王楷宬，莊青葉，張笑春，邱　源，王　通，侯廣宇，劉　朔，王素春

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

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高通量測(cè)序分析20株禽流感病毒全基因

王楷宬*，莊青葉，張笑春，邱源，王通，侯廣宇，劉朔，王素春

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

摘要：為探索使用高通量測(cè)序測(cè)定和分析禽流感病毒全基因的方法，使用Ion Torrent PGM測(cè)序儀對(duì)20株自華東地區(qū)分離的禽流感病毒進(jìn)行全基因測(cè)序，分析該方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以及此20株病毒的基因組特性和進(jìn)化特征。結(jié)果顯示，應(yīng)用Ion Torrent PGM測(cè)序儀能夠測(cè)出全部20株病毒的全基因，確定其均為H9亞型h9.4.2.5分支的低致病性毒株，NA基因均為N2亞型，并分析了其6個(gè)內(nèi)部基因分子演化關(guān)系。說(shuō)明高通量測(cè)序可用于禽流感病毒全基因分析。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；禽流感；全基因；分子演化

禽流行性感冒病毒(avian influenza virus，AIV)簡(jiǎn)稱禽流感病毒，屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬。甲型流感病毒粒子表面有血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)兩種表面結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)HA和NA的抗原性差異可分別將其分為18種H亞型(H1～H18)和11種N亞型(N1～N11)[1-3]。AIV在家禽和水禽中廣泛存在，引起禽類的全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病[4]。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥均可感染，且發(fā)病情況不一，有的急性死亡，有的感染后無(wú)明顯癥狀。

AIV是單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，每個(gè)基因在3′末端和5′末端都帶有12～13個(gè)保守核苷酸序列。這8個(gè)片段可編碼10種蛋白質(zhì)，其中8種蛋白質(zhì)(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[5]。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突變率，以及基因重組，均可使流感病毒呈現(xiàn)分子多樣性，使每個(gè)病毒亞型可進(jìn)化為多個(gè)分支[6]。通常一個(gè)堿基對(duì)的突變，就可引起病毒對(duì)宿主感染能力的改變，造成對(duì)抗流感藥物的抗性[7]。

由于AIV的突變率高，并易發(fā)生重組，監(jiān)測(cè)其進(jìn)化趨勢(shì)和流行態(tài)勢(shì)尤為重要。AIV所有節(jié)段的變化均可通過(guò)高通量測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)。目前，研究人員已建立了在一個(gè)RT-PCR反應(yīng)中使用一對(duì)通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒所有8個(gè)基因節(jié)段的方法，這使得AIV全基因組的測(cè)序更為簡(jiǎn)單[8]。傳統(tǒng)的一代測(cè)序雖然經(jīng)濟(jì)高效，但僅能測(cè)定特異性擴(kuò)增的某一片段，且不能測(cè)定準(zhǔn)種[9]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，一些測(cè)序儀平臺(tái)已能夠進(jìn)行甲型流感病毒全基因組的序列測(cè)定與分析，通過(guò)一次擴(kuò)增AIV所有8個(gè)節(jié)段的RT-PCR反應(yīng)，能夠消除臨床樣品中來(lái)自宿主和環(huán)境中核酸的干擾，這使得利用高通量測(cè)序進(jìn)行病毒核酸序列分析更為高效經(jīng)濟(jì)。另外，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，可以給每份樣品加入不同的索引標(biāo)簽，在同一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中就可以對(duì)數(shù)十甚至上千AIV的全基因進(jìn)行測(cè)序，其經(jīng)濟(jì)性更為明顯。

作者使用Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)對(duì)未知亞型的AIV臨床分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并分析其亞型和各節(jié)段基因序列的分子進(jìn)化關(guān)系，為高通量測(cè)序技術(shù)用于AIV的大規(guī)模測(cè)序與分析奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和儀器

PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Barcode Aaptors、Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑均購(gòu)自Life technologies公司；QIAxtractor 高通量核酸提取儀及配套試劑盒(cador?Pathogen 96 QIAcube?HT kit)；QIAgility 全自動(dòng)體系構(gòu)建系統(tǒng)及QIAxcel 全自動(dòng)實(shí)時(shí)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑盒(德國(guó)QIAGEN)；超凈工作臺(tái)(美國(guó)Forma Scientific)；移液器(Eppendorf)；孵化器(德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Heraeus Biofuge primoR)；PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)。

