趙霖　周文亭　曹經(jīng)瑗　畢勝利

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

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模擬水樣中甲肝病毒超濾濃縮和PEG濃縮方法的比較

趙霖周文亭曹經(jīng)瑗畢勝利

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

【摘要】目的比較模擬水樣中甲肝病毒(HAV)超濾濃縮和PEG濃縮方法，為水中HAV檢測提供參考。方法向模擬水樣中接種已知量的HAV，分別選用Millipore和Sartorius公司的100KD和50KD孔徑的微孔超濾管及終濃度為10%聚乙二醇(PEG)-1M氯化鈉(NaCl)沉淀的方法對模擬水樣進(jìn)行濃縮，采用熒光定量RT-PCR方法檢測濃縮后的病毒量，用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果采用同一孔徑不同廠家的超濾管濃縮病毒無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P=0.25，P=0.532),對濃縮后的CT值及回收量進(jìn)行分組比較，結(jié)果均表明不同處理方法有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000<0.05，P=0.000<0.05)，其中50KD組濃縮病毒回收率為(94.57±16.26%)，100KD組濃縮病毒回收率為(52.37±14.75%)，10%PEG-1.0MNaCl沉淀病毒回收效率為(63.5±8.45%)。結(jié)論超濾和PEG沉淀兩種方法均可用于水樣中HAV濃縮，超濾管濃縮病毒操作簡便，耗時更短，選擇合適孔徑可以提高HAV病毒回收率,本實(shí)驗(yàn)中50KD超濾管HAV回收率高于100KD；PEG更適用處理大體積樣本。

【主題詞】甲肝病毒；病毒濃縮；PEG濃縮；超濾； 熒光定量RT-PCR

近年來腸道病毒導(dǎo)致的疾病時有發(fā)生，如：胃腸炎、肝炎等，嚴(yán)重威脅人類健康。其中，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)屬微小RNA病毒科，肝病毒屬，能夠通過受污染的水和食物經(jīng)糞口途徑傳播，臨床上以疲乏、食欲減退、肝腫大、肝功能異常為主要表現(xiàn)，部分病例出現(xiàn)黃疸，主要表現(xiàn)為急性肝炎。HAV通常在受污染環(huán)境水體中的病毒濃度較低，難以直接檢測，細(xì)胞培養(yǎng)可以用于分離培養(yǎng)HAV，但此方法存在操作繁瑣、細(xì)胞培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)。常通過各種物理方法，對大量水體中的病毒進(jìn)行濃縮和富集來提高樣品中HAV病毒濃度[1]。國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了多種病毒濃縮方法，如陰陽離子膜吸附洗脫、有機(jī)絮凝沉淀、陰陽離子交換等方法，其中病毒吸附在陰陽離子微孔濾膜上的濃縮方法，常用一定比例的牛肉膏甘氨酸混合液(PH9.5)作為洗脫液，洗脫濾膜上的病毒，但第一步濃縮后病毒濃度不能滿足直接檢測的目的，一般需要第二步濃縮，常用的方法有：絮凝沉淀、透析、超速離心、PEG沉淀、超濾等，但病毒的回收效率受操作者的熟練程度以及試劑、儀器和外界環(huán)境干擾因素的影響較大[2]。本研究選擇了含1.5%牛肉膏(Beef)-0.05mol/L(M)甘氨酸(GBE)的純凈水作為模擬水樣(模擬第一步濃縮洗脫下病毒的洗脫液)，選擇了兩種(超濾和PEG沉淀)具有代表性的第二步濃縮方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用熒光定量RT-PCR對病毒核酸進(jìn)行檢測，比較分析各種影響病毒回收率的因素。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料，儀器和試劑凍干甲肝減毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine，HepA-L)由長春生物制品研究所提供；超濾管S50和S100：Vivaspin? Turbo 15超濾離心管，購自Sartorius公司；超濾管M50和M100：Amicon? Ultra 15超濾離心管，購自Millipore公司，截留分子量分別為50 KD和100 KD。PEG8 000購自Merck公司。

病毒RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；Realtime-RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Realtime-RT-PCR引物及探針合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；牛肉粉(Beef extract powder)購自O(shè)xoid公司；甘氨酸(Glycine)購自AMRESCO公司

