。第二，改造Cas9蛋白。F.A.Ran等致力于改造更高特異性的Cas9蛋白，將Cas9蛋白改造為雙切口酶(Double-nicking)，將Cas9切口酶突變體與成對(duì)的sgRNA相結(jié)合產(chǎn)生一種新的復(fù)合蛋白以完成特異性雙鏈斷裂[31]。第三，還可以將Cas9-D10A切口酶與一對(duì)sgRNA配合使用產(chǎn)生SSB(Single-strand breaks，SSB)，以減少因細(xì)胞核內(nèi)不存在DNA同源修復(fù)模板而引起的脫靶突變[36]。

5Cas9在動(dòng)物基因編輯研究上的應(yīng)用

5.1基因敲除

2013年，美國科研工作者基于CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞系上進(jìn)行基因敲除，利用靶位點(diǎn)特異性RNA，將Cas9核酸酶引導(dǎo)到基因組的目的位點(diǎn)上進(jìn)行切割并引起突變。以小鼠為動(dòng)物模型的Cas9基因打靶技術(shù)已經(jīng)革新為“一步法”，該法可實(shí)現(xiàn)多重基因組編輯[37]。H.Wang等[38]選擇對(duì)Tet家族基因(Ten-eleven translocation family members)進(jìn)行敲除，Tet基因的突變可以引起多種腫瘤尤其是造血系統(tǒng)腫瘤。研究人員用顯微共注射方法，將Cas9 mRNA和sgRNA共同注射到小鼠受精卵中同時(shí)敲除Tet1和Tet2，經(jīng)驗(yàn)證敲除效率在80%左右，該試驗(yàn)成功地產(chǎn)生雙等位基因突變的小鼠，并且是首次在動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)敲除2個(gè)內(nèi)源性基因。

Y.Niu等選擇Ppar-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)和Rag1(Recombination activating gene 1)兩個(gè)靶基因，將Cas9 mRNA和單鏈向?qū)NA共同注入食蟹猴受精卵中，在一個(gè)步驟中同時(shí)打靶這2個(gè)基因，在全基因分析檢測(cè)中沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，最后成功獲得了經(jīng)過基因修飾的轉(zhuǎn)基因食蟹猴[39]。靈長(zhǎng)類動(dòng)物在遺傳特性和生理功能方面與人類接近，可以作為研究模型來進(jìn)行人類某些疾病致病機(jī)制及治療策略的研發(fā)。

F.Chen等[40]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬免疫球蛋白M(IgM)重鏈基因的JH區(qū)域(Joining chain)，此區(qū)域?qū)γ庖呦到y(tǒng)的發(fā)育和分化有至關(guān)重要的作用。在體細(xì)胞核移植技術(shù)的支持下，將IgM抗體的Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染仔豬胎兒成纖維細(xì)胞后，基因敲除的效率高達(dá)53.3%，其中25%陽性克隆有雙等位基因修飾，這比傳統(tǒng)的同源重組效率高很多[41]。X.Zhou等人采用Cas9/sgRNAs的方式，敲除了豬胎兒成纖維細(xì)胞上PARK2基因(Parkin2)和PINK1基因(PTEN-induced putative kinase 1)，以突變型細(xì)胞克隆為體細(xì)胞移植的供體，產(chǎn)生純合子的轉(zhuǎn)基因豬[42]。MSTN基因(Myostatin)編碼的氯化筒箭毒堿會(huì)抑制肌肉的分化和生長(zhǎng)，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)將特異性MSTN基因的CRISPR/Cas9 mRNA顯微共注射到綿羊受精卵的胞質(zhì)中，結(jié)果顯示胚胎發(fā)育突變率達(dá)50%[43]。在山羊上，在成纖維細(xì)胞敲除MSTN和FGF5基因的效率都是60%，而在98只試驗(yàn)動(dòng)物中分別敲除了MSTN和FGF5基因后存活下來的動(dòng)物只有15%和21%，雙基因修飾后存活下來的動(dòng)物為10%[44]，這些研究提示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可作為動(dòng)物優(yōu)質(zhì)性狀新品種培育和抗病育種有效的基因編輯工具。通過注射IL2RG和Rag1基因的Cas9 mRNA和sgRNA到原核期胚胎的細(xì)胞質(zhì)中，可獲得高達(dá)100%效率的雙等位基因敲除兔，同時(shí)敲除3個(gè)基因(IL2RG，RAG1和RAG2)和5個(gè)基因(IL2RG，RAG1，RAG2，TIKI1和ALB)的效率均可達(dá)到33.3%[45]。N.Véron等運(yùn)用活體點(diǎn)穿孔技術(shù)，有效敲除雞胚胎干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子PAX7(Paired box 7)，使野生型多細(xì)胞動(dòng)物產(chǎn)生鑲嵌式基因突變[46]，使雞胚胎干性基因的相關(guān)功能丟失。Cas9技術(shù)在斑馬魚上也實(shí)現(xiàn)了高效率的多基因修飾，crRNA-tracrRNA-Cas9蛋白質(zhì)復(fù)合物使內(nèi)源基因表達(dá)可視化，這是在冷水動(dòng)物模型上的首次突破[47]。

