童穎佳，鄔文嘉，彭　輝，劉陸罡，黃　和，紀(jì)曉俊

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微生物合成2,3-丁二醇的代謝工程

童穎佳，鄔文嘉，彭輝，劉陸罡，黃和，紀(jì)曉俊

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

摘要:2,3-丁二醇 (2,3-BD) 是一種重要的微生物代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制約著其生物制造工業(yè)化進(jìn)程，應(yīng)用代謝工程的理論和方法優(yōu)化微生物的代謝途徑有望解決這一問題。本文全面總結(jié)了近年來微生物合成2,3-BD研究過程中的菌株改造和構(gòu)建技術(shù)，包括過表達(dá)合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因、敲除旁路代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因、應(yīng)用輔因子工程手段對(duì)天然菌株代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和合理改造，以及利用合成生物學(xué)技術(shù)在模式菌株中構(gòu)建全新的代謝途徑，實(shí)現(xiàn)2,3-BD的高效生物合成。最后，本文對(duì)未來的研究方向進(jìn)行了展望，提出了進(jìn)一步利用先進(jìn)的合成生物學(xué)方法構(gòu)建高效細(xì)胞工廠的指導(dǎo)性建議。

關(guān)鍵詞:2,3-丁二醇；代謝；生化工程；輔因子調(diào)控；全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控；合成生物學(xué)

引 言

隨著石油資源的日益短缺和過度消耗，能源安全、環(huán)境污染成為全世界普遍關(guān)注的問題。通過生物學(xué)方法對(duì)微生物進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的物質(zhì)加工與轉(zhuǎn)化，能在發(fā)展經(jīng)濟(jì)的同時(shí)兼顧生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，實(shí)現(xiàn)能源結(jié)構(gòu)的綠色轉(zhuǎn)型，是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略、推動(dòng)節(jié)能減排的一種有效的手段。2,3-丁二醇 (2,3-BD) 是一種重要的生物基化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[1]，可用于制備油墨、香水香薰、增濕劑、軟化劑、炸藥、燃料添加劑、增塑劑和藥物手性載體等工業(yè)產(chǎn)品[2-3]。同時(shí)，通過特定的化學(xué)反應(yīng)，2,3-BD可以衍生出多種重要的化學(xué)品，例如甲乙酮、1,3-丁二烯、乙偶姻、雙乙酰等[4-5]。最早關(guān)于2,3-BD的研究報(bào)道可以追溯到20世紀(jì)初期。在1906年，Harden和Walpole首次報(bào)道了利用肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) 發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD的研究[2]。由于第二次世界大戰(zhàn)時(shí)對(duì)于1,3-丁二烯的大量需求，2,3-BD的研究得到了蓬勃的發(fā)展。但是，到了20世紀(jì)50年代，由于石油資源的大量開采和價(jià)格優(yōu)勢(shì)，以石油為原料生產(chǎn)1,3-丁二烯更加便宜，導(dǎo)致生物法生產(chǎn)2,3-BD逐漸被化學(xué)法所取代[6]。20世紀(jì) 70年代末，伴隨著石油危機(jī)的爆發(fā)、價(jià)格上漲以及環(huán)境污染等問題，生物法合成2,3-BD又重新引起了社會(huì)各界的關(guān)注[7]。特別是21世紀(jì)以來，生物法生產(chǎn)2,3-BD的研究達(dá)到了新的高潮。然而，從自然界中篩選得到的生產(chǎn)2,3-BD的天然菌株有著生產(chǎn)強(qiáng)度和光學(xué)純度低，對(duì)廉價(jià)的生物質(zhì)可再生資源（包括淀粉，木質(zhì)纖維素，糖蜜等）利用效率低等缺陷，且在發(fā)酵過程中生成了較多的副產(chǎn)物，導(dǎo)致2,3-BD的轉(zhuǎn)化率較低，下游分離困難，限制了2,3-BD的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的興起，對(duì)2,3-BD生產(chǎn)菌株和代謝途徑改造的研究逐漸深入，改造手段和方法不斷創(chuàng)新，2,3-BD的生產(chǎn)水平得到了質(zhì)的飛躍。本文結(jié)合本課題組的前期研究工作，綜述了利用代謝工程的原理和方法對(duì)天然微生物代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和合理改造，以及利用合成生物學(xué)技術(shù)在模式菌株中構(gòu)建2,3-BD合成途徑的最新進(jìn)展，并對(duì)未來的重點(diǎn)研究方向進(jìn)行了展望。

表1　2,3-丁二醇天然生產(chǎn)菌株及研究水平Table 1 Biotechnological production of 2,3-butanediol using natural strains

1　生物合成 2,3-丁二醇的微生物及其代謝途徑

在自然界中，很多微生物都能夠以單糖為底物通過微生物代謝積累2,3-BD（表1）。在微生物典型的2,3-BD合成途徑中，糖類物質(zhì)在α-乙酰乳酸合成酶 (α-acetolactate synthase, ALS)、α-乙酰乳酸脫羧酶 (α-acetolactate decarboxylase, ALDC)、2,3-丁二醇脫氫酶（2,3-butanediol dehydrogenase，2,3-BDH；又稱乙偶姻還原酶，acetoin reductase，AR）的作用下經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻并最終轉(zhuǎn)化為2,3-BD。此過程伴隨著副產(chǎn)物乙酸、乳酸、乙醇、丁二酸、甲酸等的生成[4]（圖1）。這種合成途徑在克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌屬 (Enterobacter) 等菌屬中廣泛存在。幾種典型微生物2,3-BD代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因的分布情況如圖2所示。通常，編碼這3種關(guān)鍵酶的基因位于同一操縱子 (budABC) 內(nèi)，如土生克雷伯氏菌 (Klebsiella terrigena)、K. pneumoniae和產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogens)，受到LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AlsR（由budR/alsR編碼）的調(diào)控[4,17-18]。而產(chǎn)酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca) 不僅擁有該操縱子，還存在著一種雙乙酰/乙偶姻還原酶基因 dar。該基因遠(yuǎn)離操縱子budABC，屬于短鏈脫氫酶/還原酶 (SDR) 家族，且與budC屬于同一個(gè)同源組[17]。在其他產(chǎn)2,3-BD的典型菌株中，例如芽孢桿菌屬 (Bacillus) 和沙雷氏菌屬 (Serratia)，編碼ALS和ALDC的基因處于同一個(gè)操縱子alsSD中，同樣受到AlsR的調(diào)控，可編碼2,3-BDH的基因位于alsSD操縱子之外，表達(dá)水平并沒有受到影響[19-20]。在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 中，AlsR是通過連接到alsR基因與alsS基因之間的順式作用區(qū)域來正向調(diào)節(jié)alsSD操縱子的轉(zhuǎn)錄的[19]。而在乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) 中，2,3-BD途徑的相關(guān)基因并沒有組成操縱子[17]。

圖1　混合酸-2,3-丁二醇代謝途徑[2]（虛線表示只在有氧條件下活躍的途徑；紅線表示在以往研究中被過表達(dá)的途徑；藍(lán)線表示在以往研究中被敲除的途徑）Fig.1 Mixed acid-2,3-BD pathway[2](dashed lines represent the pathways that are active only under the aerobic conditions; red lines represent the pathways that once overexpressed; blue lines represent the pathways that once knocked out)