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HepA-L稀釋液及常用溶液配制：取1支凍干HepA-L，根據(jù)說明書，加入適量DEPC水溶解， HepA-L病毒濃度為100TCID50/ μl，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5% Beef-0.05 M GBE洗脫液：取1.5 g牛肉粉，0.375 g甘氨酸，加蒸餾水定容至100 ml，攪勻，調(diào)pH至7.0，高壓滅菌;根據(jù)文獻(xiàn)[33]選用終濃度為10%PEG-1.0M NaCl ,配制2×PEG-NaCl母液：取20 g PEG、11.7 g NaCl，加蒸餾水定容至100 ml，得到20% PEG-2.0M NaCl母液，調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。

1.2.2配制模擬水樣濃縮液: 取6 ml 1.5%Beef-0.05M的GBE溶液至三角瓶，加入上述HepA-L溶解液，使終病毒量為1500 TCID50，于恒溫?fù)u床中120 rpm/min，震蕩20 min。

1.2.3超濾濃縮和PEG濃縮HAV流程: 實(shí)驗(yàn)中用到的超濾管提前一天按照說明書預(yù)處理。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性每個超濾離心管都是一次性使用。

A將混勻的模擬水樣病毒液分別倒入超濾管S100或S50中,4℃離心1 000×g(非固定轉(zhuǎn)角離心機(jī))，前者離心12～15 min,后者離心15～30 min,收集到濃縮液200 μl，按照超濾管說明書清洗濾管底部，收集濃縮后的HAV于1.5 ml Ep管中，用于提取HAV RNA。

B將混勻的模擬水樣病毒液倒入超濾管M100或M50中，4℃離心2000×g(非固定轉(zhuǎn)角離心機(jī))，前者離心15～20 min,后者離心30～50 min，收集到濃縮液200 μl，按照超濾管說明書清洗濾管底部，收集濃縮后的HAV于1.5 ml Ep管中，用于提取HAV RNA。

C將混勻的模擬水樣病毒液，加入等體積的2×PEG-NaCl母液，于4℃恒溫?fù)u床中120 rpm/min，震蕩20 min混勻，4℃冰箱靜置沉淀過夜。第二日，4℃，10 000×g，離心30 min。棄去上清，用250 μl DEPC水清洗離心管底部，收集濃縮后的HAV于1.5 mL Ep管中，用于提取HAV RNA。

上述3個處理方法各自重復(fù)5次，每次實(shí)驗(yàn)有3個復(fù)孔。

1.2.4病毒核酸的提取: 根據(jù)硅基質(zhì)材料吸附RNA的原理，利用OMEGA公司病毒RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Viral RNA Kit)對濃縮后的上述樣品進(jìn)行提取純化總RNA。將200 μl濃縮的病毒液加入配制好的GBE溶液至終體積280 μl，根據(jù)說明書,分成兩管分別加入裂解液，硅基質(zhì)材料吸附核酸時合并進(jìn)行總核酸提取，提取出的總HAV RNA洗脫于50 μl DEPC處理的水中。

1.2.5熒光定量RT-PCR的引物、探針及反應(yīng)條件: 根據(jù)文獻(xiàn)[4, 5]，選取位于5’NCR的引物和探針，序列如下：上游引物：5’-GGTAGGCTACGGGTGAAAC -3’；下游引物：5’-CCTCCGGCGTTGAATGGTTT-3’；探針序列：5’-FAM-ACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGA-BHQ1 -3’：根據(jù)One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit說明書，配制反應(yīng)體系， RNA樣本5 μl，總反應(yīng)體系為20 μl。

表1　濃縮方法概況

反應(yīng)條件：42℃，30 m；95℃，10 s；擴(kuò)增40個循環(huán)：95℃，5 s；60℃34 s。以Ct值<36作為檢測結(jié)果陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6回收率計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 根據(jù)如下公式log10Q/Q0=(CT0-CT)/3.32，計(jì)算不同處理濃縮后的病毒回收率，其中Q、Q0分別代表濃縮后檢出的HAV RNA的含量、濃縮前HepA-L稀釋液RNA的含量，Ct、CT0分別代表濃縮后檢測的Ct值、濃縮前HepA-L稀釋液檢測的Ct值[6]，得Q=10^(CT0-CT)/3.32)*Q0; 回收率=Q/Q0*100%,其中Q0為1500TCID50。

