楊鋒 楊利學 李小群 李彥民

陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控骨的發(fā)育、修復的研究日益增多，業(yè)已證實神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、P 物質(zhì)(substance P， SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)、神經(jīng)肽Y (neuropeptide Y，NPY)與其受體構(gòu)成神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)介導了神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織間信號的傳導，影響著骨的各種代謝變化，但它們與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)關(guān)系以及補腎中藥調(diào)控機制的相關(guān)研究仍較少。左、右歸丸均出自《景岳全書》，是補腎陰和補腎陽的代表方劑。左歸丸由六味地黃丸化裁而成，去“三瀉”(澤瀉，茯苓，丹皮),加入枸杞、龜板膠、牛膝加強滋補腎陰之力；又加入鹿角膠、菟絲子溫潤之品補陽益陰，陽中求陰。右歸丸是將左歸丸去掉部分滋陰藥龜板膠和牛膝，再增加幾種辛溫補陽藥附子、杜仲、肉桂、當歸而成。即張介賓所謂：“善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭。善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮”之義。中醫(yī)在“腎主骨”理論指導下應(yīng)用左、右歸丸治療骨質(zhì)疏松癥取得了較好的療效。本文擬采用去卵巢方法誘導OP，分別觀察雌激素缺乏狀態(tài)下模型OP 大鼠骨組織及骨髓間充質(zhì)干細胞中神經(jīng)肽CGRP、SP、VIP、NPY及它們受體的分布與表達變化，并觀察左、右歸丸對神經(jīng)肽的干預作用，進一步闡明補腎中藥復方的整體調(diào)節(jié)機理。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇SPF級SD大鼠60只，雌性8月齡，體重200±20 g,購自西安交通大學動物實驗中心(陜動質(zhì)2013492)。DMEM(L) (Gibco,invitrogen,USA)、胎牛血清(FBS, Gibco, invitrogen, USA)、Total RNA 提取試劑盒(Promega)、RT-PCR Kit (invitrogen, USA)、mRNA引物(華大基因)、胰蛋白酶(Gibco,USA)、CO2孵箱(thermo, USA)

1.2 方法

1.2.1實驗動物的分組：動物稱重后隨機分組，將60 只大鼠隨機分為4 組，假手術(shù)組，模型組，左歸丸組、右歸丸組，每組15只。

1.2.2造模方法：模型組采用手術(shù)切除雙側(cè)卵巢的方法誘導OP 模型，稱重，麻醉后固定，術(shù)區(qū)消毒，取大鼠下腹部正中沿腹白線縱行切口約1 cm，打開腹腔，查找卵巢，結(jié)扎后切除兩側(cè)卵巢后縫合，假手術(shù)組開腹后切除少量脂肪保留卵巢。骨密度檢測：造模12 w應(yīng)用雙能X 線骨密度儀檢測大鼠的骨密度，3%戊巴比妥鈉麻醉，雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司制造, Discovery ASY-00409型)檢測，采用小動物骨密度分析軟件分析。測定的部位選擇腰椎、股骨近側(cè)干骺端。藥物干預12 w后用同樣方法測量各組骨密度。

1.2.3給藥方法：左歸丸組成：熟地黃24 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、龜甲膠12 g、山藥12 g、牛膝9 g。右歸丸處方組成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、當歸9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、山藥12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分別加水煎制，并根據(jù)“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”計算臨床等效劑量，左、右歸丸組每天兩次灌胃給藥，每次1 mL，連續(xù)灌胃12 w周治療。模型組和假手術(shù)組給予等量的蒸餾水。

1.2.4BMSCs的分離、培養(yǎng)：采用全骨髓培養(yǎng)法取SD大鼠骨髓沖洗液，第2代培養(yǎng)細胞進行流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示細胞均一性較好，其中CD34、CD45表達呈陰性,而CD90、CD105表達呈陽性，陽性率分別為93.136%和93.182%,提示培養(yǎng)所得細胞為主要是骨髓間質(zhì)干細胞(BMSCs)，非造血性細胞。用細胞計數(shù)板作有核細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5 ×104/mL,以備實驗之用。

1.2.5骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 表達量的檢測：取左側(cè)股骨近端相同部位的骨組織，稱重，研磨器液氮中勻漿，ELISA檢測CGRP、SP、VIP、NPY的表達量，采用免疫組化法觀察骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經(jīng)分布。

1.2.6BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY 受體mRNA 的表達檢測：采用realtime 熒光定量RT-PCR檢測，骨組織稱重，研磨器液氮中勻漿，TRIZOL法提取總RNA；根據(jù)GenBank 注冊的大鼠基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計CGRP、SP、VIP、NPY的熒光定量PCR 引物；提取的RNA濃度測定；引物的合成；逆轉(zhuǎn)錄；定量PCR 實驗。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the genes

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

模型組與假手術(shù)組比較, 有非常顯著性差異, 說明造模成功。左、右歸丸組與模型組比較有統(tǒng)計學差異，左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。說明補腎藥左歸丸和右歸丸可以提高去卵巢大鼠的骨密度，見表2。