TCA—tricarboxylic acids cycle; 1—Embden-Meyerhof and pentose phosphate pathway enzymes; 2—pyruvate kinase; 3—pyruvate-formate lyase; 4—acetaldehyde dehydrogenase; 5—ethanol dehydrogenase; 6—phospho-transacetylase; 7—acetate kinase; 8—α-acetolactate synthase; 9—α-acetolactate decarboxylase; 10—2,3-butanediol dehydrogenase (acetoin reductase); 11—lactate dehydrogenase; 12—phosphoenolpyruvate decarboxylase; 13—malate dehydrogenase; 14—fumarase; 15—succinate dehydrogenase; 16—formate-hydrogen lyase complex; 17—pyruvate dehydrogenase multi-enzyme complex; 18—citroyl synthetase

圖2　幾種典型微生物2,3-丁二醇代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因分布情況[17]Fig.2 Genetic organization of genes involved in 2,3-BD production from representative natural producers[17]

TA—gene encoding the transcriptional activator; ALDC—gene encoding α-acetolactate decarboxylase; ALS—gene encoding α-acetolactate synthase; BDH—gene encoding 2,3-BD dehydrogenase/acetoin (diacetyl) reductase

目前，用來發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD的主要是細(xì)菌類，其中，具有較高潛力的生產(chǎn)菌株主要包括克雷伯氏菌屬[8-9]、腸桿菌屬[10-11]、芽孢桿菌屬[12-14]、類芽孢桿菌屬[15]以及沙雷氏菌屬[16]等。目前，克雷伯氏菌屬和類芽孢桿菌屬被認(rèn)為是最有可能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的菌種[2]。在真菌中，雖然一些酵母也具有生物合成2,3-BD的能力，但由于其生產(chǎn)的2,3-BD產(chǎn)量、純度均較低，限制了其應(yīng)用。但最近有很多研究通過代謝工程以及合成生物學(xué)技術(shù)，使得利用酵母生產(chǎn)2,3-BD變成了可能[21-22]。

2　微生物合成 2,3-丁二醇的代謝途徑改造策略

通過傳統(tǒng)誘變育種如物理誘變或者化學(xué)誘變等方式選育高產(chǎn)菌株一直是國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。但這種方式存在隨機(jī)性和不確定性，需要經(jīng)過大量的篩選才能獲得想要的性狀。利用基于全基因組的系統(tǒng)代謝工程和輔酶調(diào)控策略對(duì)關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行合理的遺傳改造，通過多途徑優(yōu)化的方法阻斷各種競(jìng)爭(zhēng)支路來強(qiáng)化 2,3-BD生物合成代謝途徑有望快速獲得遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、發(fā)酵水平和產(chǎn)物光學(xué)純度顯著提高的細(xì)胞工廠。

2.1 利用代謝工程手段改造產(chǎn) 2,3-丁二醇的野生菌株

2.1.1 合成支路和底物利用途徑的強(qiáng)化 從丙酮酸到2,3-BD的轉(zhuǎn)化需要3種關(guān)鍵酶（ALS，ALDC，2,3-BDH）的聯(lián)合作用，提高這 3種關(guān)鍵酶的表達(dá)能顯著提高2,3-BD的產(chǎn)量，其中2,3-BDH由于其可逆的催化效果成為了研究者關(guān)注的重點(diǎn)。Guo 等[23]通過在 K. pneumoniae中過表達(dá) ALS和2,3-BDH，構(gòu)建了一株高產(chǎn)2,3-BD的重組菌，在以葡萄糖為碳源的補(bǔ)料發(fā)酵中，重組菌2,3-BD的產(chǎn)量與原始菌相比提高了 12%。Zhang[24]在粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens) H30中過表達(dá)了2,3-BDH的編碼基因budC，使重組菌中2,3-BDH的活性提高了21倍。5 L罐發(fā)酵結(jié)果顯示，過表達(dá)budC基因能在顯著提高2,3-BD產(chǎn)量（增加了78.5%）的同時(shí)降低發(fā)酵液中乙偶姻以及副產(chǎn)物乙醇、乳酸、丁二酸的含量（分別下降了86.1%、45.3%、27.2%和51.9%）。Cho等[9]在一株代謝具有溫度選擇性的K. oxytoca M1中過表達(dá)了2,3-BDH的編碼基因，使得K. oxytoca M1中乙偶姻的產(chǎn)量減少了43%，同時(shí)2,3-BD的產(chǎn)量也有了顯著的提高，產(chǎn)量、產(chǎn)率以及生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了142.5 g·L-1，0.42 g·g-1和1.47 g·L-1·h-1，這是K. oxytoca中2,3-BD發(fā)酵生產(chǎn)的最高產(chǎn)量。Bai等[25]從S. marcescens MG1中鑒定了一種由slaC基因編碼的meso-2,3-BDH，并發(fā)現(xiàn)失活slaC基因能導(dǎo)致(3R)-乙偶姻的大量積累，而在敲除slaC基因的S. marcescens MG1重組菌中過表達(dá)來自B. subtilis 168的2,3-BDH編碼基因bdhA能促使(3R)-乙偶姻向(R, R)-2,3-BD的轉(zhuǎn)化。在補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，重組菌在48 h內(nèi)生成了89.81 g·L-1的(R, R)-2,3-BD，生產(chǎn)強(qiáng)度為 1.91 g·L-1·h-1。這些結(jié)果為高產(chǎn) 2,3-BD基因工程菌的構(gòu)建提供了新的思路。

除了過表達(dá)2,3-BD的合成支路，通過代謝工程技術(shù)還能使工程菌具備利用廉價(jià)原料生產(chǎn) 2,3-BD的能力。Zheng等[26]通過在K. pneumoniae KG1中過表達(dá)內(nèi)源的α-淀粉酶編碼基因malS，使重組菌能直接利用淀粉而無須液化和糖化步驟。這是在克雷伯氏菌中通過過表達(dá)淀粉酶編碼基因簡(jiǎn)化發(fā)酵過程的第一次嘗試，但是在重組菌中淀粉酶的活性只有少量的提高，而2,3-BD極低的產(chǎn)量 (3.8 g·L-1) 以及轉(zhuǎn)化率 (0.19 g·g-1) 則說明內(nèi)源的淀粉酶編碼基因并不能滿足降解淀粉來高產(chǎn) 2,3-BD的需要。隨后，Tsvetanova等[27]在K. pneumoniae G31-A中外源表達(dá)了來自于地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis) 的α-淀粉酶編碼基因，通過對(duì)該α-淀粉酶編碼基因的過表達(dá)，在K. pneumoniae中檢測(cè)到了很高的淀粉酶活性。在以土豆淀粉為底物的同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，獲得2,3-BD 53.8 g·L-1。這是第一次在K. pneumoniae中成功表達(dá)外源淀粉酶編碼基因，并第一次成功地以淀粉為底物發(fā)酵高產(chǎn)2,3-BD。Ji等[28]通過在K. oxytoca中過表達(dá)突變的環(huán)磷酸腺苷受體蛋白 CRP(in)的編碼基因 crp(in)，解除了葡萄糖對(duì)木糖的阻遏作用，使得突變株能夠同時(shí)利用木糖和葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD，從而提高了菌株的生長(zhǎng)速度以及2,3-BD的生產(chǎn)強(qiáng)度。Li等[11]在一株重組陰溝腸桿菌 (Enterobacter cloacae) SDM的基礎(chǔ)上，通過失活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 ptsG以及過表達(dá)半乳糖透性酶編碼基因 galP的方法消除了碳代謝抑制，使其可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖。接著，為了進(jìn)一步提高(R, R)-2,3-BD的產(chǎn)量，又敲除了副產(chǎn)物合成編碼基因ldh和frdA。在以葡萄糖和木糖為底物的補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，重組菌在 44 h內(nèi)生產(chǎn)了152 g·L-1(R, R)-2,3-BD (純度 > 97.7%)，生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)3.5 g·L-1·h-1，對(duì)葡萄糖和木糖的產(chǎn)率達(dá)理論產(chǎn)率的97.7%。這是到目前為止，以葡萄糖和木糖為底物微生物發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-BD的最高產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。由于碳代謝阻遏，甘蔗糖蜜中的混合糖（蔗糖，果糖）并不能像葡萄糖一樣被有效利用。因此Jung等[10]敲除了E. aerogens中代謝阻遏/活性蛋白Cra的編碼基因來提高果糖的利用效率，但是突變株中蔗糖的消耗速度卻因此受到了影響。通過反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR研究了cra缺失菌株中與蔗糖利用相關(guān)的6個(gè)關(guān)鍵基因（scrA，scrB，scrR，scrK，cra和crp）的轉(zhuǎn)錄水平后，發(fā)現(xiàn)scrA和scrB的轉(zhuǎn)錄水平分別下降了32%和24.9%。由于Cra是通過直接連接到scrAB操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)節(jié)其表達(dá)的，而該啟動(dòng)子同時(shí)還受到ScrR（由scrR基因編碼）的負(fù)調(diào)節(jié)作用，因此Jung等通過敲除scrR基因以及過表達(dá)scrAB操縱子的手段恢復(fù)了cra缺失菌株對(duì)蔗糖的利用。隨后，他們還通過過表達(dá)ptsG基因提高了菌株對(duì)葡萄糖的利用效率。在補(bǔ)料發(fā)酵中，重組菌以甘蔗糖蜜為原料54 h生產(chǎn)了140 g·L-1的2,3-BD。該研究是利用代謝工程手段提高菌株對(duì)廉價(jià)碳源利用效率的一次成功的嘗試。