2結(jié)果

2.1超濾管濃縮及PEG沉淀處理表1中表明超濾管濃縮及PEG沉淀處理過程。其中10%PEG-1.0MNaCl需要4℃冰箱靜置沉淀過夜，而超濾管濃縮可以即時處理。PEG沉淀過后終體積250 μl為加入的DEPC水,而超濾管濃縮的終體積是超濾管的截留體積200 μl。

2.2CT值的比較對同一孔徑不同廠家的超濾管濃縮病毒的Ct值進(jìn)行兩兩比較, 非參數(shù)Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示S100與M100差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.25),參數(shù)T檢驗(yàn)結(jié)果表明S50與M50差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.532)如表2所示；因此將S100與M100超濾管分為100 KD組，S50與M50分為50 KD組;分組后對濃縮后病毒的Ct值進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示不同處理方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，說明這幾種處理方法對病毒濃縮效果不同。進(jìn)一步兩兩比較顯示50 KD組與100 KD組和10%PEG-1.0MNaCl差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05,P=0.024<0.05)：100 KD組與10%PEG-1.0MNaCl差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.304)如表3所示。

Ct值均值結(jié)果顯示S50 與M50超濾管濃縮病毒的Ct值在三組數(shù)值中最小(27.26±0.26)說明它的回收效果相對最好； S100與M100超濾管濃縮病毒的Ct值在三組數(shù)值中最大(28.15±0.47)，說明它的回收效果相對最弱；10%PEG-1.0MNaClCt值(27.82±0.19)，在三組數(shù)值中居中(見表3)。

表2　同一孔徑不同廠家的超濾管Ct值的比較

表3　濃縮前后CT的比較

注：*表示結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Note：*Statistically significant difference(P<0.05)

表4　濃縮后病毒量的比較及病毒回收率

注：*表示結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Note：*Statistically significant difference(P<0.05)

2.3病毒回收量的比較及病毒回收率對模擬水樣濃縮后的病毒回收量進(jìn)行方差分析結(jié)果顯示不同處理方法對病毒的回收率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，兩兩比較顯示50 KD組與100 KD組和10%PEG-1.0MNaCl差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05，P=0.004<0.05)，100 KD組與10%PEG-1.0MNaCl差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.597)如表4所示。

病毒回收率均值結(jié)果顯示50 KD組的回收率較高(94.57±16.26%)，100 KD組的回收率較低(52.37±14.75%)，10%PEG-1.0MNaCl沉淀回收效率居中(63.5±8.45%)。從表4中可以看出，截留分子量為50 KD 的超濾管回收率普遍高于截留分子量為100 KD的超濾管。對于濃縮水中甲肝病毒，相比較100 KD超濾管，50 KD的超濾管回收效率更高，但離心時間也更長。

3討論

檢測水體中HAV主要困難：一是病毒含量較低，通常難以直接檢測；二是HAV細(xì)胞培養(yǎng)困難。因此首先需要將水體中的HAV進(jìn)行濃縮，然后利用靈敏度較高的分子檢測技術(shù)對HAV的核酸進(jìn)行檢測。有些濃縮方法一步濃縮后需要選擇合適的洗脫液用合適的方法將病毒從過濾膜上洗脫下來，但病毒濃度常不能達(dá)到檢測要求，需二次濃縮。經(jīng)過優(yōu)化，我們選擇了1.5%Beef-0.05M GBE(PH9.5)溶液作為模擬一步濃縮洗脫后的水樣進(jìn)行二步濃縮研究。

超濾濃縮是較為常見的病毒二步濃縮技術(shù)，該方法用于脊髓灰質(zhì)炎病毒、諾如病毒的富集和濃縮，并取得了良好回收效果；超濾是一種以微孔濾膜為過濾介質(zhì)，以壓力為驅(qū)動力，利用膜孔選擇性篩分性能，迫使小分子物質(zhì)透過膜，大分子被膜截留從而進(jìn)行分離、濃縮樣品的方法[8]。超濾濃縮病毒，回收率受孔徑大小影響明顯，我們實(shí)驗(yàn)中表明HAV回收時50 KD超濾管HAV回收率比100 KD超濾管更高，推測可能是50 KD孔徑小于100 KD孔徑,樣品大小等也可能影響病毒回收效率,詳細(xì)原因有待進(jìn)一步探索。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，用惰性蛋白封閉超濾管過濾裝置可以提高濃縮病毒的回收率，本研究模擬的病毒濃縮液是加入了牛肉膏甘氨酸等蛋白的混合液，本身含有蛋白，已具有封閉作用。

