孔偉偉 韓燕 劉譯陽 李國衛(wèi) 萬書波 崔鳳

摘要：為探索鹽脅迫對花生硝酸鹽積累的影響，本研究測定了鹽處理花生葉片的硝酸鹽含量，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫抑制硝酸鹽的積累。進一步對花生地下部和地上部樣品進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)13個花生中響應(yīng)鹽脅迫的硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運以及信號轉(zhuǎn)導的相關(guān)基因。本研究揭示了鹽脅迫影響花生硝酸鹽積累的可能機制，為進一步研究提供了目標基因。

關(guān)鍵詞：花生；硝酸鹽；鹽脅迫；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白；差異表達基因；表達量

中圖分類號：S565.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0086-05

Abstract To understand the effects of salt stress on nitrate accumulation in peanut， we checked the nitrate contents in leaves under salt treatment， and found that salt stress inhibited the nitrate accumulation in peanut. Thirteen genes related to nitrate uptake， translocation and signal transduction in underground and aboveground samples were found response to salt stress by RNA-seq analysis. This study revealed the possible mechanism about how salt stress affecting nitrate accumulation in peanut and provided target genes for further research.

Keywords Peanut； Nitrate； Salt stress； Nitrate transporter； Differentially expressed genes； Expression level

植物在生長過程中會受到各種生物脅迫和非生物脅迫的影響，鹽脅迫作為一種重要的非生物脅迫能夠?qū)е聺B透脅迫和離子毒害，影響植物生理和代謝的很多方面，威脅植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量[1]。氮是組成核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等基本生物分子結(jié)構(gòu)的必需組成元素，是植物生長發(fā)育的主要限制因子，也是影響作物產(chǎn)量的必需營養(yǎng)元素。大多數(shù)陸生植物將硝酸鹽作為氮素的主要來源。鹽脅迫影響土壤中的硝化作用和氨化作用，可能影響植物對氮素的吸收和代謝[2]?；ㄉ鞘澜缥宕笥土献魑镏唬彩俏覈匾挠土献魑锖统隹趧?chuàng)匯產(chǎn)品。花生是需氮較多的作物，外源氮肥對其生長的促進主要表現(xiàn)在提供氮素營養(yǎng)，促進多種含氮化合物如蛋白質(zhì)和核酸的形成，同時也促進葉綠素合成、相關(guān)酶及光合作用的增加[3]。而花生是一種中度鹽敏感作物，產(chǎn)量受鹽脅迫影響嚴重。目前，鹽脅迫對花生硝酸鹽的積累、吸收、轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因表達的研究還未見報導。本試驗通過測定鹽脅迫下花生葉片的硝酸鹽積累量，并對鹽處理前后的花生地下部和地上部進行RNA-seq檢測，旨在探索花生在鹽脅迫條件下對硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運的分子機制并為遺傳改良提供目標基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用花生品種為魯花14號，自供。

1.2 試驗處理

將花生種子播在沙子中并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照（200 μmol·m-2·s-1）16 h，相應(yīng)溫度為26℃；黑暗8 h，相應(yīng)溫度為24℃，濕度均保持在50%。待種子萌發(fā)8 d后將花生幼苗轉(zhuǎn)移到水培缽（盛有2 L Hoagland營養(yǎng)液）中培養(yǎng)，每缽4株，每周更換營養(yǎng)液。

花生苗齡18 d時進行鹽脅迫處理，設(shè)置Hoagland營養(yǎng)液中分別加入100、150、200、300 mmol·L-1 NaCl進行鹽脅迫，以未添加NaCl的Hoagland營養(yǎng)液為對照。處理4 d后取倒3葉，充分干燥后進行硝酸鹽測定。

依據(jù)硝酸鹽測定結(jié)果，設(shè)置Hoagland營養(yǎng)液加入的鹽脅迫濃度為250 mmol·L-1NaCl，同樣以未添加NaCl的Hoagland營養(yǎng)液為對照。處理4 d后進行地上部和地下部取樣用于表達譜分析，液氮速凍并保存在-80℃冰箱中備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 硝酸鹽含量測定 采用比色法測定硝酸鹽含量。取0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mmol·L-1標準濃度硝酸鹽溶液10 μL，加入90 μL硝酸還原酶，室溫反應(yīng)30 min。加入60 μL N-1奈乙二胺鹽酸和對氨基苯磺酰胺（N-1奈乙二胺鹽酸∶對氨基苯磺酰胺=1∶1）反應(yīng)2 h后，于540 nm波長處測定吸光值，制作標準曲線。對取樣葉片干燥后稱重，每份樣品中加入適量的0.1 mmol·L-1 鹽酸溶解硝酸鹽，后用水稀釋，取10 μL稀釋液作為待測樣品，于540 nm波長處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算每個樣品的硝酸鹽濃度，最后再根據(jù)稀釋倍數(shù)和樣品重量計算硝酸鹽含量。

1.3.2 樣品總RNA提取 250 mmol·L-1NaCl脅迫與對照樣品分別在液氮中研磨。根總RNA用Trizol試劑提取，葉片總RNA用CTAB法提取。使用Agilent 2100（Agilent Technologies）生物分析儀對RNA進行質(zhì)量和定量分析。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組和表達譜測序 分別取等量根和葉RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序。建庫以后通過華大Illumina HiSeq TM 2000測序平臺進行測序。測序得到的raw reads過濾以后得到clean reads，clean reads被用來進行de novo組裝，組裝軟件為Trinity。RNA-seq測序平臺為Ion ProtonTM system （Life Technologies）。差異表達基因通過NOISeq方法進行篩選，篩選標準為log2ratio≥1 and probability ≥ 0.8。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理與做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對花生葉片硝酸鹽含量的影響