到目前為止，以合成支路和底物利用途徑的強(qiáng)化手段提高2,3-BD產(chǎn)量的研究成果匯總于表2。

表3　2,3-丁二醇天然生產(chǎn)菌株合成支路和底物利用途徑的強(qiáng)化及研究水平Table 2 Metabolic engineering for 2,3-butanediol overproduction by enhancements of 2,3-butanediol branches and substrate utilization pathways

2.1.2 旁路基因的敲除 隨著代謝工程技術(shù)的興起和不斷進(jìn)步，利用基因工程手段改造菌種以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并減少副產(chǎn)物的積累成為了最近研究的熱點(diǎn)，混合酸發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸、乙醇、乳酸或丁二酸等相關(guān)基因的敲除成為了研究者普遍選擇的改造策略。Jantama等[29]敲除了 K. oxytoca KMS005中的乙醇脫氫酶E編碼基因adhE，乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因ackA-pta，以及乳酸脫氫酶編碼基因ldhA，顯著降低了副產(chǎn)物濃度。Ji等[30]通過同源重組的方法敲除了突變株 K. oxytoca ME-UD-3中的乙醛脫氫酶編碼基因aldA，阻斷了副產(chǎn)物乙醇的生成，并且使另一種副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量也顯著下降。利用突變株進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，2,3-BD的產(chǎn)量可達(dá)130 g·L-1。Qi等[31]敲除了B. licheniformis WX-02的meso-2,3-BDH編碼基因，從而阻斷了meso-2,3-BD的合成，突變株能夠?qū)Ｒ环e累30.76 g·L-1的(R,R)-2,3-BD。Rados等[32]在敲除了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1亞基編碼基因aceE，丙酮酸:醌氧化還原酶編碼基因pqo，ldhA和蘋果酸脫氫酶編碼基因mdh的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 中克隆并表達(dá)了來自于L. lactis的2,3-BD合成途徑，在消除副產(chǎn)物的同時(shí)提高了2,3-BD的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，在微氧條件下2,3-BD的產(chǎn)量為6.3 g·L-1。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)利用S. marcescens H30發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD時(shí)，該菌會(huì)產(chǎn)生一種活性物質(zhì) (serrawettin W1)，形成大量的泡沫，容易造成染菌且致使發(fā)酵過程中需要添加大量消泡劑。為了避免這一現(xiàn)象，他們敲除了編碼serrawettin W1合成的關(guān)鍵酶基因swrW。重組菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫明顯減少，并且2,3-BD的產(chǎn)量也得到了提高。最終，利用蔗糖批次流加發(fā)酵57 h后，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到了152 g·L-1，這一結(jié)果是目前文獻(xiàn)報(bào)道中2,3-BD的最高產(chǎn)量。

以往2,3-BD的生產(chǎn)都集中在糖類發(fā)酵方向，但生物柴油衍生的粗甘油也可以作為 2,3-BD發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)廉價(jià)來源。可是在嘗試以粗甘油作為原料發(fā)酵2,3-BD時(shí)，1,3-丙二醇的大量積累以及2,3-BD的低產(chǎn)量成為阻礙甘油發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-BD的主要原因。為了解決這一問題，Cho等[33]敲除了K. oxytoca M1中編碼甘油脫水酶大亞基的 pduC基因以及l(fā)dhA基因。發(fā)酵結(jié)果顯示，以粗甘油為碳源時(shí)，重組菌生產(chǎn)了131.5 g·L-1的2,3-BD，且在生產(chǎn)過程中并沒有檢測(cè)到1,3-丙二醇。

目前高產(chǎn) 2,3-BD的野生菌株，如 K. pneumoniae、K. oxytoca、S. marcescens、E. cloacae等大多具有致病性，限制了它們的工業(yè)化應(yīng)用?？茖W(xué)家們已經(jīng)證實(shí)K. pneumoniae致病的毒力因子主要包括菌毛、莢膜多糖、脂多糖、受體、鐵載體等[34]。通過代謝工程手段消除或弱化該菌的毒性已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，又稱內(nèi)毒素，是糖-蛋白質(zhì)-磷脂復(fù)合物，屬于革蘭陰性菌的細(xì)胞壁組分。脂多糖可改變宿主免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致致病和生理變化，并干擾其他抗原的免疫應(yīng)答，還可激活凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)，有助于細(xì)菌對(duì)宿主的感染[34]。Jung等[35]敲除了K. pneumoniae KCTC 2242、K. oxytoca KCTC 1686和K. oxytoca ATCC 43863中與脂多糖合成有關(guān)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因 wabG，并發(fā)現(xiàn)基因wabG敲除對(duì)菌體生長(zhǎng)并沒有影響，但重組菌喪失了合成外核脂多糖以及莢膜的能力，顯著地降低了菌體的毒性。Huynh等[36]敲除了 K. pneumoniae KCTC 2242中編碼1類菌毛亞基蛋白的fimA基因和編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶的wabG基因。構(gòu)建而成的重組菌不能合成外核脂多糖，也沒有菌毛，但菌體的生長(zhǎng)以及其生產(chǎn) 2,3-BD的能力并沒有受到影響。Kim等[37]以一株wabG基因缺失的K. pneumoniae SGSB100為基礎(chǔ)，通過敲除ldhA與過表達(dá)ALDC編碼基因budA、ALS編碼基因budB相結(jié)合的方法促進(jìn)了微酸條件 (pH 5.5) 下葡萄糖與2,3-BD的有效轉(zhuǎn)化，與原始菌相比，重組菌2,3-BD的產(chǎn)量提高了40%。從基因水平上消除或者弱化致病菌的毒性能極大地拓寬這些菌株的工業(yè)應(yīng)用范圍，成為了一種構(gòu)建基因工程菌的新的思路。