1.2毒株

20株禽流感病毒由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存，2014年7月分離自華東地區(qū)活禽交易市場(chǎng)的拭子樣品和糞便樣品，均按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/ T 772-2013)的特異性M基因引物檢測(cè)為禽流感病毒，但未確定亞型。毒株名稱見表1。

1.3RNA提取

按照說(shuō)明書操作，使用QIAxtractor高通量核酸提取儀(德國(guó)QIAGEN)及其配套試劑盒(Cador?Pathogen 96 QIAcube?HT kit)，提取病毒RNA。

1.4流感病毒全基因擴(kuò)增

應(yīng)用PathAmp FluA Reagent Kit對(duì)病毒 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并擴(kuò)增生成全基因組cDNA。使用Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑測(cè)定DNA濃度。

1.5文庫(kù)構(gòu)建

純化后的AIV全基因cDNA均稀釋成35 μL中含有200 ng DNA的溶液，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段，并分別加入含有Barcode的接頭，構(gòu)建為PGM測(cè)序儀可以識(shí)別的DNA文庫(kù)。

1.6測(cè)序

將20個(gè)DNA文庫(kù)分別稀釋為26 pmol·L-1，并等量混合。應(yīng)用Ion PGM Template OT2 200 Kit對(duì)混合的DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序前的樣品處理。處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片，置于PGM測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列經(jīng)PGM自帶的FluAnalysis(v4.0)軟件進(jìn)行序列拼接和亞型分析。

1.7分析與毒力或宿主嗜性相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)

使用Lasergene軟件將20株病毒的HA基因翻譯為蛋白質(zhì)序列，分析HA蛋白的裂解位點(diǎn)(第333—341位氨基酸)序列[10]，分析NS蛋白中結(jié)合CPSF的特異性殘基是否為GLEWN[11]。

1.8分子進(jìn)化分析

利用NCBI的Influenza Virus Resource數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索并下載1966—2014年其收錄的來(lái)自中國(guó)的H9亞型AIV的全基因序列，HA基因與136株從NCBI 流感數(shù)據(jù)庫(kù)下載的序列進(jìn)行比對(duì)與進(jìn)化分析，NA基因與86株從NCBI 流感數(shù)據(jù)庫(kù)下載的序列進(jìn)行比對(duì)與進(jìn)化分析。在分析本論文所用20株分離株的6個(gè)內(nèi)部基因時(shí)，除添加從NCBI 流感數(shù)據(jù)庫(kù)下載的86株序列，另添加經(jīng)Blast比對(duì)與該基因同源性較高的幾個(gè)毒株(H7、H10、H9N9以及mixed亞型)的序列，分別與測(cè)序得到的序列一起進(jìn)行在線Alignment初步對(duì)比，用MUSCLE方法進(jìn)行對(duì)齊運(yùn)算[12-13]。利用MEGA6.0生物信息學(xué)軟件，應(yīng)用Bayesian反饋信息準(zhǔn)則(Bayesian Information Criterion，BIC)的替代模式和系統(tǒng)評(píng)分，構(gòu)建進(jìn)化樹。通過(guò)Find Best DNA/Protein Model運(yùn)算方法，計(jì)算得出構(gòu)建進(jìn)化樹的最佳運(yùn)算模型，利用Construct/Test Maximum Likelihood Tree運(yùn)算模型，運(yùn)算Bootstrap值為1 000，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。譜系按照WHO/OIE/FAO聯(lián)合發(fā)布的方法進(jìn)行劃分和命名[14]。

表1　毒株名稱、亞型、宿主與序列數(shù)量

2結(jié)果

2.1測(cè)序質(zhì)量

測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至GenBank，登錄號(hào)為SRR2083856。測(cè)序共產(chǎn)生7 950 401個(gè)reads，去除接頭序列和低質(zhì)量序列后，4 171 523個(gè)reads含有1～20 barcode中的一個(gè)，其中3 157 806個(gè)reads正確匹配到甲型流感病毒的序列上，涵蓋了所有20個(gè)AIV毒株的所有節(jié)段。每個(gè)AIV毒株各節(jié)段的測(cè)序reads數(shù)量見表1。

