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TNFAIP8與胃癌耐藥關系的初步研究①

2016-08-09 07:37李莉娜畢志彬王金勝
中國免疫學雜志 2016年7期
關鍵詞:耐藥胃癌

李莉娜 畢志彬 王金勝

(長治醫(yī)學院病理學教研室, 長治046000)

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TNFAIP8與胃癌耐藥關系的初步研究①

李莉娜畢志彬②王金勝

(長治醫(yī)學院病理學教研室, 長治046000)

[摘要]目的:探討TNFAIP8與胃癌耐藥性的關系。方法:選取47例進行新輔助化療患者手術前后的標本,免疫組化檢測TNFAIP8蛋白的表達;Western blot檢測胃癌細胞株SGC-7901及其順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表達差異,利用RNA干擾技術降低順鉑耐藥細胞株中TNFAIP8的蛋白表達后,MTT檢測其對順鉑的敏感性有無變化。結(jié)果:TNFAIP8在新輔助化療前后的表達差異不大,在新輔助化療無效組中的表達較有效組高(P<0.05);SGC7901/DDP細胞中TNFAIP8蛋白的表達高于SGC7901細胞,siRNA-TNFAIP8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細胞后蛋白表達顯著下降,MTT結(jié)果顯示降低TNFAIP8蛋白表達,細胞對順鉑的IC50較SGC7901/DDP顯著下降(P<0.05),敏感性提高。結(jié)論:TNFAIP8參與了胃癌的化療耐藥性。

[關鍵詞]胃癌;TNFAIP8;耐藥

腫瘤壞死因子α誘導蛋白8(TNFAIP8),或稱為SCC-S2、GG2-1、NDED,最先是在比較頭頸部鱗癌細胞株和其對應的高轉(zhuǎn)移細胞株中的差異蛋白里被確認的,TNF-α的刺激和NF-κB的活化可誘導其表達[1]。TNFAIP8通過抑制細胞凋亡來參與免疫過程、促進腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移[2]。由于TNFAIP8具有調(diào)控細胞凋亡的功能,我們分析其也可能影響腫瘤的臨床治療:放療和化療療效,有研究顯示在食管鱗狀細胞癌中沉默TNFAIP8的表達后,可提高腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性[3]。有關TNFAIP8與胃癌化療藥物的耐藥性研究報道較少,故我們通過檢測了胃癌耐藥細胞株中TNFAIP8的表達及利用RNA干擾技術,比較臨床病例對胃癌新輔助化療不同療效組的TNFAIP8的表達來研究TNFAIP8與胃癌耐藥性的關系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料與細胞系收集2012年1月~2014年12月47例長治醫(yī)學院附屬和平及附屬和濟醫(yī)院病理科確診為進展期胃癌患者的術前胃鏡活檢及術后標本蠟塊?;颊呔m合進行術前新輔助化療。男40例,女7例;年齡41~67歲,平均年齡60歲;高中分化26例,低分化21例;均發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;臨床分期:均為Ⅲ期。患者進行奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶(Folfox方案)新輔助化療2~3療程后,根據(jù)化療前后腹部CT增強掃描下瘤體大小及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的大小數(shù)目等分為新輔助化療有效組和新輔助化療無效組,有效組(術前化療后完全緩解者2例或部分緩解者19例)21例,無效組(術前化療后病情穩(wěn)定者19例和病情進展者7例)26例[4]。人胃癌細胞株SGC7901同順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP均購買于凱基生物公司。

1.1.2主要試劑胎牛血清、RPMI1640、0.25%胰酶均購自BI公司,MTT、RIPA購自康為世紀,順鉑購自Sigma公司,siRNA-TNFAIP8(序列1:CTGCGTGCGTTTCAGTGTTTAA,序列2:CGGTCTTGATATTGAGATAATA)及其陰性對照由上海吉凱基因有限公司構建合成。Lipofectmaine2000購自Invitrogen公司。TNFAIP8(15790-1-AP)、Tublin(10094-1-AP)購自Proteintech,免疫組化試劑盒PV-9000、DAB顯色液購于北京中杉金橋。

1.2方法

1.2.1免疫組化手術前后的標本蠟塊均進行4 μm切片,按照PV-9000試劑盒說明書操作,一抗TNFAIP8稀釋濃度1∶100,枸櫞酸高壓修復3 min,操作過程中設立陰、陽性對照。結(jié)果判定[5]:陽性表現(xiàn)為細胞胞漿有著色,淡黃色1分,棕黃色2分,褐色3分;著色的范圍,<25%為1分,>75%為3分,介于兩者之間為2分,染色的強度和著色范圍兩分相加:<3分為弱表達,≥3為強表達。同張切片染色不均勻時,分區(qū)域計分平均。

1.2.2細胞培養(yǎng)胃癌SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,SGC7901/DDP細胞需培養(yǎng)基另加1 mg/L的順鉑維持耐藥性,均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,常規(guī)換液、傳代。

