張瑩瑩 周建斌 趙鳳鳴 詹秀琴

南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，江蘇 南京 210023

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種因骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病(世界衛(wèi)生組織，WHO)[1]，是由于成骨細(xì)胞(OB)形成的新骨量少于被破骨細(xì)胞(OC)吸收的舊骨量，骨代謝從而發(fā)生負(fù)平衡，導(dǎo)致骨總量丟失所致。Runx2是骨發(fā)育過程中激活與啟動(dòng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向OB分化并調(diào)節(jié)OB成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，對膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化成骨均有控制作用，因此，其表達(dá)、活性下降與OP發(fā)病密切相關(guān)。miRNA是一類機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)的、長度在18到25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，這些僅占人類基因1%的miRNA分子，卻可控制人類三分之一以上基因的表達(dá)、修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。它能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的增殖[2]、分化[3]、凋亡[4]、發(fā)育[5]。miRNA的發(fā)現(xiàn)可能成為極有應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的靶標(biāo)。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，但其機(jī)制是否與細(xì)胞內(nèi)的Runx2和miRNA分子有關(guān)，且二者之間是否有關(guān)聯(lián)，是本文要研究的問題。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞：MC3T3-E1細(xì)胞購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫。

1.1.2藥物：葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國藥品生物制品檢定所，20 mg/支，純度為96.0%，性狀：白色粉末，干燥密封保存。

1.1.3試劑：α-MEM培養(yǎng)基(維森特生物技術(shù)有限公司，貨號：310010008)；含EDTA的25%胰蛋白酶(GIBCO,USA)；胎牛血清(GIBCO,USA)；miRNA逆轉(zhuǎn)試劑盒(Takara 036A)；Trizol(Invitrogen,USA)；Realtime PCR SYBR premix 2×(Takara RR420A,Japan)；目的基因一抗(rabbit Runx2)(Cell Signaling Technology)；內(nèi)參一抗(rabbit β-actin)(Cell Signaling Technology)；二抗(Anti-Rabbit IgG HRP)(Cell Signaling Technology)；Trizol(RNAiso for Small RNA)(Takara)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(VaZyMe 公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen,USA)；miRNA所有相關(guān)引物由上海生物工程有限公司合成；野生型Runx2 3’UTR/突變型Runx2 3’UTR重組質(zhì)粒、miRNA-204 mimics 及陰性對照由上海吉馬公司合成；miRNA-204擴(kuò)增采用莖環(huán)引物；Runx2和β-actinPCR擴(kuò)增引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.4主要儀器：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO,Japan)；相差倒置顯微鏡(Olympus，Japan)；光鏡(Motic)；低溫高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf, USA)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Agilent Technologies Mx3000P)；紫外分光光度計(jì)(BioDrop,USA)；凝膠成像儀(Bio-Rad,USA型號：GelDoc2000)；酶標(biāo)儀(BioTek,USA)；常溫mini 離心機(jī)(Eppendorf, USA)；6孔、24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測Runx2轉(zhuǎn)錄水平：按1×105密度在六孔板里接種MC3T3-E1細(xì)胞，用含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置葛根素處理組和空白對照組, 在葛根素組細(xì)胞中加入終濃度為0.01 mg/mL的葛根素，將兩組細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。使用Trizol法對細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取,用核酸蛋白分析儀測其濃度和純度。使用mRNA逆轉(zhuǎn)試劑盒(Takara 036A)逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系參考說明書。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA樣品2 μL, Realtime PCR SYBR premix 2× 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,Runx2 Forward：CGGACGAGGCAAGAGTTT CA，Reverse：GGATGAGGAATGCGCCCTAA，擴(kuò)增片段長度為192bp；β-actin Forward：GTGCTATGTTGC TCTAGACTTCG，Reverse:ATGCCACAGGATTCCATA CC，擴(kuò)增片段長度為174bp。 加蒸餾水補(bǔ)充至 25 μL。每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。PCR的反應(yīng)采用二步法：95℃、30 s預(yù)變性,(95℃，5 s; 60℃ 34 s,)×40個(gè)循環(huán)，做熔解曲線分析。