到目前為止，以敲除旁路基因的手段提高2,3-BD產(chǎn)量的研究成果匯總于表3。

表3　基因敲除改造2,3-丁二醇天然生產(chǎn)菌株及研究水平Table 3 Metabolic engineering for 2,3-butanediol overproduction by knocking out genes

2.1.3 輔因子代謝與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控 以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物轉(zhuǎn)化過程常包含大量復(fù)雜的反應(yīng)且需要特異性輔因子的參與[39-40]，其中輔因子的供給不足又常常是影響生物轉(zhuǎn)化的限制因素。因此，氧化還原輔因子代謝工程成為優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化的重要代謝工程策略。Fu等[12]為了獲得更多的NADH，在B. subtilis中表達(dá)了一種由udhA基因編碼的轉(zhuǎn)氫酶，同時(shí)通過低溶氧控制以及加入還原性物質(zhì)等手段，最終重組菌發(fā)酵生產(chǎn)了49.29 g·L-1的(R, R)-2,3-BD。Yang 等[41]在B. subtilis中過表達(dá)了甲酸脫氫酶編碼基因fdh并敲除了NADH氧化酶YodC的編碼基因，構(gòu)建而成的重組菌的2,3-BD濃度提高了19.9%，乙偶姻的濃度下降了71.9%。隨后他們又利用插入失活的方法敲除了ldhA，提高了2,3-BD產(chǎn)量的同時(shí)降低了副產(chǎn)物乙偶姻和乳酸的濃度。Zhang等[42]在多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) ZJ-9中外源表達(dá)了一個(gè)來自博伊丁氏假絲酵母 (Candida boidinii) 的 NAD+依賴型甲酸脫氫酶 (FDH) 編碼基因，顯著提高了胞內(nèi)NADH/NAD+的比例。在批次以及補(bǔ)料發(fā)酵中，與原始菌相比2,3-BD的產(chǎn)量分別提高了10.2%和8.0%。Yang等[14]在解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 中共表達(dá)了NAD+-依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH) 和NADH-依賴型2,3-BDH，節(jié)省了發(fā)酵時(shí)間且2,3-BD產(chǎn)量提高了22.7%，而乙偶姻、乳酸和丁二酸的產(chǎn)量分別下降了80.8%，33.3%和39.5%，原因是因?yàn)镚APDH的過表達(dá)增加了NADH的供應(yīng)。在補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，45 h獲得了2,3-BD 132.9 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到了 2.95 g·L-1·h-1。這是首次在 B. amyloliquefaciens中進(jìn)行基因改造的報(bào)道。Geckil 等[43-44]和Jeong等[45]分別報(bào)道了含有來自透明顫菌(Vitreoscilla) 血紅蛋白基因 (vgb) 的 E. aerogenes 和K. oxytoca在代謝流分配上的改變，發(fā)現(xiàn)vgb基因在低溶氧水平下的表達(dá)產(chǎn)物透明顫菌血紅蛋白(VHb) 能夠有效提高E. aerogenes和K. oxytoca的2,3-BD的產(chǎn)量。推測(cè)是由于VHb能夠有效改善發(fā)酵過程的溶氧水平，從而影響葡萄糖的分解代謝，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NAD+/NADH和ADP/ATP的比率實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖代謝途徑中碳代謝流的合理分配。

傳統(tǒng)的育種方法主要通過對(duì)單一基因的消除或過度表達(dá)進(jìn)行修飾，但由于生物細(xì)胞中代謝途徑的高度復(fù)雜性，目的表型往往在整體水平上達(dá)不到較高的表達(dá)。全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控 (global transcription machinery engineering, gTME)[46]是從整體水平改變細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄，獲得有益細(xì)胞表型的一種全新的定向進(jìn)化方法，能對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)性能全局強(qiáng)化，是在基因和細(xì)胞水平上改造微生物細(xì)胞的新途徑。近年來，來源于 LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AlsR對(duì)2,3-BD生產(chǎn)的影響引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的注意。AlsR由budR/alsR編碼，與2,3-BD合成操縱子反向轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)受其自身的副調(diào)控，且受一些外部刺激物如群體感應(yīng)信號(hào)分子、乙酸和厭氧環(huán)境的誘導(dǎo)[47]。Zhang等[48]發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)度適中的啟動(dòng)子PbudA來控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白ALsR的表達(dá)能顯著提高 2,3-BD前體物質(zhì)乙偶姻的積累。有研究表明，AlsR是通過結(jié)合到B. subtilis alsS基因啟動(dòng)子前的特定位點(diǎn)來直接刺激alsSD操縱子的轉(zhuǎn)錄，但它對(duì)bdhA基因表達(dá)的影響卻是未知的。Oliveira等[19]構(gòu)建了一株 alsR::spc缺失的 B. subtilis，通過測(cè)量budA-lacZ轉(zhuǎn)錄融合的表達(dá)、budA基因mRNA的穩(wěn)態(tài)水平以及2,3-BDH的酶活水平來研究AlsR對(duì)bdhA基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，突變菌中budA基因的表達(dá)出現(xiàn)在穩(wěn)定期前期，表達(dá)水平雖然降低了但卻并沒有消失。通過電泳遷移率變化分析，純化的AlsR蛋白并沒有結(jié)合到budA基因的啟動(dòng)子區(qū)域，說明budA基因的表達(dá)是間接受到AlsR的調(diào)控的。Lee等[18]通過構(gòu)建AlsR編碼基因alsR過表達(dá)型 (SGSB101) 和 alsR缺陷型 (SGSB102) K. pneumoniae，從轉(zhuǎn)錄水平考察了alsR基因、2,3-BD生物合成相關(guān)基因 (budB, budA, budC) 和酸生物合成相關(guān)基因（ldhA，乙酸激酶編碼基因 ack）在發(fā)酵過程中的變化。通過觀察發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)期，過表達(dá) alsR基因的菌株其轉(zhuǎn)錄水平提高了 8倍，2,3-BD的產(chǎn)量提高了2倍。在敲除alsR基因的菌株中并沒有檢測(cè)到alsR轉(zhuǎn)錄，而且其酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平下降至1/70。

而輔因子與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控相結(jié)合的改造手段也成為了提高2,3-BD產(chǎn)量的一種行之有效的方法。Yang等[49]為提高B. amyloliquefaciens中2,3-BD的產(chǎn)量采用了3種策略，首先通過過表達(dá)甘油脫氫酶和2,3-BDH建立了一個(gè)NADH/NAD+再生系統(tǒng)，提高2,3-BD產(chǎn)量的同時(shí)減少了副產(chǎn)物的積累；其次選擇了一個(gè)強(qiáng)度適中的啟動(dòng)子 PbudA來控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白ALsR的表達(dá)，提高了流向2,3-BD支路的通量；最后通過一個(gè)3階段的溶氧控制策略以及一個(gè)2階段的 pH控制策略，最終生產(chǎn)出了 2,3-BD 102.3 g·L-1，產(chǎn)率為 0.44 g·g-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為 1.16 g·L-1·h-1。

到目前為止，以輔因子代謝與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控手段提高2,3-BD產(chǎn)量的研究成果匯總于表4。