5.2基因敲入

有研究發(fā)現(xiàn)如果提供同源DNA，可將外源性序列定點(diǎn)敲入到斑馬魚胚胎的特定靶點(diǎn)，插入效率為3.5%～15.6%[48]。潛在脫靶位點(diǎn)的突變率只有1.1%～2.5%，體現(xiàn)了Cas9系統(tǒng)的特異性。截至目前，利用Cas9系統(tǒng)編輯?；蚪M的相關(guān)文章屈指可數(shù)，可能是因?yàn)榕］^長(zhǎng)的妊娠周期和Cas9易于脫靶的性質(zhì)[49]。2016年，研究者利用NHEJ途徑有效地將一個(gè)4.6 kb的無啟動(dòng)子載體整合到GADPH基因位點(diǎn)上，在人體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞上的敲入率分別為20%和1.7%，并且證明NHEJ途徑比HDR途徑的敲入效率要高[50]，但并沒有評(píng)估NHEJ途徑可能引起的細(xì)胞毒性問題。

6結(jié)語

Cas9系統(tǒng)是微生物自我保護(hù)的一種獨(dú)特機(jī)制，這種保護(hù)機(jī)制是為了防止外來微生物的侵入[51]。它是繼ZFN和TALEN之后出現(xiàn)的更為快捷和有效的基因編輯工具，該技術(shù)旨在提高對(duì)特異性序列的識(shí)別與結(jié)合的能力以及酶切效率，越來越多的研究利用Cas9系統(tǒng)提高了基因編輯在不同物種上的可能性。由于Cas9核酸酶的PAM(5′-NGG-3′)很短，幾乎在任何物種上都可以找到，這就解決了基因編輯工具在跨物種方面的難題，其他基因編輯工具并不能直接做到。高效、時(shí)間成本低、一個(gè)基因組上可進(jìn)行多個(gè)基因位點(diǎn)編輯以及基本不受物種限制都是Cas9基因編輯技術(shù)異軍突起的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也存在著一些不足，如容易脫靶且潛在脫靶位點(diǎn)多、基因突變以及影響打靶效率的因素過多等。脫靶和影響打靶效率的因素尚可預(yù)測(cè)，但基因突變是難以預(yù)測(cè)的。基因編輯過程中產(chǎn)生的基因突變是CRISPR/Cas9打靶系統(tǒng)的副作用，Cas9核酸酶可能會(huì)結(jié)合到意想不到的位點(diǎn)，導(dǎo)致某些位點(diǎn)發(fā)生基因突變。這些都是Cas9系統(tǒng)需要改進(jìn)的方面。

研究者們也在致力于不斷探索和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)的研究，以使其更加快捷、簡(jiǎn)便、完善。I.M.Slaymaker等在金色葡萄球菌中找到了比Cas9核酸酶更小的一種蛋白，它的強(qiáng)大在于更易進(jìn)入成熟細(xì)胞以及更容易切割產(chǎn)生黏性末端以增加DNA序列與載體間的連接[52]，隨后該團(tuán)隊(duì)又在2016年改造出新型eSpCas9(“Enhanced specificity”，SpCas9)基因編輯系統(tǒng)，eSpCas9既降低了脫靶效率又延續(xù)了高效、高準(zhǔn)確度打靶效率[53]。相信隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化和完善，其在動(dòng)物基因編輯研究中的應(yīng)用將更為廣泛，在動(dòng)物新品種培育、抗病育種及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病研發(fā)方面發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli，and identification of the gene product[J].JBacteriol，1987，169：5429-5433.

