耿紅紅，張敬旸，李　蓮，王根林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，南京 210095)

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RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析不同季節(jié)對檳榔江水牛精液品質(zhì)的影響

耿紅紅，張敬旸，李蓮，王根林*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，南京 210095)

摘要：本研究旨在利用RNA-seq技術(shù)對不同季節(jié)檳榔江水牛全血mRNA進(jìn)行分析，找出不同季節(jié)精液品質(zhì)候選基因。選取5頭生長狀況相近的3～5歲檳榔江水牛，進(jìn)行春、夏、秋、冬4個季節(jié)的精液品質(zhì)(鮮精活力、精子畸形率、射精量、精子密度)檢測。根據(jù)精液品質(zhì)，選取差異極顯著的春(BL)、夏(SBL)兩個季節(jié)的水牛樣品進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析。頸靜脈采集全血，抽提mRNA并組內(nèi)混合制樣，利用RNA-seq技術(shù)分析不同季節(jié)檳榔江水牛全血mRNA差異表達(dá)。根據(jù)差異倍數(shù)>1.5，P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到差異基因，再利用DAVID 6.7軟件對差異基因進(jìn)行GO和KEGG分析，通過RT-PCR驗證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：差異表達(dá)基因84個，其中上調(diào)基因56個，下調(diào)基因28個；GO分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因與應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān)；KEGG分析表明，差異基因顯著富集到腫瘤壞死因子(TNF)和T細(xì)胞受體信號通路。其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子受體類似物死亡結(jié)構(gòu)域(NRADD，又叫熱休克蛋白因子1 (HSF1))、原癌基因FOS和JUN，與精液品質(zhì)相關(guān)性強(qiáng)，可作為進(jìn)一步研究的靶基因。

關(guān)鍵詞：RNA-seq；檳榔江水牛；差異表達(dá)基因；精液品質(zhì)

檳榔江水牛(Betelnut-jiang buffalo)是中國發(fā)現(xiàn)唯一的河流型水牛，主產(chǎn)于騰沖檳榔江上游，檳榔江水牛體型較小，飼料消耗較低，而且產(chǎn)奶量相對較高，牛奶營養(yǎng)豐富，是比較好的乳用品種。當(dāng)前，人工授精技術(shù)及冷凍精液的日益普及，具有優(yōu)良性狀的種公牛越來越受到重視。檳榔江水牛作為改良產(chǎn)奶量低的沼澤型水牛的優(yōu)良父本，探討其遺傳優(yōu)勢有現(xiàn)實意義。

種公牛的精液品質(zhì)受到季節(jié)、品種、年齡、營養(yǎng)和飼養(yǎng)水平等要素的影響，其中季節(jié)變化，尤其是溫度濕度的變化對精液品質(zhì)的影響最為顯著。研究表明，牲畜自身的生理狀態(tài)和精子發(fā)生需要一個適宜的外界環(huán)境作為保障[1]。季節(jié)變化中夏季溫度較高時會極大的影響公牛的精液品質(zhì)和生產(chǎn)效益[2-3]。衡量精液品質(zhì)的指標(biāo)主要有射精量、精子密度、原精活力、凍后精子活力、畸形率和有效精子數(shù)等。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，種公牛夏秋季采精量明顯低于冬春季，其中采精量夏季<秋季<冬季<春季[4]。西門塔爾種公牛原精活力和精子密度隨季節(jié)變化明顯，具體為春季至秋季呈下降趨勢，尤其在6～9月份，達(dá)到最低值，冬季后又明顯上升[5]。M.Sadegh等[6]通過對印度水牛夏季和冬季繁殖性能的比較發(fā)現(xiàn)，冬季精液采集量、密度、精子活力和直線運(yùn)動精子數(shù)均高于夏季，而精子頭部畸形率則夏季高于冬季。由此可見，季節(jié)變化會引起精液品質(zhì)表觀參數(shù)發(fā)生規(guī)律性的變化。