表4　2,3-丁二醇天然生產(chǎn)菌株的輔因子代謝改造及研究水平Table 4 Cofactor engineering for 2,3-butanediol overproduction

2.2 利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建2,3-丁二醇人工代謝途徑

代謝工程改造微生物具有從簡(jiǎn)單易得以及廉價(jià)的原材料中生產(chǎn)大量化學(xué)物質(zhì)的潛力[50]。但單純的對(duì)原始菌株的改造已經(jīng)不能滿足這一需求，因此研究的重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向了通過在基因工程菌中表達(dá)外源基因來構(gòu)建宿主細(xì)胞原本并不存在的代謝途徑，進(jìn)而生物合成出所需要的目標(biāo)產(chǎn)物。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以方便地設(shè)計(jì)和利用非天然的微生物進(jìn)行 2,3-BD的生產(chǎn)，且在不能天然合成2,3-BD的菌株體內(nèi)構(gòu)建人工途徑，一般是以合成單一手性構(gòu)型的2,3-BD為目標(biāo)的。利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建的具有詳細(xì)生物學(xué)特征的生物學(xué)元件來構(gòu)建代謝途徑具有更好的可預(yù)測(cè)性，能夠提高代謝工程改造的效率，同時(shí)也可以為構(gòu)建復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)提供技術(shù)支持。

2.2.1 以大腸桿菌為宿主 隨著對(duì) 2,3-BD生物合成研究的不斷深入以及代謝工程與合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，在對(duì)2,3-BD代謝途徑逐漸清晰的情況下，為了適應(yīng)不同的發(fā)酵生產(chǎn)條件，利用合成生物學(xué)方法在模式菌株中構(gòu)建新的2,3-BD合成途徑，對(duì)代謝途徑進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和合理改造成為最近研究的熱點(diǎn)。大腸桿菌 (Escherichia coli) 由于具有生長(zhǎng)速度快、代謝途徑和代謝機(jī)制較清楚及遺傳操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為最常用的代謝工程改造的宿主菌[1,51]，早在20世紀(jì)90年代，便有利用重組E. coli生產(chǎn)2,3-BD的報(bào)道[52]。到目前為止，以E. coli為宿主合成不同構(gòu)型2,3-BD的研究成果匯總于表5。

表5　大腸桿菌中2,3-丁二醇的研究水平Table 5 Biotechnological production of 2,3-butanediol using genetically engineered E. coli

Xu等[59]根據(jù)系統(tǒng)代謝工程的理念，從 B. subtilis、B. licheniformis、K. pneumoniae、S. marcescens和E. cloacae中克隆了2,3-BD生物合成的關(guān)鍵酶編碼基因，分別以它們構(gòu)建E. coli基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵測(cè)試，從中篩選產(chǎn)物產(chǎn)量最高的組合（來自E. cloacae），再通過對(duì)該基因組合進(jìn)行不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的優(yōu)化，篩選得到其中產(chǎn)量最高的重組菌E. coli BL21/pET-RABC。該重組菌顯示出優(yōu)異的目標(biāo)產(chǎn)物合成能力，經(jīng)過一系列的條件優(yōu)化，最終在批次發(fā)酵中獲得24.6 g·L-1的meso-2,3-BD，補(bǔ)料發(fā)酵中獲得73.8 g·L-1的meso-2,3-BD。Ji等[55]將來自于K. pneumoniae CICC 10011的budB、budA基因和來自于B. subtilis 168的(R, R)-2,3-BDH編碼基因ydjL克隆到E. coli MG1655中，構(gòu)建得到單一生產(chǎn)(R, R)-2,3-BD的工程菌，經(jīng)一系列發(fā)酵條件優(yōu)化，最終工程菌在補(bǔ)料發(fā)酵階段(R, R)-2,3-BD的最高產(chǎn)量達(dá)到115 g·L-1，對(duì)映體純度大于99%。這是到目前為止以 E. coli為宿主異源合成(R, R)-2,3-BD研究中所獲得的最高產(chǎn)量。隨后，Tong 等[1]在此基礎(chǔ)上通過對(duì)重組菌進(jìn)行啟動(dòng)子優(yōu)化以及過表達(dá)關(guān)鍵酶基因等手段，使副產(chǎn)物乙偶姻的含量減少了20%。Li等[51]敲除了E. coli JM109菌株中混合酸途徑副產(chǎn)物合成的相關(guān)基因 ldhA、pta（編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶）、adhE（編碼乙醛脫氫酶及乙醇脫氫酶）、poxB（編碼丙酮酸氧化酶），并在此基礎(chǔ)上利用組成型啟動(dòng)子在E. coli中構(gòu)建了一條適合在低溶氧條件下生產(chǎn)meso-2,3-BD的新途徑。當(dāng)溶氧降至 1%時(shí)，工程菌雖然生長(zhǎng)緩慢卻仍表現(xiàn)出較高的2,3-BD 得率，52 h發(fā)酵得到 meso-2,3-BD 13.0 g·L-1，相對(duì)于葡萄糖的得率達(dá)0.43 g·g-1，可以視作高純度立體構(gòu)型meso-2,3-BD工業(yè)化生產(chǎn)的一種新思路。目前生物制造(S,S)-2,3-BD大多采用的是生物催化或手性拆分的方法，底物多為乙偶姻、雙乙?；?,3-BD的混旋物[5]，因此構(gòu)建以葡萄糖等碳源為底物的完整的(S, S)-2,3-BD生物合成途徑成為了科學(xué)家們努力的目標(biāo)。Chu等[56]在E. coli中過表達(dá)了來自于E. cloacae subsp. dissolvens SDM的ALS編碼基因和meso-2,3-BDH編碼基因，利用雙乙酰自發(fā)的非酶氧化脫羧過程成功構(gòu)建了(S, S)-2,3-BD的代謝通路。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，得到了2.2 g·L-1的(S, S)-2,3-BD，對(duì)映體純度達(dá)95%。這是第一次在模式菌株中以葡萄糖為碳源合成高純度(S, S)-2,3-BD的報(bào)道。

影響胞內(nèi)代謝生產(chǎn)的主要原因有胞內(nèi)生產(chǎn)強(qiáng)度低、副產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)代謝流、代謝物或中間產(chǎn)物的積累會(huì)造成細(xì)胞毒害以及由于細(xì)胞膜的阻隔研究人員不能直接地監(jiān)控代謝物等，這些因素限制了胞內(nèi)代謝產(chǎn)量的進(jìn)一步提高[62]。針對(duì)胞內(nèi)代謝的缺陷，利用合成生物學(xué)的手段，無細(xì)胞代謝工程作為一種通過在體外實(shí)現(xiàn)催化蛋白的集合從而高效生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。然而，高昂的輔因子和催化劑價(jià)格、輔因子和能量再生的限制以及較低的生產(chǎn)強(qiáng)度則阻礙了無細(xì)胞代謝工程的發(fā)展[63]。為了解決這一問題，Kay等[62]設(shè)計(jì)了一個(gè)從粗溶菌產(chǎn)物或細(xì)胞提取物中得到含有全部催化蛋白的無細(xì)胞系統(tǒng)來給高度活躍的外源途徑提供能量。Kay等構(gòu)建了一株E. coli基因工程菌來表達(dá)合成meso-2,3-BD所需的3種關(guān)鍵酶。隨后他們證明了這株菌的溶菌產(chǎn)物在添加了葡萄糖以及僅催化量的輔因子NAD+和ATP之后，能夠生產(chǎn)2,3-BD。在未經(jīng)優(yōu)化的情況下，批次發(fā)酵meso-2,3-BD的生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)11.3 g·L-1·h-1，對(duì)葡萄糖的得率為0.36 g·g-1，為理論得率的71%。在30 h的補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，meso-2,3-BD的產(chǎn)量為82 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.7 g·L-1·h-1。結(jié)果證明了在無細(xì)胞溶菌產(chǎn)物中強(qiáng)大的輔因子再生能力，并指出當(dāng)生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度或細(xì)胞毒性阻礙了全細(xì)胞發(fā)酵時(shí)，可以通過溶菌產(chǎn)物來加快原型代謝途徑，實(shí)現(xiàn)分子轉(zhuǎn)換。該方法可以視作2,3-BD高濃度生產(chǎn)的一種新思路。