[2]GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F，et al.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Cell，2013，31：397-405.

[3]MAKAROVA K S，ARAVIND L，GRISHIN N V，et al.A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis[J].NucleicAcidsRes，2002，30(2)：482-496.

[5]GRISSA I，VERGNAUD G，POURCEL C，et al.The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J].BMCBioinformatics，2007，8：172.

[6]HSU P D，LANDER E S，ZHANG F，et al.Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome engineering[J].Cell，2014，157：1262-1278.

[7]PELLETIER S，GINGRAS S，GREEN D R，et al.Mouse genome engineering via CRISPR-Cas9 for study of immune function[J].Immunity，2015，42：18-27.

[8]HSU P D，SCOTT D A，WEINSTEIN J A，et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J].NatBiotechnol， 2013，31(9)：827-832.

[9]DOUDNA J A，CHARPENTIER E.The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J].Science，2014，246：1258096(1-9).

[10]RAN F A，HSU P D，WRIGHT J，et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system[J].NatProtocols，2013，8：2281-2308.

[11]XIAO A，CHENG Z，KONG L，et al.CasOT：a genome-wide Cas9/gRNA off-target searching tool[J].Bioinformatics，2014，30(8)：1180-1182.

[12]HOCKEMEYER D，WANG H，KIANI S，et al.Genetic engineering of human pluripotent cells using TALEnucleases[J].NatBiotechnol，2011，29(8)：731-734.

[13]CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339：819-823.

[14]SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J].Science，2014，343：84-87.

[15]MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339(6121)：823-826.

[16]DIANOV G L，HüBSCHER U.Mammalian base excision repair：the forgotten archangel[J].NucleicAcidsRes， 2013，41(6)：3483-3490.

[17]KIM H，KIM J S.A guide to genome engineering with programmable nucleases[J].NatRevGenet，2014，15(5)：321-334.

[18]方銳，暢飛，孫照霖，等.Crispr/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013，40(8)：691-702.

FANG R，CHANG F，SUN Z L，et al.New method of genome editing derived from CRISPR/Cas9[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics，2013，40(8)：691-702.(in Chinese)

[19]GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].TrendsBiotechnol，2013，31(7)：397-405.

[20]SAPRANAUSKAS R，GASIUNAS G，F(xiàn)REMAUX C，et al.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity inEscherichiacoli[J].NucleicAcidsRes，2011，39(21)：9275-9282.

[21]DOW L E，F(xiàn)ISHER J，O’ROURKE K P，et al.Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9[J].NatBiotechnol， 2015，33(4)：390-394.

[22]KLEINSTIVER B P，PREW M S，TSAI S Q，et al.Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities[J].Nature，2015，523(7561)：481-485.

[23]JIANG W，BIKARD D，COX D，et al.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J].NatBiotechnol，2013，31(3)：233-239.

[24]CHO S W，KIM S，KIM J M，etal.Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease[J].NatBiotechnol，2013，31(3)：230-232.

[25]JINEK M，EAST A，CHENG A，et al.RNA-programmed genome editing in human cells[J].Elife，2013，2(1)：e00471.

[26]NISHIMASU H，RAN F A，HSU P D，et al.Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J].Cell，2014，156(5)：935-949.

[27]CARROLL D.Staying on target with CRISPR-Cas[J].NatureAmerica，2013，31：807-809.

[28]MONTAGUE T G，CRUZ J M，GAGNON J A，et al.CHOPCHOP：a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing[J].NucleicAcidsRes，2014，25：1-7.[29]WILES M V，QIN W，CHENG A W，et al.CRISPR-Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J].MammGenome，2015，26(9-10)：501-510.

[30]GUSMAO E G，DIETERICH C，ZENKE M，et al.Detection of active transcription factor binding sites with the combination of DNase hypersensitivity and histone modifications[J].Bioinformatics，2014，30(22)：3143-3151.

[31]RAN F A，HSU P D，LIN C Y，et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J].Cell，2013，154(6)：1380-1389.

[32]BHAKTA M S，SEGAL D J.The generation of zinc finger proteins by modular assembly[J].MethodsMolBiol，2010，649：3-30.

[33]KIM D，BAE S，PARK J，et al.Digenome-seq：genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells[J].NatMethods，2015，12(3)：237-243.