1.2.2Western blot檢測蛋白表達(dá)水平：按全蛋白抽提試劑盒說明書提取處理72h后的各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量，-20℃凍存。取各組樣本25 μg進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，放入少量封閉液，室溫下，搖床上封閉1 h。TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。按約0.1 mL/cm2的量加入一抗抗體和封閉液(1∶1000)，4℃過夜后，TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(二抗用封閉液稀釋1∶3000)，室溫下?lián)u蕩孵育1 h，TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。配制顯色液: 按0.1 mL/cm2顯影液計(jì)算用量，在正面加混勻的顯色液,放入凝膠成像儀中顯影，調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。

1.2.3microRNA表達(dá)譜檢測：利用microRNA表達(dá)譜檢測葛根素作用于成骨細(xì)胞72h后發(fā)生變化的可能靶向Runx2的miRNA(實(shí)驗(yàn)過程由康成生物公司完成)。

1.2.4軟件預(yù)測靶向Runx2的miRNA：采用miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB進(jìn)行預(yù)測，找出可能靶向Runx2的miRNA。同時(shí)，將軟件預(yù)測的miRNA與表達(dá)譜測定結(jié)果進(jìn)行比對，確定靶向Runx2的miRNA。

1.2.5PCR驗(yàn)證葛根素作用后靶向Runx2的miRNA變化：細(xì)胞培養(yǎng)方法及葛根素作用時(shí)間同前、miRNA用Trizol(RNAiso for Small RNA)提取，方法同普通RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系： 5×Reverse Transcription Mix 10.0 μL、Stem-loop 反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL、miRNA 500 ng、hiscript Enzyme Mix 2.0 μL、加 RNA free H2O至總體積 20 μL。反應(yīng)條件為：25℃，5 min；45℃，50 min；85℃，5 min；4℃，反應(yīng)結(jié)束后，將其放入-20℃保存。

引物序列：miRNA-204 RT Primer：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCAT,Reverse：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG；U6 RT Primer：AACGCTTCACGAATTTGCGT，F(xiàn)orward：CTCGCTTCGGCAGCACA，Reverse：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

Real-time PCR 檢測反應(yīng)體系條件方法同前。

1.2.6構(gòu)建重組質(zhì)粒：先合成不含有Runx2基因的空載體(載體序列結(jié)構(gòu)見圖)，將空載體(圖1)進(jìn)行單酶切，酶切位點(diǎn)是Xbal，酶切后分別插入野生型Runx2 3‘UTR和突變型Runx2 3’UTR，組合成重組質(zhì)粒。Runx2 WT 3’UTR序列為：ttctatgcacgtattgtacaaattgtgctttgtgccacaggtcatgatcgtggatgag tttactctgaacttcaaagggactatttgtattgtatgttgcaactgtaaattgaatt atttggcatttccccctctcatgattgtaatatt；Runx2 MT 3’UTR: ttctatgcacgtattgtacaaattgtgctttgtgccacaggtcatgatcgtggatga gtttactctgaacttcaaatccactatttgtattgtatgttgcaactgtaaattgaat tatttggcatttccccctctcatgattgtaatatt。

圖1 空載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of empty vector

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證靶基因：取對數(shù)生長期細(xì)胞MC3T3-E1，以每孔2×104細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板中，充分混勻，置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。當(dāng)融合度接近90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取1.5 mL EP管4個(gè)，均加入無血清雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(按50 μL/孔)和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(按1 μL/孔)，使其充分混勻，靜置5 min。向新的EP管中加入無血清雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(按50 μL/孔)和Runx2 3’UTR/突變型Runx2 3’UTR重組質(zhì)粒(100 ng/孔)、miRNA mimics/陰性對照NC(2 μM/孔)，并充分混勻，共分成四組，即Runx2 3’UTR+miRNA mimics、Runx2 3’UTR+miRNA NC、Runx2mut3’UTR+miRNA mimics、Runx2mut3’UTR+miRNA NC。將混有脂質(zhì)體的α-MEM培養(yǎng)液和上述四組α-MEM培養(yǎng)液分別相混合(100 μL/孔)，并充分混勻，室溫下靜置20 min，分別加到24孔培養(yǎng)板相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組中(每組設(shè)定三個(gè)復(fù)孔)，混勻放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