隨著對(duì)生物制造2,3-BD研究的日益深入，在設(shè)法提高產(chǎn)量和產(chǎn)率的同時(shí)，其制造過程中的經(jīng)濟(jì)性也逐漸成為關(guān)注與研究的焦點(diǎn)。為此，除了將合成生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用至2,3-BD途徑構(gòu)建之外，研究人員還試圖開發(fā)一種廉價(jià)的碳水化合物材料來替代葡萄糖，并經(jīng)過改造和優(yōu)化提高菌體對(duì)這些原料的利用率。Shen等[54]在E. coli BW25113中表達(dá)了來自B. subtilis的 ALS和 ALDC，以及來自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii) 的次級(jí)醇脫氫酶ADH，在E. coli中構(gòu)建了(R,R)-2,3-BD的人工合成途徑，并嘗試以甘油作為重組菌發(fā)酵的底物。該工程菌株以甘油為底物發(fā)酵時(shí)，(R,R)-2,3-BD的產(chǎn)量為 3.54 g·L-1。進(jìn)一步敲除副產(chǎn)物乙酸合成途徑的關(guān)鍵酶基因，(R,R)-2,3-BD的產(chǎn)量提高到了9.45 g·L-1，相對(duì)于甘油的轉(zhuǎn)化率為0.33 g·(g甘油)-1，達(dá)到了理論轉(zhuǎn)化率的68%。Shin等[61]將2,3-BD合成途徑的引入與宿主菌副產(chǎn)物相關(guān)基因的敲除相結(jié)合，構(gòu)建出一株專一生產(chǎn)meso-2,3-BD的E. coli基因工程菌，同時(shí)在該重組菌胞質(zhì)中過表達(dá)來自Saccharophagus degradans的纖維素 3-糊精酶編碼基因，使之能夠以纖維素和半纖維素的部分水解產(chǎn)物纖維糊精為底物發(fā)酵生產(chǎn) meso-2,3-BD。在發(fā)酵階段，最終生成了meso-2,3-BD 5.5 g·L-1，乙偶姻2.7 g·L-1。這兩種產(chǎn)物相對(duì)于纖維素糊精的總得率達(dá)0.8 g·g-1。海洋藻類生物由于其極快的生長(zhǎng)速度、極大的生物量而成為生物燃料生產(chǎn)的一種潛在的能源。由于體內(nèi)缺少木質(zhì)素，它們并不需要經(jīng)過嚴(yán)格的前處理過程，因此與其他的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)相比，海藻預(yù)處理過程的成本將要低許多。Mazumdar等[57]通過副產(chǎn)物基因敲除與2,3-BD合成通路整合等方法構(gòu)建了一株能利用海藻水解液來發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD的重組E. coli，發(fā)酵中生成的2,3-BD與乙偶姻的總量為19 g·L-1，產(chǎn)率為0.43 g·g-1。這是第一次以海藻水解液發(fā)酵合成2,3-BD的報(bào)道。

2.2.2 以釀酒酵母為宿主 目前，高產(chǎn)2,3-BD的菌株，如K. pneumoniae，K. oxytoca，E. aerogens，S. marcescens等大多都是條件致病菌，而大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的安全性原則在很大程度上限制了這些菌株的應(yīng)用。作為一種安全的微生物 (GRAS)[64]，釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 逐漸成為 2,3-BD生產(chǎn)的研究重點(diǎn)。在S. cerevisiae體內(nèi)，糖酵解過程中產(chǎn)生的丙酮酸可以通過兩條途徑轉(zhuǎn)換成2,3-BD[65-67]。一條途徑是丙酮酸在ALS的催化作用下經(jīng)過脫羧反應(yīng)形成α-乙酰乳酸。在無氧條件下，α-乙酰乳酸在ALDC的催化下轉(zhuǎn)化成乙偶姻。而當(dāng)有O2存在時(shí)，α-乙酰乳酸會(huì)自發(fā)脫羧形成雙乙酰，雙乙酰在雙乙酰還原酶 (DAR，又稱乙偶姻脫氫酶)的作用下轉(zhuǎn)變成乙偶姻。另一條途徑是丙酮酸在丙酮酸脫羧酶 (PDC) 的催化下轉(zhuǎn)化成乙醛，乙醛在PDC的催化下通過縮合反應(yīng)轉(zhuǎn)化成乙偶姻。最后，乙偶姻在2,3-BDH的作用下生成2,3-BD。但是，野生型的S. cerevisiae僅能生產(chǎn)微量的2,3-BD (0.4～2.0 g·L-1)[68]，因此，更多的是嘗試?yán)么x工程以及合成生物學(xué)的手段構(gòu)建含有外源 2,3-BD生產(chǎn)途徑的S. cerevisiae基因工程菌。

因?yàn)镾. cerevisiae在發(fā)酵時(shí)有著很強(qiáng)的積累乙醇的傾向，因此減少乙醇的生產(chǎn)并將代謝流轉(zhuǎn)向2,3-BD對(duì)2,3-BD的生產(chǎn)至關(guān)重要。在S. cerevisiae中，丙酮酸在PDC的作用下經(jīng)脫羧反應(yīng)生成乙醛，乙醛再在乙醇脫氫酶 (ADH) 的作用下還原生成乙醇。由于乙醇途徑和2,3-BD途徑有著共同的中間代謝物，兩者存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，因此敲除ADH和PDC編碼基因會(huì)使菌株生產(chǎn)乙醇的能力大大減弱，PDC的缺乏乃至消失會(huì)使得中間產(chǎn)物丙酮酸大量積累，從而最大限度地提高2,3-BD的產(chǎn)量。Ng等[69]敲除了S. cerevisiae中編碼乙醇脫氫酶ADH1、ADH3和ADH5的3個(gè)基因，在微氧條件下，2,3-BD的產(chǎn)量提高了55倍。雖然重組菌與原始菌相比顯著提高了產(chǎn)量，但2,3-BD的總體發(fā)酵水平還是不如常見的細(xì)菌，只有2.29 g·L-1。2013年，Kim等[22]通過構(gòu)建PDC缺陷型 (pdc-) 菌株來進(jìn)行葡萄糖的快速轉(zhuǎn)化，并且使得副產(chǎn)物乙醇得到抑制。通過將 B. subtilis 2,3-BD合成途徑的alsS 和alsD基因?qū)雙dc-S. cerevisiae并過表達(dá)內(nèi)源2,3-BDH的方法，在最優(yōu)通氣條件下分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到96.2 g·L-1。除了葡萄糖，纖維素糖類也能被用來生產(chǎn) 2,3-BD。Nan等[70]在一個(gè) pdc-的 S. cerevisiae中過表達(dá)了來自B. subtilis的alsS、alsD基因，并引入了一條纖維二糖利用途徑，使得重組菌能在微氧條件下以纖維二糖為底物合成2,3-BD。Kim等[71]以一株pdc-菌株 (SOS4) 為宿主，導(dǎo)入來自木糖發(fā)酵酵母的編碼木糖同化酶的XYL1、XYL2 和XYL3基因，使得菌株得以消耗木糖，并以此將碳流向從乙醇轉(zhuǎn)向了 2,3-BD。通過發(fā)酵補(bǔ)料，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到43.6 g·L-1，(R, R)-2,3-BD對(duì)映體純度達(dá)到 97%。這些結(jié)果表明，工程化的 S. cerevisiae菌株可以成為高效利用可再生資源生產(chǎn)2,3-BD的最適宿主菌株。

