李　嬋，任　偉

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貝伐單抗對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖及纖維化的影響

李嬋1，任偉2

1Department of Ophthalmology;2Department of Surgery, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Chan Li. Department of Ophthalmology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi Province, China.13991219091@163.com

Received：2016-04-26Accepted：2016-07-05

?AIM: To investigate the effects of Bevacizumab on the proliferation and the expression of E-Cadherin and fibronectin in human retinal pigment epithelial cell(ARPE-19)invitro.

?METHODS: Different concentrations (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0mg/mL) of bevacizumab were exposed to ARPE-19 cells, then cell viability was analyzed by CCK-8, cell cycle was determined by flow cytometry, and the expression of E-Cadherin and fibornectin was detected by Western blot and RT-PCR.

?RESULTS: The concentration as 2.5mg/mL or 5.0mg/mL of bevacizumab was shown to effectively suppress the proliferation and cell cycle of ARPE-19 cell (P<0.05). In addition, 2.5mg/mL or 5.0mg/mL of bevacizumab could downregulate the expression of E-cadherin and promote the transcription of fibronection gene (P<0.05).

?CONCLUSION: High concentration of bevacizumab was able to inhibit ARPE-19 proliferation, downregulate E-Cadherin expression and promote fibronectin expression, indicating epithelial-mesenchymal transition induced by bevacizumab in ARPE-19 cell.

Citation:Li C,Ren W. Effects of Bevacizumab on the proliferation and epithelial-mesenchymal transition in human retinal pigment epithelial cellsinvitro.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1449-1452

摘要

目的：觀察貝伐單抗對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19增殖及鈣黏連蛋白(E-cadherin)和纖維連接蛋白(fibronectin)表達(dá)變化的作用，探討貝伐單抗對(duì)ARPE-19增殖及纖維化的影響。

方法：用不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5.0mg/mL)的貝伐單抗干預(yù)體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19，采用CCK-8法分別于24、48、72h檢測(cè)細(xì)胞活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；應(yīng)用免疫蛋白印跡法(Western blotting)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)ARPE-19中E-cadherin和fibronectin的蛋白及mRNA的表達(dá)變化。

結(jié)果：濃度為2.5、5.0mg/mL貝伐單抗能有效抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.5、5.0mg/mL貝伐單抗能抑制E-cadherin基因，促進(jìn)fibronectin基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論：高濃度的貝伐單抗能夠抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖，下調(diào)纖維化相關(guān)因子E-cadherin，同時(shí)上調(diào)fibronectin的表達(dá)，提示高濃度的貝伐單抗可以引起ARPE-19細(xì)胞纖維化。

關(guān)鍵詞：貝伐單抗；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；增殖；纖維化

引用：李嬋，任偉.貝伐單抗對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖及纖維化的影響.國(guó)際眼科雜志2016;16(8):1449-1452

0引言

滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性是發(fā)達(dá)國(guó)家第一位的致盲眼病，其主要特征是黃斑部視網(wǎng)膜下脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)等生成，并伴有反復(fù)出血、滲出等病理改變。一旦這些新的異常血管開(kāi)始生長(zhǎng)，經(jīng)常會(huì)引起出血，導(dǎo)致進(jìn)一步的愈合反應(yīng)和視網(wǎng)膜下纖維化。玻璃體腔注射血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體是目前此種疾病的一線治療方法[1]。貝伐單抗是人源化抗VEGF的IgG單克隆抗體，被美國(guó)食品藥品安全局批準(zhǔn)用于治療結(jié)腸癌，現(xiàn)在被廣泛用于脈絡(luò)膜新生血管性疾病的治療[2]。但隨著抗VEGF藥物的廣泛應(yīng)用及隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，抗VEGF治療的副作用也逐漸顯現(xiàn)。越來(lái)越多的研究報(bào)道，抗VEGF治療后無(wú)論是CNV還是視網(wǎng)膜新生血管均可發(fā)生較嚴(yán)重的纖維化[3-4]?？寡苄律幬锏膽?yīng)用加劇了CNV病理纖維發(fā)生，但潛在的機(jī)制仍不清楚。因此，本研究將觀察貝伐單抗對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19增殖及鈣黏連蛋白(E-cadherin)和纖維連接蛋白(fibronectin)表達(dá)變化的作用，探討貝伐單抗對(duì)ARPE-19增殖及纖維化的影響。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19(美國(guó)ATCC公司)，貝伐單抗(美國(guó)羅氏)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素溶液、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(上海七海生物公司)，碘化丙啶PI、RNaseA(美國(guó)Sigma公司)，流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD Biosciences)，一抗(鼠抗人anti-E-cadherin、兔抗人anti-fibronectin)及二抗(美國(guó)Abcam公司)，Real-Time PCR試劑盒(日本Takara公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組ARPE-19細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，按說(shuō)明復(fù)蘇，用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素)在37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每48h更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿瓶底80%左右，按1∶3比例消化傳代。按貝伐單抗干預(yù)終濃度分為0、0.625、1.25、2.5、5.0mg/mL共5組。