隨著快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)，加之候選基因法在動物遺傳育種中的廣泛應(yīng)用，人們不僅可以在DNA、RNA及蛋白表達(dá)水平上研究影響精液品質(zhì)的候選基因或與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，還可以將分子標(biāo)記與多基因效應(yīng)合并使用進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從動物育種角度進(jìn)行提前選擇，最終借助遺傳的改變改善精液品質(zhì)，以提高經(jīng)濟(jì)效益。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)主要是用高通量測序技術(shù)將mRNA、sRNA 以及ncRNA 等的序列測定出來，以期能夠全面快速地獲得幾乎所有的所需研究樣本的轉(zhuǎn)錄本，并反映出它們的表達(dá)水平[7]。RNA-seq在真核生物的基因表達(dá)調(diào)控、醫(yī)學(xué)和動植物遺傳育種等方面的研究具有不可估量的潛力[8-9]。季節(jié)變化對公牛精液品質(zhì)的研究大多數(shù)停留在表觀指標(biāo)的規(guī)律性變化，而對于分子層面甚少涉及，這對選育工作極為不利，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)研究精液品質(zhì)亦鮮見報道。故本研究對5頭成年中國檳榔江水牛公牛在春、夏、秋、冬4個季節(jié)進(jìn)行精液品質(zhì)的跟蹤檢測，并采用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選分析，探究季節(jié)對檳榔江公牛精液品質(zhì)的影響，為種公牛的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣本收集

自湖北省武漢市興牧科技有限公司種公牛繁育場選取具有相同的飼養(yǎng)條件，年齡3～5歲，體型相近；健康，無患病史的成年檳榔江水牛種公牛5頭。

1.2精液品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的測定

根據(jù)國家牛冷凍精液檢測標(biāo)準(zhǔn)(GB/4143-2008)的相關(guān)規(guī)定，對精液指標(biāo)包括射精量、鮮精活力、密度、畸形率進(jìn)行測定。具體方法：采用臺牛法采集精液，射精量即采即測，一周兩次；精子密度采用密度儀測定，直接讀取數(shù)據(jù)；精子活力通過電視顯微裝置觀察，每樣片觀察3個視野，并觀察不同液層，進(jìn)行評估；畸形率的測定采用姬姆薩染色法，并用血球分類計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)，主要步驟包括制片、固定、染色、鏡檢，鏡檢時每個抹片至少觀察200個精子。

1.3RNA的提取、建庫及測序

采用Trizol法進(jìn)行檳榔江水牛外周血總RNA的抽提；提取所得RNA通過紫外分光光度計分析、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2200 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢 (A260 nm/A280nm≥1.5，A260 nm/A230 nm≥1，RNA完整性≥7)，若電泳發(fā)現(xiàn)有基因組DNA污染，則用DNA酶消化處理；送廣州銳博生物技術(shù)公司完成RNA測序。

1.4芯片結(jié)果數(shù)據(jù)分析與處理

根據(jù) GeneChip Scanner3000 掃描芯片結(jié)果，用Command Console Software 3.1 讀取得到的原始數(shù)據(jù)，采用GeneSpring Software 11.0歸一化處理質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)(MAS 5.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究篩選的標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)值(Fold change值，即FC值)>1.5且P<0.05，利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)生物信息學(xué)軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway分析、GO分析以及層次聚類分析等，對數(shù)據(jù)中所涉及的分子功能、分子代謝通路以及可能的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析。

1.5差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證分析

1.5.1反轉(zhuǎn)錄生成cDNA 使用TaKaRa PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，20 μL PCR反應(yīng)體系：mRNA模板4 μL，Premix Taq Version 2.0 4 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.5.2熒光定量PCR 采用SYBR Green方法進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。所需引物用Primer 5軟件設(shè)計，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物信息詳見表1，20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，ROX(SYBR Green Master)10 μL，ddH2O 7.2 μL，上下游引物各0.4 μL。在7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)儀上進(jìn)行，每個樣本均重復(fù)3次。使用儀器自帶軟件檢測各樣品CT值，并取平均值。mRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCT方法來表示。