2.2測(cè)序深度

AIV毒株每個(gè)節(jié)段的平均測(cè)序深度見表2。包括各節(jié)段的5′和3′端序列，所有的節(jié)段至少平均被測(cè)372次(PB1基因)。M基因的平均測(cè)序深度最大，為2 449.9。

2.3與毒力或宿主嗜性相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)

所有20株AIV的HA蛋白的裂解位點(diǎn)(第333—341位氨基酸)序列均為PSRSSR↓GLF，為低致病性毒株[10]。NS1 蛋白能結(jié)合CPSF，其結(jié)合CPSF的特異性殘基為GLEWN。分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)20個(gè)分離株特異性殘基中的L均突變?yōu)镕，即GLEWN 突變?yōu)镚FEWN，或可導(dǎo)致這些毒株致病力增強(qiáng)[11]。

表2　毒株各節(jié)段的測(cè)序深度

2.4AIV全基因分子進(jìn)化分析

20株分離株的8個(gè)節(jié)段的序列均登錄GenBank，登錄號(hào)：KT449572～KT449591(HA)，KT449612～KT449631(NA)，KT449592～KT449611(M)，KT449632～KT449651(NP)，KT449652～KT449671(NS)，KT449672～KT449691(PA)，KT449692～KT449711(PB1)，KT449712～KT449731(PB2)。8個(gè)節(jié)段序列的分子進(jìn)化分析結(jié)果見圖1～3。

HA基因分析表明，此20株禽流感病毒均屬于h9.4.2.5分支(代表株為A/chicken/Guangxi/55/2005)，為我國(guó)近年來(lái)的優(yōu)勢(shì)流行分支。NA基因分析表明，此20株分離株均屬于H9N2亞型毒株所在的分支。6個(gè)內(nèi)部基因分子演化分析表明，作者所分離的20株毒株中有12株AIV病毒和H9N2亞型毒株親緣關(guān)系更近；4株毒株的6個(gè)內(nèi)部基因均和H7N9亞型毒株親緣關(guān)系更近；2株毒株分別有4個(gè)基因和H7N9亞型毒株親緣關(guān)系更近，1株毒株有4個(gè)基因和H10N8亞型毒株親緣關(guān)系更近，1株毒株有2個(gè)基因和H10N8亞型毒株親緣關(guān)系更近，其余內(nèi)部基因的序列均與H9N2亞型病毒的親緣關(guān)系較近。

■.h9.4.2.4分支的代表毒株；●. h9.4.2.5分支的代表毒株；◆. h9.4.2.6分支的代表毒株；▲.所測(cè)20株分離株■. h9.4.2.4 clade representative virus；●. h9.4.2.5 clade representative virus；◆. h9.4.2.6 clade representative virus；▲. The 20 virus sequenced in the study圖1　HA基因分子進(jìn)化樹Fig.1　Phylogenetic tree of HA gene

▲.所測(cè)20株分離株▲. The 20 virus sequenced in the study圖2　NA基因分子進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenetic tree of NA gene

▲.所測(cè)20株分離株；◇.H7N9亞型禽流感病毒毒株；○.H9N9亞型禽流感病毒毒株；△.H10N8亞型禽流感病毒毒株；□.Mixed亞型禽流感病毒毒株▲. 20 virus sequenced in the study; ◇. H7N9 AIV;○. H9N9 AIV; △. H10N8 AIV; □. Mixed subtype AIV圖3　M、NP、NS、PA、PB1和PB2基因分子進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree of M, NP, NS, PA, PB1 and PB2 genes

3討論

AIV是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，其基因組復(fù)制時(shí)，具有RNA病毒特有的核酸堿基易變性，即抗原漂移(antigen drift)。不同的AIV同時(shí)感染同一細(xì)胞時(shí)，兩個(gè)病毒的基因節(jié)段相互間還會(huì)發(fā)生基因重排，引起抗原轉(zhuǎn)變(antigen shift)。所以，在自然界中每隔一定的時(shí)間，就會(huì)產(chǎn)生新的流感毒株引發(fā)流行。因而，測(cè)定AIV的全基因，掌握AIV的變異趨勢(shì)，對(duì)于防控AIV尤為重要。