[34]CHO S W，KIM S，KIM Y，et al.Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J].GenomeRes，2014，24(1)：132-141.

[35]FU Y F，SANDER J D，REYON D，et al.Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J].NatBiotechnol，2014，32(3)：279-284.

[36]TREVINO A E，ZHANG F.Chapter eight-genome editing using Cas9 nickases[J].MethodsEnzymol，2014，546：161-174.

[37]YANG H，WANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153：1370-1379.

[38]WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153：910-918.

[39]NIU Y，SHEN B，CUI Y，et al.Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J].Cell，2014，156：836-843.

[40]CHEN F，WANG Y，YUAN Y，et al.Generation of B cell-deficient pigs by highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene targeting[J].JGenetGenomics，2015，42(8)：437-444.

[41]TU Z，YANG W，YAN S，et al.CRISPR/Cas9：a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases[J].MolNeurodegener，2015，10：35-37.

[42]ZHOU X，XIN J，F(xiàn)AN N，et al.Generation of CRISPR/Cas9-mediated gene-targeted pigs via somatic cell nuclear transfer[J].CellMolLifeSci，2015，72(6)：1175-1184.

[43]CRISPO M，MULET A P，TESSON L，et al.Efficient generation of myostatin knock-out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes[J].PLoSOne，2015，10(8)：366-375.

[44]WANG X，YU H，LEI A，et al.Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system[J].SciRep，2015，5：13878.

[45]YAN Q，ZHANG Q，YANG H，et al.Generation of multi-gene knockout rabbits using the Cas9/gRNA system[J].CellRegen(Lond)，2014，3(1)：12.

[46]VéRON N，QU Z，KIPEN P A，et al.CRISPR mediated somatic cell genome engineering in the chicken[J].DevBiol，2015，407(1)：68-74.

[47]KOTANI H，TAIMATSU K，OHGA R，et al.Efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs，tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish[J].PLoSOne，2015，10(5)：128-134.

[48]HRUSCHA A，KRAWITZ P，RECHENBERG A，et al.Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish[J].Development，2013，140(24)：4982-4987.

[49]WANG Z.Genome engineering in cattle：recent technological advancements[J].ChromosomeRes，2015，23(1)：17-29.

[50]HE X，TAN C，WANG F，et al.Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair[J].NucleicAcidsRes，2016，[Epub ahead of print].

[51]ZETSCHE B，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al.Cpfl is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J].Cell，2015，163(3)：759-771.

[52]SLAYMAKER I M，GAO L，ZETSCHE B，et al.Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J].Science，2016，351(6268)：84-88.

[53]JIANG W，ZHOU H，BI H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].NucleicAcidsRes， 2013，41(20)：188-193.

(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.001

收稿日期：2016-01-08

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2014K02-05-01)；2015年西北農(nóng)林科技大學(xué)第二批基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科技創(chuàng)新專項(xiàng)(Z109021566)

作者簡(jiǎn)介：王瑋瑋(1990-)，女，甘肅蘭州人，碩士生，主要從事動(dòng)物組織胚胎學(xué)方面的研究，E-mail：weiweiwang1990@163.com *通信作者：卿素珠，主要從事動(dòng)物組織胚胎學(xué)及生殖內(nèi)分泌調(diào)控研究，E-mail：suzhuqing@163.com

中圖分類號(hào)：S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1299-07

The Progress of CRISPR/Cas9 System and Its Application in Animal Genetic Engineering

WANG Wei-wei，LIU Rui-qi，WU Yong-yan，YANG Yan-ge，WANG Yong-sheng，QING Su-zhu*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Abstract:CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)) system is a DNA modified gene editing tools regulated by a kind of short RNA.This technology is a novel tool，which is more rapid，efficient and accurate than ZFN (zinc-fingers nuclease) and TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases) in genetic engineering.It is easy to be designed and has specificity.This paper reviews the structure and function of CRISPR/Cas9 system and the design strategy of Cas9 and its application in animal genetic engineering.CRISPR/Cas9 is successfully used in a variety of animal genetic editing，it is likely to become a new way to establish animal models and to develop a new feasible approach to prevent disease.

Key words:CRISPR/Cas9 system；genetic engineering；sgRNA；gene knockout；gene knock-in；animal models