表1　RT-PCR引物序列

2結(jié)果

2.1不同季節(jié)檳榔江水牛精液指標(biāo)差異分析

檳榔江水牛不同季節(jié)精液指標(biāo)差異的分析結(jié)果見表2。由表2可知，檳榔江水牛采精量在季節(jié)之間差異不顯著(P>0.05)。精子活力春冬和夏秋季節(jié)差異均不顯著，春冬與夏秋季節(jié)差異極顯著，在4個季節(jié)的變化為春季>冬季>秋季>夏季，說明夏季的到來會對檳榔江水牛精子活力產(chǎn)生影響，這種影響一直會持續(xù)到秋季，直到冬季原精活力才會恢復(fù)到之前的水平。檳榔江水牛精子密度春冬季節(jié)差異顯著，并與其他季節(jié)差異極顯著，且春季>冬季>秋季>夏季，表明夏季檳榔江水牛精子密度明顯降低，夏季結(jié)束后，檳榔江水牛精子密度逐漸恢復(fù)到原有水平。夏季檳榔江水牛凍后精子畸形率夏季與其他季節(jié)相比差異極顯著，春秋和冬季則差異不顯著，且4個季節(jié)冬季<春季<秋季<夏季。

通過對檳榔江公牛不同季節(jié)精液相關(guān)指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)夏季是檳榔江公牛精液品質(zhì)最差的季節(jié)，秋季次之，冬春季節(jié)差異不顯著，選擇具有代表性的夏季和春季作為試驗組和對照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

表2　檳榔江水牛不同季節(jié)精液指標(biāo)比較(n=5)

同行肩標(biāo)不同小寫字母表示不同季節(jié)差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示不同季節(jié)差異極顯著(P<0.01)

Lowercase superscripts in the same row indicate significant differences (P<0.05)；upper-case superscripts indicate extremely significant differences (P<0.01)

2.2差異表達(dá)基因的篩選

利用RNA-seq技術(shù)檢測試驗組和對照組(SBL∶BL)間差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組比對照組有顯著差異表達(dá)基因84個，其中56個基因表達(dá)上調(diào)，28個基因表達(dá)下調(diào)(Fold change>1.5，P<0.05)，部分結(jié)果見表3。

2.3候選基因的GO功能分類

利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7中的Functional Annotation Chart模塊將差異表達(dá)基因按照3大功能板塊，包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)進(jìn)行限定和描述。結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，共涉及到215條GO Terms(P<0.05)。差異表達(dá)基因主要與應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖代謝、RNA加工拼接及蛋白磷酸化相關(guān)。脂多糖代謝與炎癥反應(yīng)和凋亡相關(guān)。FOS、JUN、NRADD主要參與應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)和蛋白磷酸化過程。DDX5主要參與RNA加工拼接過程。在細(xì)胞組成分中，差異表達(dá)基因主要參與膜細(xì)胞器的形成，在分子功能中，差異表達(dá)基因主要與結(jié)合功能相關(guān)。

2.4候選基因的KEGG通路富集分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，根據(jù)KEGG分析有助于進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因中存在的顯著性富集的代謝通路注釋。本研究使用 DAVID Bioinformatics Resources 6.7軟件中的“KEGG Functional Annotation Chart”模塊分別對差異顯著基因進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果共得到90條通路，其中顯著富集的通路有18條，主要參與到剪接體、炎癥性腸病、雌激素及TNF(腫瘤壞死因子)等通路中(圖2)。

2.5差異表達(dá)基因的RT-PCR初步驗證

選出8個差異顯著基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果見圖3。NRADD、FOS、JUN、DDX5、DUSP1、UBE2B為上調(diào)差異表達(dá)基因，KLK1和MMP9為下調(diào)差異表達(dá)基因。且定量結(jié)果與RNA-seq結(jié)果趨勢一致，證明轉(zhuǎn)錄組在篩選差異表達(dá)基因方面的可靠性。