鹽脅迫處理下，花生葉片硝酸鹽含量隨鹽濃度升高逐漸降低。在100、150、200、300 mmol·L-1NaCl處理濃度下，葉片內(nèi)硝酸鹽含量分別比對照降低33.42%、49.57%、74.64%、81.84%（圖1）。表明鹽脅迫對花生硝酸鹽積累有抑制作用，且抑制作用隨鹽濃度升高而增強。

2.2 鹽脅迫對花生硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運以及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因表達的影響

為鑒定鹽脅迫對花生硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運以及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因表達的影響，從而明確造成花生硝酸鹽積累量下降的分子機制，本試驗進行了RNA-seq分析，并采用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考基因組。部分硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達量在鹽脅迫后發(fā)生了顯著變化。nitrate transporter（NRT1.1）基因 CL6501.Contig1和NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2在地下部的表達量均大幅度下降，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表達量下降，而NRT1.2基因CL6344.Contig2的表達量在地下和地上部均上升。NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在地下部和地上部均被鹽脅迫大量誘導表達，尤其是在地上部，其表達被誘導至500倍左右。而另一個NRT1.5基因CL1925.Contig1在地下部表達量下降，地上部誘導不顯著（表1，圖2）。NRT1.4基因Unigene935只在地下部被鹽脅迫顯著誘導表達。NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被誘導表達。SLAH3基因Unigene22279的表達在地上部顯著上升。TGA4基因Unigene18749在地下部的表達量顯著降低， TCP20基因CL10482.Contig1在地下和地上部的表達量均顯著下降（表1）。

3 討論與結(jié)論

硝酸鹽是農(nóng)田土壤中氮素的主要存在形式，也是陸生植物的主要氮素來源。鹽脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，使花生等作物減產(chǎn)。本試驗發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導致花生硝酸鹽積累減少，并且減少量隨鹽濃度的增加而增加；通過對鹽處理前后的花生地下部和地上部進行RNA-seq分析可知，鹽脅迫對花生硝酸鹽積累的影響，可能是通過抑制硝酸鹽吸收基因?qū)崿F(xiàn)的。nitrate transporter（NRT） 1.1既是高親和性又是低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，其親和性的轉(zhuǎn)變依賴于101位的蘇氨酸的磷酸化[4]。NRT1.1在植物地下部和地上部均有分布，除介導硝酸鹽從外部的攝取和地上部的轉(zhuǎn)運外，還能介導硝酸鹽信號轉(zhuǎn)導[5-7]。NRT1.2是低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，NRT2.4是高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，均介導硝酸鹽的攝入[8，9]。NRT3.1與除NRT2.7以外的NRT2家族蛋白相互作用并促進其硝酸鹽攝入活性[10，11]。S-type anion channel SLAH3在氣孔保衛(wèi)細胞中介導硝酸鹽外排[12]。硝酸鹽作為多種生理活動的關(guān)鍵信號因子，大約調(diào)控了10%的基因組表達，在這個過程中有一些調(diào)節(jié)因子參與了復雜的硝酸鹽反應(yīng)。TGA4和TCP20作為轉(zhuǎn)錄因子被報道在調(diào)節(jié)硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和同化作用基因方面起到重要作用[13]。

差異表達基因中，與硝酸鹽吸收相關(guān)的NRT1.1基因CL6501.Contig1、NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表達量均顯著下降，只有NRT1.2基因CL6344.Contig2的表達量在地下和地上部均上升，而CL6344.Contig2在地下部的表達量相對于以上四個基因均較低，且誘導量不高，暗示硝酸鹽吸收減少，可能是這些基因表達協(xié)同作用的結(jié)果，而CL6344.Contig2可能在鹽脅迫條件下對花生進行硝酸鹽攝取具有積極意義。硝酸鹽從土壤中吸收到根部之后，先被同化成銨，后是氨基酸。由于同化作用所需的碳骨架來自光合作用，所以氨基酸的合成主要發(fā)生在地上部分。硝酸鹽通過木質(zhì)部導管被從根部遷移至地上部分。NRT1.5在這個過程中起重要作用[14]。本試驗還發(fā)現(xiàn)花生NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在對照條件下地下部和地上部表達量均較低，但都被鹽脅迫大量誘導表達，尤其地上部的誘導倍數(shù)達到了500倍左右，暗示這兩個花生NRT1.5基因在鹽脅迫時對花生硝酸鹽從地下部轉(zhuǎn)運到地上部起到非常重要的作用，對是否能夠提高植物耐鹽性值得探討；而另一個NRT1.5基因CL1925.Contig1在對照條件下表達量較高，鹽處理后地下部表達量下降，地上部誘導不顯著，暗示這個基因除硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能，可能還具有硝酸鹽攝取功能。據(jù)報道NRT1.4基因在葉柄中表達，與調(diào)節(jié)葉片硝酸鹽平衡相關(guān)，NRT1.7被報道在將硝酸鹽從老葉片動員到新生葉片的過程中起作用[15，16]，本試驗中花生差異表達基因中的NRT1.4基因Unigene935只在地下部被鹽脅迫顯著誘導表達，暗示這個基因可能在鹽脅迫時具有新功能；差異表達基因中的NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被誘導表達，暗示這兩個基因可能在鹽脅迫時具有其他功能。目前大部分硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運和調(diào)控蛋白在植物鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮的功能及分子機制仍知之甚少，針對這些基因進一步的研究，有利于深入理解非生物脅迫條件下植物的應(yīng)答機制，從而為達到提高作物氮肥利用效率和耐逆性的目標提供理論基礎(chǔ)。

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