但是，生產(chǎn)2,3-BD的pdc-菌株卻有著嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷問題。在酵母體內(nèi)，乙醇發(fā)酵的主要功能就是再氧化糖酵解過程中產(chǎn)生的NADH，而乙醇途徑的敲除會(huì)導(dǎo)致pdc-菌株體內(nèi)NADH的大量積累，使得菌體內(nèi)氧化還原失衡，從而阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)[72]。除此之外，由于生成一分子的甘油就能氧化一分子的NADH，因此在微氧條件下，為了維持菌體內(nèi)的氧化還原平衡，生產(chǎn)2,3-BD的pdc-菌株通常伴隨著大量甘油的生成。Kim 等[64]在 pdc-的 S. cerevisiae SOS2的基礎(chǔ)上構(gòu)建了 5株有著不同 L. lactis NADH氧化酶表達(dá)強(qiáng)度的重組菌。NADH氧化酶的表達(dá)有效地降低了胞內(nèi) NADH/NAD+的比例。與原始菌相比，重組菌2,3-BD對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率提高了 23.8%，而甘油對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率則下降了65.3%，說明通過表達(dá) NADH 氧化酶能改變NADH/NAD+的比例從而達(dá)到將流向甘油的代謝流引向2,3-BD的目的。在以上研究的基礎(chǔ)上，Kim等[73]在酵母中過表達(dá)了來自B. subtilis的ALS、ALDC編碼基因以及內(nèi)源的2,3-BDH編碼基因并敲除了與副產(chǎn)物乙醇、甘油生產(chǎn)相關(guān)的 5種乙醇脫氫酶（ADH1～ADH5）編碼基因和2種甘油-3-磷酸鹽脫氫酶（GPD1和 GPD2）編碼基因。在隨后的補(bǔ)料發(fā)酵中，重組菌 2,3-BD的產(chǎn)量最高可達(dá) 72.9 g·L-1，對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率為0.41 g·g-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.43 g·L-1·h-1。除此之外，由于葡萄糖會(huì)抑制pdc-菌株的呼吸作用導(dǎo)致其體內(nèi)氧化還原失衡，因此pdc-菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)[74]，而且 pdc-菌株在生長(zhǎng)過程中強(qiáng)烈依賴 C2物質(zhì)（乙酸或乙醇）來合成生長(zhǎng)所需的乙酰輔酶A。這些缺陷極大地限制了pdc-菌株的應(yīng)用。有研究表明，MTH1基因編碼序列的內(nèi)部敲除會(huì)使pdc-菌株重新獲得攝取葡萄糖的能力[75-76]。MTH1是一種能夠阻礙己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 (HXTs) 表達(dá)的葡萄糖敏感型轉(zhuǎn)錄因子。這種內(nèi)部敲除能通過移除與蛋白降解相關(guān)的位點(diǎn)來增加MTH1的穩(wěn)定性[75]，維持胞內(nèi)葡萄糖濃度至一個(gè)很低的水平并因此緩解葡萄糖的抑制。Lian等[21]選擇S. cerevisiae作為宿主，通過敲除 PDC5-PDC6-PDC1編碼基因使得從乙醇到2,3-BD的代謝流得到重新構(gòu)建，但是得到的重組菌并不能在己糖作為單一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。為了解決這一問題，他們通過過表達(dá)內(nèi)部敲除的轉(zhuǎn)錄因子MTH1以及適應(yīng)性進(jìn)化等改造手段，成功地獲得了一株能同時(shí)利用葡萄糖和半乳糖的工程酵母。隨后(R, R)-2,3-BD生物合成途徑的引入賦予了該菌株高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力，在以葡萄糖和半乳糖混合物為底物的補(bǔ)料發(fā)酵中，該重組酵母生產(chǎn)(R, R)-2,3-BD高達(dá)100 g·L-1以上。這是目前報(bào)道在S. cerevisiae中2,3-BD合成的最高產(chǎn)量，但仍然存在著發(fā)酵周期太長(zhǎng) (300 h) 的問題。

除了常規(guī)的利用質(zhì)粒作為載體表達(dá)外源基因外，染色體由于其能自主復(fù)制、能確保外源基因在細(xì)胞世代中保持穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，具有質(zhì)粒表達(dá)不可比擬的優(yōu)勢(shì)。Shi等[77]發(fā)明了一種一步高效無痕多拷貝的染色體整合技術(shù) (Di-CRISPR)，通過這種技術(shù)，成功地將一個(gè)18拷貝的、全長(zhǎng)24 kb的木糖利用以及(R, R)-2,3-BD合成途徑一步整合至S. cerevisiae染色體，獲得了一株能以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)(R, R)-2,3-BD的菌株，第一次實(shí)現(xiàn)了2,3-BD途徑在S. cerevisiae染色體上的表達(dá)。雖然這種方法生產(chǎn)的2,3-BD產(chǎn)量并不高，但為構(gòu)建一株穩(wěn)定表達(dá)外源 2,3-BD合成途徑的酵母工程菌提供了新的思路。

2.2.3 以藍(lán)細(xì)菌為宿主 自從工業(yè)革命開始以來，人類大量使用化石燃料，這些過程把原本以有機(jī)碳形式存在的碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳并排放到空氣中，從而造成資源的浪費(fèi)以及環(huán)境問題的加劇。根據(jù)美國(guó)國(guó)家海洋和大氣管理局 (NOAA) 發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年3月全球大氣中的二氧化碳月平均濃度已經(jīng)突破了全球變暖危險(xiǎn)標(biāo)志的400 μl·L-1關(guān)口。藍(lán)藻能夠通過光合作用直接將空氣中的CO2轉(zhuǎn)換為有機(jī)碳，既實(shí)現(xiàn)了資源的再利用，又緩解了日益嚴(yán)重的溫室效應(yīng)問題，并且由于其能在高鹽和高溫環(huán)境生長(zhǎng)的特性也避免了其與陸地上的糧食作物競(jìng)爭(zhēng)水源以及土地。但是除了高效的CO2固定能力，藍(lán)藻并不能自發(fā)地積累有用的化學(xué)原料[78]，而合成生物學(xué)的應(yīng)用賦予了其生產(chǎn)人類所需化學(xué)品的能力[79-84]。