3討論

表3　轉(zhuǎn)錄組測序前10個上下調(diào)基因

圖1　GO分析結(jié)果Fig.1　The GO analysis result

圖2　KEGG分析Fig.2　The KEGG analysis result

種公牛精液品質(zhì)會隨著季節(jié)變化而變化。本研究結(jié)果顯示，與其他3個季節(jié)相比，夏季精子活力較差，畸形率較高，密度較低。與其他季節(jié)相比，春冬季節(jié)精子活力較高，畸形率最低，密度較高，春冬季節(jié)相比，春季精液各指標(biāo)略優(yōu)于冬季。夏季是檳榔江公牛精液品質(zhì)最差的季節(jié)，秋季次之，冬春季節(jié)差異不顯著。張汝等[10]在對檳榔江水牛精液品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，檳榔江水牛冷凍精液解凍活力和精子密度春、秋、冬季極顯著高于夏季，采精量夏季低于秋季，夏季與冬季的差異不顯著，這與本研究結(jié)果相一致。而夏季對公牛精液品質(zhì)的影響可能與其溫度濕度較高引起機(jī)體一系列的變化有關(guān)系。桑潤滋等[11]研究表明，夏季溫度較高時，容易引起公牛熱應(yīng)激，可造成荷斯坦種公牛精液品質(zhì)顯著下降，使原精活力、凍精活力、精子密度、活精子百分率和頂體完整率分別比春季下降3.13%、11.1%、34.8%、15.0%和17.8%，精子畸形率比春季上升25.5%。在精子生成過程中，熱誘導(dǎo)能引起生精細(xì)胞凋亡，睪丸內(nèi)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞對溫度升高最敏感，是凋亡的主要細(xì)胞[12]，夏季高溫刺激，有可能引起生精細(xì)胞的逐漸調(diào)亡，最終造成精子密度降低，活力較差。

1.NRADD;2.JUN;3.DUSPI;4.KLK1;5.FOS;6.DDX5;7.UPF2B;8.MMP9A.RT-PCR結(jié)果；B.RNA-seq結(jié)果A.RT-PCR result；B.RNA-seq result圖3　RT-PCR檢測Fig.3　Confirmation of RT-PCR

本試驗選取具有代表性的夏春季節(jié)檳榔江水牛作為試驗組和對照組，通過轉(zhuǎn)錄組測序，并在測序評估的基礎(chǔ)上，共篩選到84個差異表達(dá)基因，包含56個上調(diào)基因和28個表達(dá)下調(diào)基因。對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選、功能注釋和富集分析后發(fā)現(xiàn)，參與應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)基因HSF1、FOS和JUN在夏季試驗組中表達(dá)量顯著高于春季對照組。其中NRADD，又叫HSF1，屬于熱休克轉(zhuǎn)錄因子[13]，是最早被發(fā)現(xiàn)、最具代表性、最重要的熱休克轉(zhuǎn)錄因子[14]。HSF1在熱應(yīng)激反應(yīng)中的主要功能是在熱休克基因的表達(dá)過程中與相應(yīng)啟動子結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程，最終促進(jìn)熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)的表達(dá)并使其表達(dá)增加[15]。本研究中夏季檳榔江水牛外周血中HSF1表達(dá)量較春季顯著上調(diào)，且檳榔江水牛在夏季精子數(shù)量減少，活力下降，可能與夏季高溫高濕氣候引起檳榔江水牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，并激活了熱應(yīng)激相關(guān)生物學(xué)過程和通路，導(dǎo)致HSF1表達(dá)量上升，以期對抗溫度升高的不良環(huán)境對自身造成的損害。由此，筆者推斷HSF1與精液品質(zhì)相關(guān)。HSF1轉(zhuǎn)基因小鼠生精障礙的機(jī)制為HSF1激活熱休克蛋白(HSP60)和熱休克蛋白(HSP105)，后者誘導(dǎo)著生殖細(xì)胞的大量凋亡，致使雄性小鼠無成熟精子，且研究表明由熱誘導(dǎo)造成的雄性不育多數(shù)與HSF1的活化相關(guān)[16]。且HSF1能夠啟動雄性生殖細(xì)胞中的細(xì)胞程序化死亡，將雄性小鼠生精細(xì)胞阻滯在減數(shù)分裂期[17]。此外，J.Korfanty等[18]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)HSF1的過度表達(dá)引起精母細(xì)胞的大量凋亡并導(dǎo)致雄性不育。