ELISA測定各組大鼠骨組織中神經(jīng)肽CGRP、SP、VIP、NPY結(jié)果顯示，模型組大鼠神經(jīng)肽水平明顯下降，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學意義。左歸丸和右歸丸組神經(jīng)肽水平較模型組顯著上升，與模型組比較有統(tǒng)計學意義。左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。見表3。

表2 各組大鼠骨密度測定結(jié)果Table 2 Results of bone mineral density

注：與假手術(shù)組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

表3 各組大鼠神經(jīng)肽測定結(jié)果Table 3 Results of neuropeptides in each

注：與假手術(shù)組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經(jīng)分布明顯減少，左、右歸丸干預后CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經(jīng)分布與模型組比較顯著增加。見圖1、2、3、4。

模型組與假手術(shù)組比較, 有非常顯著性差異, 說明去卵巢模型大鼠神經(jīng)肽水平顯著下調(diào)。左、右歸丸組與模型組比較有統(tǒng)計學差異，左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。說明補腎藥左歸丸和右歸丸可以上調(diào)去卵巢大鼠的神經(jīng)肽基因表達水平。見表4。

表4 BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY mRNA 的表達Table 4 mRNA expression of CGRP, SP, VIP, and NPY in BMSCs

注：與假手術(shù)組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

圖1 骨細胞CGRP蛋白 ×200A 假手術(shù)組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D右歸丸組陽性表達Fig.1 Expression of CGRP protein,×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖2 SP蛋白表達 ×200A 假手術(shù)組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.2 Expression of SP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖3 VIP蛋白表達 ×200A 假手術(shù)組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.3 Expression of VIP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖4 NPY蛋白表達 ×200A 假手術(shù)組弱陽性表達； B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.4 Expression of NPY protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group,B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)對骨組織內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)是多層次、多元和復雜的, CGRP、SP、VIP、NPY作為骨代謝調(diào)節(jié)中重要的神經(jīng)肽及營養(yǎng)因子,在骨吸收和骨形成耦聯(lián)機制中發(fā)揮了極其重要的作用,特別是近年來對神經(jīng)源性骨質(zhì)疏松、神經(jīng)損傷后骨折愈合和異位骨化等深入研究，逐步認識到神經(jīng)化因素對骨代謝影響的重要性,并提出神經(jīng)-內(nèi)分泌-骨的軸線調(diào)節(jié)理論[1,2]。骨組織CGRP、SP、VIP、NPY的降低與骨質(zhì)疏松的形成存在著一定的聯(lián)系。神經(jīng)肽的減少可能導致其促進骨形成功能的減弱，進一步刺激骨質(zhì)疏松的形成，這可能是骨質(zhì)疏松形成的機制之一[3]。

中醫(yī)藥在“腎主骨”理論指導下應(yīng)用補腎藥物治療骨質(zhì)疏松癥取得了較好的療效。而隨著中醫(yī)腎本質(zhì)研究的不斷深入，已經(jīng)認識到腎虛與衰老具有相同的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)功能低下的特征, 而補腎藥可以恢復此網(wǎng)絡(luò)功能[5]。同時，更具創(chuàng)新性的研究表明腎所藏之精可相應(yīng)于胚胎干細胞及它分化為各種組織器官的成體干細胞。干細胞具有先天之精的屬性[6]。補腎藥對干細胞神經(jīng)肽基因表達的的調(diào)控更有助于對腎本質(zhì)的理解。左、右歸丸對腎虛證所取得的療效與其減輕下丘腦-垂體-靶腺的功能損害及修復其功能相關(guān)[7]。

基于以上研究成果，本研究選擇左、右歸丸來干預去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠，觀察補腎藥對神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)以及干細胞中神經(jīng)肽基因表達的影響，力圖更進一步探索“腎主骨”理論的科學內(nèi)涵。研究結(jié)果表明切除卵巢后大鼠骨組織以及骨髓間充質(zhì)干細胞中神經(jīng)肽水平與假手術(shù)組比較明顯下降，這表明神經(jīng)肽的缺乏是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的原因之一。我們在“腎主骨”理論指導下應(yīng)用補腎經(jīng)典名方左、右歸丸干預骨質(zhì)疏松癥模型，則干預后神經(jīng)肽水平顯著上升，但仍未達到假手術(shù)組的水平，左、右歸丸兩組之間神經(jīng)肽水平無明顯差異。證明了補腎中藥左、右歸丸可以作用于神經(jīng)內(nèi)分泌軸，從而調(diào)節(jié)骨代謝。無論滋腎陰還是補腎陽藥物均具有調(diào)控神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)的作用。大量研究也證實補腎藥物可以通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)骨代謝[8]。至于左歸丸和右歸丸調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織間信號傳導的通路有無不同，仍需進一步研究。補腎藥通過提高骨量、調(diào)節(jié)骨代謝等環(huán)節(jié)治療骨質(zhì)疏松癥的療效已得到證實，本研究結(jié)果初步證明補腎藥左歸丸、右歸丸可以提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的神經(jīng)肽水平，但其通過神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)調(diào)控骨代謝的機制仍需深入研究。