每孔用1×PBS輕柔洗滌1次，每孔加1×PLB(裂解液)，反復(fù)吹打，凍融3次，以充分裂解細(xì)胞。13000×g，4℃離心15 s，取上清。用熒光檢測儀中進(jìn)行測定，設(shè)置2 s的預(yù)測延遲和10 s的測定用時(shí)，在測量管中加入5 μL樣本充分混勻10 s，再加入100 μL Luciferase Reporter Assay Reagent II(LAR II,螢火蟲熒光素酶底物)測定螢火蟲熒光1，而后加入100 μLStop&Glo?substrate(海腎熒光素酶底物)測定海腎熒光2。以熒光1/熒光2的值作為相對熒光素酶活性。

1.2.8miRNA-204基因的過表達(dá)和干擾：在6孔培養(yǎng)板中每孔接種1×105細(xì)胞，充分混勻，置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，當(dāng)融合度接近90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取1.5 mL EP管4個(gè)，均加入無血清雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(按200 μL/孔)和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(按4μL/孔)，使其充分混勻，靜置5 min。向新的EP管中加入無血清雙抗的α-MEM培養(yǎng)液(按200 μL/孔)和miRNA mimics或miRNA inhibitor 或陰性對照NC(8 μM/孔)，并充分混勻，共分成3組，將混有脂質(zhì)體的α-MEM培養(yǎng)液和上述兩組α-MEM培養(yǎng)液分別相混合(400μL/孔)，并充分混勻，室溫下靜置20 min，分別加到6孔培養(yǎng)板相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組中，分別為加等量Lipofectamine 2000脂質(zhì)體孔，加入miRNA mimics組、miRNA inhibitor和陰性對照NC組，混勻放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 葛根素對成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響

葛根素作用72h后，Runx2 mRNA表達(dá)量與空白對照組比較具有顯著性差異，上升了1.47倍。見圖2。

圖2 葛根素作用前后Runx2 mRNA表達(dá)水平(*P<0.05)Fig.2 The mRNA expression level of Runx2 before and after the addition of puerarin

2.2 葛根素對成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Runx2蛋白表達(dá)水平的影響

同空白組相比,葛根素作用后Runx2的蛋白水平上升。見圖3。

圖3 葛根素作用前后Runx2 蛋白的比值Fig.3 The protein ratio of Runx2 before and after the addition of puerarin1. Puerarin group 2. Blank control group

2.3 靶向Runx2的miRNA預(yù)測結(jié)果

綜合利用TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB這四個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果顯示靶向Runx2的miRNA有miR-204、miR-128、miR-135b-5p、miR-3072-3p、miR-2861、miR-770-5p。microRNA表達(dá)譜檢測結(jié)果顯示miR-204、miR-3072-3p、miR-2861等119個(gè)microRNA葛根素作用前后發(fā)生變化。其中共同交集有miR-204、miR-3072-3p等4個(gè)，我們選擇miR-204作為研究對象驗(yàn)證靶基因預(yù)測的正確性。

序列(5’ TO 3’)mmu-miR-204 mimics：UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU；mmu-miR-204 Inhibitor：AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA；mmu-miR-204NC:GCGACGAUCUGCCUAAGAU。

2.4 葛根素作用后miRNA-204表達(dá)量的變化

熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(圖4)，葛根素作用后miRNA-204 在成骨細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于空白對照組，表達(dá)差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。初步說明了Runx2可能為miRNA-204的靶基因。

圖4 miRNA-204表達(dá)水平(*P<0.05)Fig.4 The expression level of miRNA-204

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因法結(jié)果

圖5 miRNA-204對Runx2 3’UTR表達(dá)的影響(*P<0.05) Fig.5 Effect of miRNA-204 on expression of Runx2 3’UTR

雙熒光素酶報(bào)告基因法結(jié)果顯示(圖5)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，只有Runx2 3’UTR+miRNA-204 mimics組熒光素蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，說明只有miRNA-204可抑制Runx2 3’UTR報(bào)告基因的表達(dá)，miRNA-204+Runx2mut3’UTR組、miRNA-204NC+Runx2 3’UTR組和miRNA-204NC+Runx2mut3’UTR組熒光素蛋白的表達(dá)水平均變化不顯著(P>0.05)，表明了Runx2 為miRNA-204的靶基因。