1.2.3細胞瞬時轉(zhuǎn)染取生長狀態(tài)良好的SGC7901/DDP細胞種6孔板,第2天觀察匯合度,轉(zhuǎn)染步驟按照lipofectmaine2000說明書進行,siRNA-TNFAIP8質(zhì)粒和對照質(zhì)粒用量各為5 μl,lipofectmaine2000取7 μl,6 h后換液。24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4Western blot檢測TNFAIP8蛋白的表達取生長狀態(tài)良好的SGC7901及SGC7901/DDP細胞PBS洗滌后加RIPA冰上裂解約40 min,4℃ 12 000 r/min 離心30 min后取上清液,與5×上樣緩沖液混合變性,12%SDS-PAGE電泳,每孔上樣約10 μl,100 V穩(wěn)定電壓轉(zhuǎn)膜80 min,5%BSA封閉1 h,1∶1 000稀釋TNFAIP8抗體孵育,1∶5 000 Tublin 4℃過夜,1∶8 000二抗室溫搖床孵育1 h,TBST洗后ECL發(fā)光檢測,經(jīng)凝膠分析軟件Alphaview SA分析,取TNFAIP8和Tublin表達條帶的灰度值之比反映TNFAIP8的表達變化。順鉑耐藥細胞轉(zhuǎn)染48 h后同上方法處理細胞,提取蛋白,觀察干擾效果。

1.2.5MTT法檢測順鉑對耐藥細胞及轉(zhuǎn)染后細胞生長的影響取各組細胞104個到96 孔板,每組各重復5孔,設立調(diào)零和對照孔。細胞貼壁后,加入梯度濃度的順鉑,之后依照MTT操作步驟進行,于酶標儀在波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。計算抑制率、生存率和IC50值。

2結(jié)果

2.1新輔助化療與胃癌組織中TNFAIP8蛋白的關系TNFAIP8蛋白主要位于癌細胞胞漿內(nèi),術后切除組織較術前的胃鏡組織表達升高,但差異不明顯(χ2=0.69,P=0.41),且無論是新輔助化療之前還是之后,化療有效組即對藥物敏感組中TNFAIP8的表達明顯低于化療無效組即對藥物耐藥組中的表達(圖1,表1)。

圖1 TNFAIP8蛋白在胃癌組織中的表達(免疫組化PV-9000,×200)Fig.1 Expression of TNFAIP8 in gastric carcinoma tissues(Immunohistochemistry PV-9000,×200)Note: A.High expression in chemotherapy invalid tissues;B.Low expression in chemotherapy effective tissues.

表1TNFAIP8蛋白的表達與新輔助化療療效的關系

Tab.1Relationship between expressions of TNFAIP8 and neoadjuvant chemotherapy effect

NeoadjuvantchemotherapyEffectCasesTNFAIP8expressionlevelHighLowχ2PBeforeValid217144.780.03Invalid26179AfterValid219124.410.04Invalid26197

2.2胃癌耐藥細胞中TNFAIP8蛋白的表達兩株細胞經(jīng)MTT驗證順鉑對其的細胞毒作用,SGC7901的IC50值為(2.39±0.26)mg/L,SGC7901/DDP 的IC50為(9.39±0.33)mg/L,Western blot結(jié)果顯示胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表達明顯高于其對照細胞株SGC7901?;叶戎捣謩e為 0.47±0.33、 0.74±0.35(圖2)。

2.3轉(zhuǎn)染結(jié)果Western blot檢測顯示在耐藥細胞組、陰性對照組及TNFAIP8 siRNA 組的灰度值比分別為0.72±0.45、0.71±0.34、0.30±0.27,siRNA組較耐藥組TNFAIP8蛋白下降明顯(P<0.05),陰性對照組和耐藥組比較,無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明利用siRNA技術降低了順鉑耐藥細胞中的TNFAIP8蛋白的表達(圖3)。

圖2 WB顯示兩株胃癌細胞系中TNFAIP8蛋白的表達Fig.2 Western blot showed expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DDP cell Note: A.The expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DPP cell;1.SGC7901 cell;2.SGC7901-DDP cell;B.WB corresponding gray analysis diagram.

圖3 WB顯示轉(zhuǎn)染后TNFAIP8蛋白表達情況Fig.3 Western blot showed expression of TNFAIP8 after transfection Note: A.The expression of TNFAIP8 after transfection,1.SGC7901-DDP group;2.Control group;3.siRNA group; B.WB corresponding gray analysis diagram.