傳統(tǒng)方法獲取流感病毒全基因，是以每個(gè)節(jié)段的特異性引物分別擴(kuò)增8個(gè)基因片段進(jìn)行克隆，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，然后進(jìn)行序列拼接得到病毒基因組，該方法操作比較繁瑣，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。自高通量測(cè)序儀問世以來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，通量和讀長(zhǎng)都得到改善，具有標(biāo)準(zhǔn)化的文庫(kù)構(gòu)建流程，不需要常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以及單克隆挑選等，且短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量有效的數(shù)據(jù)，能夠快速獲取病原體的遺傳信息。Ion Torrent 高通量測(cè)序技術(shù)基于半導(dǎo)體技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈活和低成本等顯著優(yōu)勢(shì)，是中等規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目的最佳選擇，2012年A.S.Bowman等[15]利用Ion Torrent PGM高通量測(cè)序儀分析了H3N2亞型流感病毒的基因組。多項(xiàng)研究都對(duì)高通量測(cè)序用于禽流感病毒全基因的測(cè)序效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[16-17]，證實(shí)該技術(shù)對(duì)AIV基因組的測(cè)序準(zhǔn)確、快速，并能對(duì)AIV的遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析。

本文中作者采用Ion Torrent PGM高通量測(cè)序儀完成了20株AIV毒株的全基因測(cè)序，確定其均為H9亞型h9.4.2.5分支的低致病性毒株，NA基因均為N2亞型。結(jié)果顯示，所采用的建庫(kù)與測(cè)序方法能夠測(cè)定流感病毒的全基因，并且測(cè)序深度較大，能滿足序列分析的需要。

HA基因分子演化分析顯示，所分離的20株毒株所在的h9.4.2.5分支，大部分均為我國(guó)2008年以后所分離的毒株。從毒株數(shù)量、時(shí)間和地理分布來(lái)看，在三級(jí)分支上，2007年以后第h9.4.2.5分支是中國(guó)H9亞型流感病毒的主要流行分支，這與尚飛雪等的結(jié)論一致[18]。本試驗(yàn)中有4株H9N2亞型毒株的6個(gè)基因均和H7N9亞型親緣關(guān)系更近，2株H9N2亞型毒株分別有4個(gè)基因和H7N9亞型親緣關(guān)系更近，推測(cè)某些H9N2亞型流感病毒的6個(gè)內(nèi)部基因經(jīng)過(guò)重配后，可能組成新的甲型H7N9流感病毒[19]；還有1株H9N2亞型毒株的4個(gè)基因和H10N8亞型親緣關(guān)系更近，1株H9N2亞型毒株的2個(gè)基因和H10N8亞型親緣關(guān)系更近，與H.Chen等和H.Zhang等的觀點(diǎn)一致，推測(cè)H9N2亞型流感病毒的某些內(nèi)部基因經(jīng)過(guò)重配后，可能會(huì)組成新的H10N8亞型流感病毒[20-21]。該方法的建立將進(jìn)一步改善流感病毒基因組的測(cè)序方法，使該項(xiàng)工作的開展更為簡(jiǎn)便、快速、高效，更適用于分子流行病學(xué)調(diào)查中大量樣品的測(cè)序分析，以及突發(fā)疫情的診斷與處置。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.018

收稿日期：2015-10-30

基金項(xiàng)目：中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金(2015IF-0004FF)

作者簡(jiǎn)介：王楷宬(1981-)，女，山東青島人，副研究員，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究 *通信作者：王楷宬， E-mail：wangkaicheng@cahec.cn

中圖分類號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1443-08

Genome Analysis of the 20 Avian Influenza Virus Strains by High-Throughput Sequencing

WANG Kai-cheng*，ZHUANG Qing-ye，ZHANG Xiao-chun，QIU Yuan，WANG Tong，HOU Guang-yu，LIU Shuo，WANG Su-chun

(ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China)

Abstract:To discuss the sequencing and analysis of avian influenza virus (AIV) genome by high-throughput sequencing，genomes of the 20 AIV strains isolated from eastern China were sequenced by Ion Torrent PGM.The advantage and disadvantage of the method were evaluated.The characteristic of genome and evolution were analyzed.The molecular evolution relationships of the other 6 internal genes were also analyzed.The results showed that the whole genomes of all the 20 strains were completely sequenced by Ion Torrent PGM.All the 20 viruses are restricted to h9.4.2.5 clade of H9 subtype low pathogenic strains.NA genes of all the viruses are N2 subtype.High-throughput sequencing can be used in the genome analysis of AIV strains.

Key words:high-throughput sequencing；avian influenza；genome；molecular evolution