Oliver等[85]以細(xì)長(zhǎng)聚球藻 (Synechococcus elongatus) PCC7942為宿主，在藍(lán)藻中構(gòu)建了2,3-BD的生物合成途徑。選取B. subtilis的alsS基因，并在重組菌中分別表達(dá)了6種來自不同菌株的alsD基因，以及4種sADH基因。最終，含有alsS (B. subtilis)，alsD（嗜水氣單胞菌，Aeromonas hydrophila），adh (C. beijerinckii) 的重組菌表現(xiàn)了最佳的2,3-BD生產(chǎn)性能。利用CO2和光源為能源，生產(chǎn)得到的2,3-BD產(chǎn)量達(dá)到2.38 g·L-1。在之前工作的基礎(chǔ)上，Oliver等[86]為了克服S. elongatus PCC7922中報(bào)告蛋白表達(dá)水平與生產(chǎn)所需蛋白表達(dá)水平的不一致，通過一個(gè)組合方法證明調(diào)節(jié)5′非翻譯區(qū)可以產(chǎn)生一系列不同強(qiáng)度的蛋白質(zhì)表達(dá)，克服了菌株中蛋白表達(dá)水平的不可預(yù)見性。

Savakis等[87]在集胞藻 (Synechocystis sp.) PCC6803中異源表達(dá)了來自乳酸菌和腸桿菌的ALS、ALDC和2,3-BDH編碼基因。無論是質(zhì)?；蚴侨旧w表達(dá)這條人工構(gòu)建的2,3-BD代謝途徑，都可以在發(fā)酵液中檢測(cè)到高達(dá)0.72 g·L-1(相當(dāng)于8 mmol·L-1) 的四碳化合物，其中2,3-BD的濃度達(dá)0.43 g·L-1(相當(dāng)于 4.7 mmol·L-1)，成功實(shí)現(xiàn)了2,3-BD代謝途徑在Synechocystis sp. PCC6803中的構(gòu)建與組裝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在限制二氧化碳供應(yīng)的條件下，Synechocystis sp.能內(nèi)源合成大量的ALS。而共表達(dá)一種可溶性轉(zhuǎn)氫酶或者一種NADPH依賴型2,3-BDH能有效促進(jìn)乙偶姻與2,3-BD的轉(zhuǎn)化，從而生產(chǎn)出高純度的meso-2,3-BD。

雖然目前藍(lán)藻發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-BD的產(chǎn)量均比較低，但是國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的成果實(shí)現(xiàn)了將零成本的無機(jī)化合物 CO2轉(zhuǎn)化為具有較高附加值的 2,3-BD的突破，并且符合目前社會(huì)廣泛提倡的發(fā)展綠色低碳經(jīng)濟(jì)的趨勢(shì)，所以該方法生產(chǎn)2,3-BD的前景不可估量。

3　總結(jié)與展望

步入 21世紀(jì)，社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展正面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，資源匱乏、能源緊缺和環(huán)境污染等現(xiàn)狀帶來的巨大壓力，迫使傳統(tǒng)的化工、材料和制藥等工業(yè)制造領(lǐng)域的生產(chǎn)技術(shù)必須發(fā)生根本性的變革。以石化路線為主的化學(xué)制造存在原料緊缺、易污染環(huán)境等諸多缺陷，迫使人們尋找更有利于未來發(fā)展的工業(yè)制造方式。作為一種重要的化工原料，同時(shí)又是潛在的平臺(tái)化合物，2,3-BD的應(yīng)用前景廣闊，因此近年來以其生物制造為主題的研究日益深入，并在菌種改良和底物優(yōu)化等方面取得了顯著成果。展望未來，應(yīng)著重從以下幾個(gè)方面開展后續(xù)的研究。

（1）在充分了解 2,3-BD生物合成途徑和副產(chǎn)物代謝途徑的基礎(chǔ)上，結(jié)合輔因子調(diào)控與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)，通過對(duì)野生菌株進(jìn)行基因改造來進(jìn)一步提高2,3-BD的產(chǎn)量。

（2）目前高產(chǎn) 2,3-BD 的發(fā)酵菌株如 K. pneumoniae、K. oxytoca、S. marcescens、E. cloacae等均為class 2致病菌株，這在將來的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中是非常不利的。如今，通過敲除 K. pneumoniae中致病因子相關(guān)基因來減輕或消除其致病性已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)，但還沒有其他致病菌的類似報(bào)道。因此，對(duì)其他致病菌進(jìn)行全基因組測(cè)序和注釋，可以幫助研究者從基因角度了解菌株致病的機(jī)制和原因，為安全菌株的構(gòu)建奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

（3）對(duì)于2,3-BD來說，雖然利用葡萄糖為底物發(fā)酵在產(chǎn)量、產(chǎn)率等方面均取得了較大的進(jìn)展，但由于葡萄糖價(jià)格昂貴，降低了規(guī)?；a(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。通過代謝工程以及合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步改造以提高菌株對(duì)工業(yè)廢棄物和非糧原料的利用效率是十分重要的。

（4）應(yīng)當(dāng)繼續(xù)利用先進(jìn)的合成生物學(xué)方法，例如人工合成基因線路技術(shù)、啟動(dòng)子工程技術(shù)以及基因組編輯技術(shù)等優(yōu)化異源2,3-BD的代謝途徑，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)代謝流的最佳分配，快速獲得遺傳物質(zhì)穩(wěn)定、發(fā)酵水平和光學(xué)純度提高的細(xì)胞工廠。

（5）需要深入優(yōu)化藍(lán)細(xì)菌作為新型宿主的研究，通過直接有效地利用CO2生產(chǎn)大宗化學(xué)品來實(shí)現(xiàn)能源的再生以及減緩溫室效應(yīng)。

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2016-02-26收到初稿，2016-04-23收到修改稿。

聯(lián)系人:紀(jì)曉俊。第一作者:童穎佳（1992—），女，博士研究生。

Received date: 2016-02-26.

中圖分類號(hào):O 622. 3; TQ 923

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0438—1157（2016）07—2656—16

DOI:10.11949/j.issn.0438-1157.20160209

基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CBA00800)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21376002，21476111)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA02A207)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

Corresponding author:JI Xiaojun, associate professor, xiaojunji@njtech. edu.cn supported by the National Basic Research Program of China (2011CBA00800), the National Natural Science Foundation of China (21376002, 21476111), the National High Technology Research and Development Program of China (2011AA02A207) and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Metabolic engineering for efficient microbial production of 2,3-butanediol

TONG Yingjia, WU Wenjia, PENG Hui, LIU Lugang, HUANG He, JI Xiaojun
(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China)

Abstract:2,3-butanediol (2,3-BD), which is considered as an important microbial metabolite, has been widely used in many fields such as food, medicine, chemical, and so on. Microbial 2,3-BD production has a history of more than 100 years, but the low efficiency of microbial 2,3-BD accumulation has constrained its process in biological manufacturing industrialization. Optimization of microbial metabolic pathway with the theory and method of metabolic engineering is expected to solve this problem. The objective of this paper is to review the state-of-the-art strain transformation and construction strategies in microbial synthesis of 2,3-BD, including overexpressing genes encoding for key enzymes in the 2,3-BD metabolic pathway, knocking out the metabolic bypass way genes, and using the methods of cofactor engineering in redesigning and reasonable transformation of the natural strains’ metabolic network. Besides that, the using of synthetic biology in constructing brand new 2,3-BD pathways in model strains, such as Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Cyanobacteria, in order to enhance the yield or chiral 2,3-BD production in microorganisms is also introduced in this review. Finally, the future research direction is prospected, and the guidelines to develop high-efficiency microbial cell factories byadvanced synthetic biology methods to achieve the optimal allocation of the intracellular metabolic flow are also proposed.

Key words:2,3-butanediol；metabolism；biochemical engineering；cofactors regulation；global transcription machinery engineering；synthetic biology