圖4 siRNA干擾TNFAIP8蛋白表達后SGC7901-DDP細胞對順鉑敏感性增加Fig.4 Susceptibility of SGC7901-DDP cell to cisplatin increased after siRNA

2.4不同濃度順鉑顯示siRNA-TNFAIP8組對藥物敏感性增強(圖4)。耐藥細胞、陰性對照組及siRNA組對順鉑的IC50值分別為(9.39±0.33)mg/L、(8.86±0.67)mg/L、(5.77 ±0.36)mg/L,與順鉑耐藥細胞組比較,siRNA組IC50降低,細胞生存率顯著下降(P<0.05)。說明在SGC7901/DDP細胞中干擾TNFAIP8的表達后可提高細胞對順鉑的藥物敏感性。

3討論

進展期胃癌的預后不好,其中對化療藥物耐藥是困擾治療的難題,篩選與耐藥有關的基因有可能為治療帶來一定的療效。新輔助化療技術是根據(jù)患者的臨床分期,術前選擇化療藥物進行治療,經(jīng)過新輔助化療后一部分患者可降期手術,效果較好;另外新輔助化療的效果也可對術后的藥物化療做一定的療效指導。為此我們選擇了根據(jù)需要術前進行化療即新輔助化療的一些病例來判斷TNFAIP8是否與化療耐藥有關。結(jié)果顯示TNFAIP8術后的表達較術前高,但差異不明顯,但其在新輔助化療無效組即對化療耐藥組的表達明顯高于化療有效組即對藥物敏感組(P<0.05),提示TNFAIP8有可能參與了胃癌化療耐受。術前的新輔助化療療效對術后的常規(guī)化療藥物選擇有提示作用,故我們認為TNFAIP8蛋白的表達水平也對化療療效有提示。接下來我們又驗證了在胃癌順鉑耐藥細胞株中其的表達明顯高于順鉑敏感細胞,利用RNA干擾技術降低耐藥細胞中其表達后,對順鉑的敏感性顯著提高,由此我們判斷TNFAIP8在胃癌的化療耐藥中是起了一定作用的,這和Hadisaputri等[3]在食管癌細胞中的結(jié)論一樣。Liu等在卵巢上皮癌的臨床病例中也發(fā)現(xiàn)高表達的TNFAIP8對鉑類藥物的治療抵抗[6]。

TNFAIP8是由TNF-α和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導,定位于胞漿內(nèi)的蛋白,分子量為21 kD,F(xiàn)LIP家族成員[7]。因其結(jié)構上也含有死亡效應結(jié)構域,故能抑制Caspase介導的細胞凋亡。TNF-α誘導的TNFAIP8表達可被NF-κB的抑制劑IKB逆轉(zhuǎn),TNFAIP8的表達可抑制TNF-α誘導的NF-κB表達缺失的細胞凋亡,但TNFAIP8的相互作用蛋白和信號通路目前尚不清楚。之前在胃癌、乳腺癌、肺癌中和轉(zhuǎn)移關系密切[8-10];Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在多種高侵襲腫瘤細胞中TNFAIP8的表達沉默可引起與促進血管生長及侵襲相關的VEGFR-2、MMP的表達下調(diào);TNFAIP8在腫瘤治療中的意義尚不明確,在前列腺癌細胞中,研究者發(fā)現(xiàn)雄激素可誘導TNFAIP8的表達,利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗沉默TNFAIP8的表達后可增強放療的敏感性及激素治療效果[12]。

我們結(jié)果顯示TNFAIP8能介導胃癌的耐藥性,其是否影響了耐藥相關蛋白、其的下游蛋白或信號通路是否參與對放療的抵抗還需要繼續(xù)研究。

參考文獻:

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[收稿2015-10-11修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.006

作者簡介:李莉娜(1981年-),女,碩士,講師,主要從事消化道腫瘤研究,E-mail:lilina9825@163.com。 通訊作者及指導教師:王金勝(1976年-),男,博士,教授,主要從事消化道腫瘤研究,E-mail:tigergv@163.com。

中圖分類號R735.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0962-04

Preliminary research in relationship between TNFAIP8 and gastric cancer drug resistance

LI Li-Na,BI Zhi-Bin,WANG Jin-Sheng.

Department of Pathology,Changzhi Medical College,Changzhi 046000,China

[Abstract]Objective:To explore if there was a correlation between TNFAIP8 and gastric tumor drug resistance.Methods: We collected 47 cases of neoadjuvant chemotherapy,and detected the expression of TNFAIP8 in their tissues before and after surgery by immunohistochemistry.Compared the expression of TNFAIP8 between SGC7901 cell and its cisplatin resistance cell SGC7901-DDP by Western blot,and then we used siRNA technology to decreased its expression,continued to test the susceptibility to cisplatin through MTT.Results: The expression of TNFAIP8 between pre-neoadjuvant and after-neoadjuvant had no difference,but the expression of chemotherapy effectiveness was lower than chemotherapy invalidness(P<0.05);the expression of SGC7901-DDP cell was also higher than SGC7901 cell; the expression of TNFAIP8 decreased apparently through plasmid transfection of SGC7901-DDP cell,MTT test showed the fewer expression of TNFAIP8 could increase the susceptibility to cisplatin(P<0.05).Conclusion: TNFAIP8 was involved in chemotherapy resistance of gastric carcinoma.

[Key words]Gastric carcinoma;TNFAIP8;Drug resistance

①本文為山西省衛(wèi)生計生委科研課題(2014140)和長治醫(yī)學院科技創(chuàng)新團隊項目(CX201407)。

②長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院普外科,長治046000。

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