1.2.2 CCK8檢測(cè)各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性ARPE-19細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×103/孔接種在96孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后，更換新鮮培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)分組用不同濃度貝伐單抗干預(yù)細(xì)胞，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72h后，每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，使用自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀，在450nm吸收波長(zhǎng)處測(cè)量各組細(xì)胞的吸光度值(A450)，計(jì)算每組的平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期ARPE-19細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×105/孔接種在6孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后，更換新鮮培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)分組用不同濃度貝伐單抗干預(yù)細(xì)胞，24h后用胰酶消化成單細(xì)胞懸液后混入冰75%無(wú)水乙醇，4℃靜置過(guò)夜，離心棄上清，PBS漂洗3次，100μg/mL PI 0.5mL及100μg/mL RNase A 0.5mL作用30min(37°C，避光)，用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD Biosciences)分析，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm及630nm，上述步驟至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞E-cadherin和fibronectin的mRNA表達(dá)水平不同濃度貝伐單抗干預(yù)24h后收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞mRNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的E-cadherin和fibronectin的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。獲取各組樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以GAPDH為內(nèi)參分析其Ct值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，所有PCR反應(yīng)由PCR儀完成，GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組相對(duì)定量值(RQ值)。

1.2.5 Western blotting測(cè)定各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞E-cadherin和fibronectin蛋白的表達(dá)不同濃度貝伐單抗干預(yù)24h后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按每個(gè)樣本5μg總蛋白上樣，100g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；4℃下100mA電轉(zhuǎn)膜3h，50g/L脫脂奶粉室溫封閉1h，E-cadherin和fibronectin一抗(濃度為1∶1000)4℃孵育過(guò)夜。第2d滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG，濃度為1∶100000)室溫孵育1h。免疫反應(yīng)結(jié)束后用Western blotting熒光劑發(fā)光、顯影。Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)照相，應(yīng)用Image J圖像分析軟件，通過(guò)目的基因與內(nèi)參條帶的吸光度值比值進(jìn)行目的蛋白的相對(duì)含量分析。

表1RT-PCR SYBR Green法引物序列

目的基因引物序列(5→3)E-cadherinF:CCCACCACGTACAAGGGTCR:CTGGGGTATTGGGGGCATCfibronectinF:GCGAGAGTGCCCCTACTACAR:GTTGGTGAATCGCAGGTCAGAPDHF:GGAGTCCACTGGCGTCTTCR:GCTGATGATCTTGAGGCTG

圖1不同濃度的貝伐單抗對(duì)ARPE-19細(xì)胞株活性的影響。

2結(jié)果

2.1不同濃度的貝伐單抗對(duì)各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的變化CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，用不同濃度的貝伐單抗干預(yù)ARPE-19細(xì)胞株24h時(shí)，其中0mg/mL組(0.2254±0.01734)、0.625mg/mL組(0.2300±0.01707)、1.25mg/mL組(0.2268±0.01591)、2.5mg/mL組(0.2264±0.01169)的組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，5.0mg/mL組(0.1954±0.01194)細(xì)胞活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在作用48h時(shí)，其中0mg/mL組(0.2438±0.02255)、0.625mg/mL組(0.2432±0.01844)、1.25mg/mL組(0.2480±0.02573)的組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，2.5mg/mL組(0.2072±0.01038)和5.0mg/mL組(0.1914±0.00832)細(xì)胞活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在作用72h時(shí)，其中0mg/mL組(0.2922±0.01238)、0.625mg/mL組(0.3002±0.01794)，1.25mg/mL組(0.3100±0.01239)的組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，2.5mg/mL組(0.1806±0.01958)和5.0mg/mL組(0.1528±0.01555)細(xì)胞活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期流式結(jié)果顯示(χ2檢驗(yàn))：不同濃度的貝伐單抗干預(yù)ARPE-19細(xì)胞株24h后，其中0mg/mL組(S期占22.34%±3.11%)、0.625mg/mL組(S期占17.11%±2.68%)、1.25mg/mL組(S期占20.07%±3.12%)的組間S期百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；2.5mg/mL組(S期占8.22%±1.21%)、5.0mg/mL組(S期占5.52%±0.58%)的組間S期百分比明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2)。

圖2不同濃度的貝伐單抗對(duì)ARPE-19細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響A:0mg/mL組;B:0.625mg/mL組;C:1.25mg/mL組;D:2.5mg/mL組;E:5.0mg/mL組;F:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

2.3各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中E-cadherin和fibronectin的mRNA表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的貝伐單抗干預(yù)ARPE-19細(xì)胞株24h后，2.5mg/mL組及5.0mg/mL組E-cadherin mRNA表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而0、0.625、1.25mg/mL組E-cadherin mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.5mg/mL組及5.0mg/mL組fibronectin mRNA表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而0、0.625、1.25mg/mL組fibronectin mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖3)。

2.4各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中E-cadherin和fibronectin蛋白的表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度的貝伐單抗干預(yù)ARPE-19細(xì)胞株24h后，2.5mg/mL組及5.0mg/mL組E-cadherin蛋白表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但2.5mg/mL組與5.0mg/mL組之間降低不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而0、0.625、1.25mg/mL組E-cadherin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.5mg/mL組及5.0mg/mL組fibronectin蛋白表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但2.5mg/mL組與5.0mg/mL組之間升高不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而0、0.625、1.25mg/mL組fibronectin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖4)。