2.6 過表達(dá)或干擾miRNA-204對Runx2蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染試劑組Runx2蛋白表達(dá)水平有一定程度的下降(圖6)，說明轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞蛋白表達(dá)有一定的抑制作用。因此，miRNA-204對Runx2蛋白表達(dá)的影響，應(yīng)以轉(zhuǎn)染試劑組為比較對象。結(jié)果顯示：同轉(zhuǎn)染試劑組相比,miRNA-204過表達(dá)后Runx2的蛋白水平下降, miRNA-204干擾表達(dá)后Runx2的蛋白水平上升，且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步驗(yàn)證了Runx2 為miRNA-204的靶基因。

圖6 過表達(dá)或干擾miRNA-204后Runx2蛋白表達(dá)的水平(*P<0.5，**P<0.01)1轉(zhuǎn)染試劑組 2 NC對照組 3 miR-204mimics組 4 miR-204inhibitor組Fig.6 The protein level of Runx2 after overexpression or interference of miRNA-2041, Transfection reagent group; 2, NC control group; 3, miR-204mimics group; 4, miR-204inhibitor group

2.7 過表達(dá)或干擾miRNA-204對Runx2 mRNA表達(dá)的影響

與轉(zhuǎn)染試劑組相比,miRNA-204過表達(dá)以及干擾表達(dá)后Runx2 mRNA表達(dá)水平均沒有明顯差異，說明miRNA-204對Runx2 mRNA表達(dá)沒有明顯作用，不參與Runx2的轉(zhuǎn)錄過程，而參與翻譯調(diào)節(jié)。

圖7 過表達(dá)或干擾miRNA-204后Runx2 mRNA表達(dá)的水平Fig.7 The mRNA level of Runx2 after overexpression or interference of miRNA-204

3 討論

Runx2 的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的開始，它使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞只發(fā)育成成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞[6]，因此是骨形成過程中最早和最具特征性的標(biāo)志[7]，Runx2亦是骨發(fā)育過程中激活與啟動(dòng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子，它能上調(diào)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，對膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化成骨均有控制作用，參與正常骨骼發(fā)育的全過程，對防治骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。

miRNA是細(xì)胞內(nèi)的一類小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、發(fā)育。它的發(fā)現(xiàn)可能成為極有應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的靶標(biāo)。

前期研究發(fā)現(xiàn)葛根素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，對骨量保持具有正向意義從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的[8,9]。本實(shí)驗(yàn)表明，葛根素作用于成骨細(xì)胞后,能上調(diào)成骨細(xì)胞Runx2的表達(dá)，同時(shí)，miRNA表達(dá)譜也有很大的改變，推測葛根素對Runx2蛋白表達(dá)的影響可能與miRNA有關(guān)。

Wang等[10]體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-204負(fù)調(diào)節(jié)Runx2抑制成骨分化，從而抑制成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素，這些都是由BMP-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的。Huang等[11]也發(fā)現(xiàn)，miR-204作為重要的內(nèi)源性衰減器負(fù)調(diào)控Runx2，抑制間充質(zhì)祖細(xì)胞系和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中骨生成和促進(jìn)脂肪生成。說明Runx2可作為MiR-204的直接靶標(biāo)[12]。

我們的實(shí)驗(yàn)表明，miRNA表達(dá)譜和PCR結(jié)果都發(fā)現(xiàn)葛根素作用后miRNA-204表達(dá)下降，說明了Runx2和MiR-204的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-204能與Runx2的3 '非翻譯區(qū)特異性結(jié)合從而抑制其翻譯。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-204和Runx2之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了Runx2 3‘UTR和突變型Runx2 3’UTR的表達(dá)載體，采用熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)了Runx2是miRNA-204的靶基因，而且，過表達(dá)miRNA-204可使Runx2蛋白表達(dá)下降，干擾miRNA-204則使Runx2蛋白表達(dá)上升，這些結(jié)果都說明在成骨細(xì)胞中，miRNA-204直接抑制Runx2表達(dá)，Runx2可作為miRNA-204的直接靶標(biāo)。葛根素可通過下調(diào)miRNA-204來促進(jìn)Runx2表達(dá)、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，實(shí)現(xiàn)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的作用。