與超濾管濃縮相比較，PEG沉淀更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，因需要沉淀過夜，操作時間比超濾管濃縮要長， PEG處理樣本的體積比超濾管濃縮更靈活。我們經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后選用了終濃度為10%PEG-1.0MNaCl，初始模擬水樣為牛肉膏-甘氨酸緩沖液(模擬經(jīng)過一次濃縮的病毒濃縮液)。我們曾在預(yù)實(shí)驗(yàn)中向相同體積(6 ml)的超純水或牛肉膏-甘氨酸緩沖液中加入相同量的HepA-L病毒液，經(jīng)相同濃度PEG沉淀濃縮后，含牛肉膏-甘氨酸緩沖液的沉淀濃縮效果更好。推測可能是含有牛肉膏的緩沖液中有蛋白質(zhì)等物質(zhì)，增加了PEG分子與HAV顆粒的接觸機(jī)會，PEG通過空間位置排斥，使水樣中的 HAV顆粒集聚在一起，濃度超過其溶解度而發(fā)生沉淀[10]。對于含有雜質(zhì)較少的待測水樣加入牛肉膏甘氨酸等蛋白物質(zhì)，回收效果可能會更好，本實(shí)驗(yàn)終濃度為10%PEG-1.0MNaCl沉淀濃縮后病毒回收率63.5±8.45%，分析影響回收率的因素[22]，不同的沉淀?xiàng)l件、操作手法，不同濃度的PEG及NaCL對病毒回收率都有一定影響。還有可能的原因是我們選用的是甲肝的減毒疫苗作為初始加入病毒，不同的初始加入病毒對回收率也有一定的影響。另外，相同濃度的PEG對不同的病毒的回收率也不相同。有文獻(xiàn)報(bào)道改變模擬洗脫液的蛋白成分和濃度可以提高病毒回收率，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，超濾和PEG兩種方法均可用于HAV濃縮，超濾管操作簡便，耗時較短，選擇合適孔徑可以提高病毒回收率，但不適合處理體積過大的病毒液；PEG更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，得率適中，試劑來源方便，樣品量范圍廣，這為HAV研究提供了參考價值。

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通信作者：曹經(jīng)瑗，Email: caojy@126.com

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(收稿日期：2016-01-04)

Comparison of hepatitis A virus concentration methods from simulated water samples using Ultrafiltration and PEG precipitation

ZhaoLin,ZhouWenting,CaoJingyuan,BiShengli

NationalInstituteForViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:Caojingyuan,Email:caojy@126.com

【Abstract】ObjectiveTo compare concentration methods of ultrafiltration and PEG precipitation for hepatitis A virus(HAV) in simulated water samples, and provide a reference for detection of HAV in water. MethodsQuantitative HAV was inoculated in the simulated water samples. Millipore, Sartorius, 100KD and 50KD aperture microporous ultrafiltration centrifuge tubes and the final concentration of 10% polyethylene glycol (PEG) -1M sodium chloride (NaCl) precipitation method were selected to concentrate HAV. The concentration of virus was detected by fluorescence quantitative RT-PCR method. The data were statistically analyzed with SPSS21.0. ResultsThe comparison of CT value and recovery rate shows that there were significant differences in different treatment methods (P<0.0001, P<0.0001). There were not statistically significant between ultrafiltration centrifuge tubes that they produced by different factory but with the same aperture (P=0.25, P=0.532), 50KD group had a higher recovery rate(94.57± 16.26%)than 100KD group (52.37± 14.75%) and the 10%PEG-1.0MNaCl (63.5 ± 8.45%)was in middle of them. ConclusionsBoth methods of ultrafiltration and PEG precipitation can be used for HAV concentration in water samples, the ultrafiltration centrifuge tube has the advantages of simple operation, less time-consuming and so on, select the appropriate aperture can improve the recovery rate of HAV virus. The HAV recovery rate of 50KD ultrafiltration centrifuge tube is higher than 100kD; PEG is more economical and practical, also it can process a large volume sample.

【Key words】Hepatitis A virus; viral concentration; PEG; ultrafiltration; fluorescence quantitative RT-PCR