FOS和JUN均參與TNF信號通路和雌激素信號通路。TNF信號通路主要與信號傳導(dǎo)，細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)。包括熱應(yīng)激、趨化因子和炎癥因子等都能夠激活該通路。本研究中檳榔江水牛夏季精液品質(zhì)下降可能是與TNF信號通路的激活相關(guān)。該通路的激活引起FOS和JUN基因的上調(diào)，而這些基因的上調(diào)能夠?qū)辜?xì)胞的凋亡，降低對精液品質(zhì)的影響。由此推斷FOS和JUN基因上調(diào)可能與精液品質(zhì)相關(guān)。K.M.Robertson等[19]研究表明，雌激素具有防止未變態(tài)精子細(xì)胞凋亡，維持成熟精子功能的作用。FOS(也叫C-FOS)和JUN(也叫C-JUN)是激活蛋白-1 (Activator protein-1，AP-1)類轉(zhuǎn)錄因子，屬于原癌基因，其蛋白產(chǎn)物作為核轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。原癌基因?qū)浩焚|(zhì)的影響，一方面是通過原癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異性或不同形式，另一方面是原癌基因在精子發(fā)生過程中不同水平的表達(dá)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，多種應(yīng)激可影響C-FOS和C-JUN的表達(dá)，從而誘導(dǎo)C-JUN氨基末端激酶(C-JUN N-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白酶(p38 mitogen-acdvated protein kinase，p38)的表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)胞的凋亡[21]。雌激素、促性腺激素及多種生長因子促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育和睪酮的分泌是通過FOS和JUN家族的癌基因表達(dá)增強(qiáng)而實現(xiàn)的。人絨毛膜促性腺激素(hCG)和多種生長因子能刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育和睪酮分泌中均伴有原癌基因(包括FOS)的表達(dá)增強(qiáng)，且已證實C-FOS在睪丸組織中有廣泛的表達(dá)，且在生精周期中有周期特異性[22]。本研究中與春季對照組相比較，夏季檳榔江水牛外周血中C-FOS和C-JUN表達(dá)量顯著提高，可以推測這與檳榔江公牛在夏季高溫高濕環(huán)境下發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，以期對抗不良刺激相關(guān)。C-FOS和C-JUN的作用可能與誘導(dǎo)精原細(xì)胞增殖、防止生精細(xì)胞凋亡、維持成熟精子功能有關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程，例如代謝、膜運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞的生長周期等的完成都是基于各個基因間系統(tǒng)地相互協(xié)調(diào)而進(jìn)行的。通過對基因進(jìn)行KEGG和GO富集分析，可以更深入地了解這些基因的生物學(xué)功能[23]。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，將HSF1、FOS和JUN基因作為不同季節(jié)下影響檳榔江公牛精液品質(zhì)的候選基因，對于培育抗應(yīng)激品種，對養(yǎng)牛業(yè)持續(xù)、健康和穩(wěn)定發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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(編輯 程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.009

收稿日期：2016-03-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31372290);“十二五”國家科技計劃項目(2012BAD12B10)

作者簡介：耿紅紅(1989-)，女，山西孝義人，碩士生，主要從事動物生殖與生理調(diào)控研究，E-mail：15150537075@163.com *通信作者：王根林，教授，E-mail:genlwang@sina.com

中圖分類號：S823.8+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1373-08

Semen Quality Analysis of Betelnut-jiang Buffalo in Different Seasons by RNA-seq

GENG Hong-hong，ZHANG Jing-yang，LI Lian，WANG Gen-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:To determine the key candidate genes related to semen quality in different seasons，the mRNA profiling of Chinese Betelnut-jiang buffalo were analyzed by RNA-seq.Based on similarities in growth status，5 Betelnut-jiang buffalo bulls were selected and their semen quality were tested (including ejaculate volume，fresh sperm motility，sperm density and abnormality rate).According to the semen quality，the samples of summer (treated as SBL group) and spring (as BL group) were selected for RNA-seq.We collected the whole blood in jugular vein of Betelnut-jiang buffalo bulls，extracted the mRNAs and mixed them within group.Then，the mRNA profiling was used to measure the mRNAs in Betelnut-jiang buffalo bulls.Gene expression levels with >1.5 fold change and P value < 0.05 between the BL and SBL groups were further analyzed.Furthermore，GO and KEGG were used to analyze the genes enrichment.Finally，RT-PCR was used to confirm the RNA-seq result.The results indicated 84 differentially expressed genes.Among these，56 genes were up-regulated and 28 genes were down-regulated in SBL group.The GO search revealed that these differential expression genes were mainly related to stress reaction and immune response.And the KEGG selected the TNF signaling pathway and T cell receptor signaling pathway.Neurotrophin receptor alike death domain(NRADD，also named heat shock factor protein 1(HSF1))，localisation of FOS (FOS) and jun proto-oncogene (JUN)，were strongly associated with semen quality in different seasons which could be used as target genes for further study.

Key words:RNA-seq；Betelnut-jiang buffalo；differently expressed genes；semen quality