圖3不同濃度的貝伐單抗對(duì)ARPE-19細(xì)胞株E-cadherin和fibronectin的mRNA表達(dá)水平的影響aP<0.05vs0mg/mL組。

3討論

Spitzer等[5]在貝伐單抗對(duì)不同種類視網(wǎng)膜細(xì)胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，0.008～2.5mg/mL貝伐單抗在24h時(shí)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC5)、脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞和ARPE19均未見(jiàn)毒性作用，但在2.5mg/mL貝伐單抗作用48h時(shí)觀察到ARPE19的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性輕度下降，提示在0.25mg/mL的常規(guī)臨床用藥劑量下是相對(duì)安全的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高劑量(2.5mg/mL)的貝伐單抗可能對(duì)ARPE19是有害的。后續(xù)在Brar等[6]研究結(jié)果中同樣顯示2.0mg/mL貝伐單抗在24h時(shí)可以抑制猴脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞(RF6A)，但對(duì)RGC5和ARPE19均未見(jiàn)毒性作用。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，0.625～2.5mg/mL貝伐單抗作用24h時(shí)對(duì)ARPE19細(xì)胞活性未見(jiàn)明顯影響，但在圖4各組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中E-cadherin和fibronectin蛋白的表達(dá)A：E-cadherin和fibronectin蛋白條帶圖；B：E-cadherin和fibronectin蛋白表達(dá)的柱形圖(aP<0.05vs0mg/mL 組)。

5.0mg/mL時(shí)細(xì)胞活性輕度下降。干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)到48h時(shí)，在2.5mg/mL和5mg/mL組均可觀察到細(xì)胞活性的輕度下降。進(jìn)一步延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間到72h時(shí)，2.5mg/mL和5mg/mL組均顯示出明顯的細(xì)胞活性抑制。表明高濃度的貝伐單抗對(duì)ARPE19有明顯的毒性作用，且呈時(shí)間相關(guān)性。流式細(xì)胞檢測(cè)表明貝伐單抗作用24h時(shí)，2.5mg/mL和5mg/mL組S期細(xì)胞百分比明顯降低，G1/S期阻滯。進(jìn)一步表明高濃度貝伐單抗通過(guò)阻滯G1/S期抑制細(xì)胞增殖。而近期研究表明貝伐單抗能夠通過(guò)誘導(dǎo)p53表達(dá)，上調(diào)p16、p21、p27的表達(dá)，進(jìn)而抑制cyclinD和E，以及CDK2，4，6的表達(dá)，最終減少ppRb表達(dá)以及導(dǎo)致細(xì)胞周期G1/S期阻滯[7]。

Bloch等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者在應(yīng)用抗VEGF藥物后1a或者更短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了黃斑中心凹下的纖維化。Heier[9]隨訪發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗VEGF藥物治療2～6a后有超過(guò)50%患者黃斑部發(fā)生了嚴(yán)重纖維化。目前，新生血管纖維化牽拉條帶形成引起的牽拉性視網(wǎng)膜脫離，已成為影響抗VEGF藥物治療效果的重要原因[10-14]。體外研究中發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗能夠上調(diào)人RPE細(xì)胞中CTGF、bFGF、TGF-β2及MMP-2的表達(dá)，可能有促進(jìn)纖維化的作用[15]。上皮細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記物鈣黏附蛋白(E-cadherin)及間質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記物fibronectin是EMT特異性的生物學(xué)標(biāo)志。E-cadherin是一種主要存在于人和動(dòng)物上皮的黏附分子，主要功能是維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。fibronectin具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化的作用，進(jìn)而能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。本次研究發(fā)現(xiàn)：高濃度的貝伐單抗能夠下調(diào)纖維化相關(guān)因子E-cadherin，同時(shí)上調(diào)fibronectin的表達(dá)，提示高濃度的貝伐單抗可以引起ARPE-19細(xì)胞纖維化。

本研究觀察了不同濃度貝伐單抗對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖及纖維化的作用，證明高濃度的貝伐單抗能夠抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖，下調(diào)纖維化相關(guān)因子E-cadherin，同時(shí)上調(diào)fibronectin的表達(dá)，提示高濃度的貝伐單抗可以引起ARPE-19細(xì)胞纖維化。

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作者單位：(710068)中國(guó)陜西省西安市，陜西省人民醫(yī)院1眼科；2外科

作者簡(jiǎn)介：李嬋，女，主治醫(yī)師，研究方向：眼表及視網(wǎng)膜疾病。

通訊作者：李嬋.13991219091@163.com

收稿日期：2016-04-26 修回日期： 2016-07-05

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.11

?KEYWORDS:bevacizumab; human retinal pigment epithelial cell; proliferation; epithelial-mesenchymal transition

Effects of Bevacizumab on the proliferation and epithelial-mesenchymal transition in human retinal pigment epithelial cellsinvitro

Chan Li1, Wei Ren2

Abstract