任志浩，房立春，欒懷彪，李　陽，王一新，崔治中，?！∷?，趙　鵬

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018)

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雞傳染性貧血病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及其在疫苗污染檢測中的應(yīng)用

任志浩#，房立春#，欒懷彪，李陽，王一新，崔治中，常爽*，趙鵬*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018)

摘要：為了更快速而靈敏地檢測禽弱毒疫苗中雞傳染性貧血病毒(CIAV)的污染，根據(jù)CIAV基因組保守序列設(shè)計合成了引物及TaqMan探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了快速檢測CIAV的實時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，建立的檢測方法靈敏度可達10拷貝·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。該方法與禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒以及馬立克病病毒等病毒基因均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性；批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)顯示變異系數(shù)均小于2%，呈現(xiàn)良好的可重復(fù)性。在模擬試驗中，該方法能夠檢測到1 000羽份弱毒疫苗中1個EID50的低劑量污染，應(yīng)用該方法從送檢的39種(批)商品化禽用弱毒疫苗中檢測到2份為CIAV陽性。上述結(jié)果表明，本研究建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好，可用于檢測疫苗中CIAV低劑量的污染。

關(guān)鍵詞：雞傳染性貧血病毒；實時熒光定量PCR；弱毒疫苗；污染

雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起雛雞骨髓造血組織和胸腺等淋巴組織的萎縮，并導(dǎo)致感染雞發(fā)生貧血和免疫抑制。自1979年日本學(xué)者首次報道CIAV以來[1]，CIAV感染已在我國及其他國家普遍存在[2-6]。由于CIAV感染非常普遍并可以通過種蛋垂直傳播，在養(yǎng)禽場(特別是種禽場)中受到高度重視。

在過去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被證實存在一些外源性病毒的污染，這些病毒主要是能夠通過雞胚垂直傳播的病毒，其中CIAV在禽弱毒疫苗中的污染已在國內(nèi)外得到證實[1，7]。由于疫苗接種的特殊性，一旦使用污染有外源病毒的弱毒疫苗將使雞場產(chǎn)生近似于人工攻毒的普遍性效果，因此加強對禽弱毒疫苗中CIAV污染的監(jiān)測對于種禽場防控CIAV極其重要。目前，我國獸藥典中針對雞馬立克病活疫苗等生物制品中CIAV的檢測主要是依據(jù)接種SPF雞檢測抗體結(jié)果來判斷其中是否存在CIAV污染，但這一方法周期較長并需要嚴(yán)格的實驗動物設(shè)施。目前，人們把目光集中于分子生物學(xué)檢測方法，如PCR等被證實可以從商品化疫苗中檢測出CIAV污染[7]。通常情況下，在禽弱毒疫苗中CIAV等外源病毒污染的劑量比較低，這就需要用非常靈敏而特異的方法來進行檢測。本研究在對大量CIAV基因組分析基礎(chǔ)上設(shè)計和合成了相關(guān)引物與探針，建立了用于檢測CIAV的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，不僅在模擬試驗中被證實可有效檢測疫苗中低劑量的CIAV污染，還成功從商品化疫苗中檢測到CIAV污染。

1材料與方法

1.1毒株和細(xì)胞

CIAV-SDLY08株為2008年本實驗室從山東某商品代肉雞中分離鑒定的野毒株[8]，在雞胚上增殖后測定其雞胚半數(shù)感染量(EID50)。雞馬立克病病毒(MDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)以及不同亞群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)均由本實驗室分離鑒定和保存。SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)后用于MDV、REV以及ALV-A/B/J等病毒的增殖。

1.2引物和探針的設(shè)計

根據(jù)GenBank已經(jīng)發(fā)表的以及本實驗室近年來測定但尚未發(fā)表的CIAV全基因組序列，使用Lasergene 7.0 軟件尋找CIAV最保守區(qū)域，應(yīng)用Primer 5.0 軟件設(shè)計了引物和探針(表1)，引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

表1　本研究中所使用引物及探針

1.3熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化

取保存的CIAV病毒液參照說明書以病毒核酸提取試劑盒提取病毒DNA，以“1.2”中合成引物擴增相應(yīng)DNA片段，PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并以O(shè)MEGA公司凝膠回收試劑盒進行回收純化。純化產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定，并送商業(yè)公司測序驗證。驗證后陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用核酸定量系統(tǒng)對其進行定量并計算其拷貝數(shù)。以不同稀釋度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，將熒光定量PCR上下游引物和探針加入到反應(yīng)體系中，于ABI 7500型熒光定量PCR儀進行擴增。分別選用10、25、50 nmol·mL-1的引物濃度和5、12.5、25 nmol·mL-1的探針濃度，使用矩陣法對上下游引物、探針濃度進行篩選和優(yōu)化，以得到最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.4熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復(fù)性檢測

將1×108拷貝·μL-1的重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋至濃度范圍1×108～1×101拷貝·μL-1，進行熒光定量PCR反應(yīng)，進行敏感性檢測。同時以等量的質(zhì)粒DNA為模板，進行常規(guī)PCR反應(yīng)，取擴增產(chǎn)物5 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，計算兩種方法所能檢測出的最低模板濃度，比較兩者敏感性的差異。分別以ALV-A/B/J、MDV、CIAV、REV的DNA或cDNA為模板，使用所建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，同時設(shè)置滅菌超純水為陰性對照。對不同梯度濃度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行實時熒光定量PCR檢測，每個梯度進行3次反應(yīng)，通過組內(nèi)的CT值變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值平均數(shù))評估所建立方法的重復(fù)性。另外，取3份CIAV陽性組織樣品，以其為模板進行熒光定量PCR檢測，分析該方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)：將上述3份DNA分別設(shè)立3個重復(fù)，在同一條件下同時檢測，計算批內(nèi)變異系數(shù)；批間重復(fù)：將上述3份DNA在同一條件下進行3次獨立的熒光定量PCR檢測，計算批間變異系數(shù)。

1.5熒光定量PCR在檢測CIAV污染中的應(yīng)用

將定量好的CIAV分別以無菌的PBS稀釋至2×103、2×102、2×10、2×1、2×0.1 EID50·mL-1，然后分別以包含不同病毒含量的上述PBS稀釋5瓶同一批次的雞痘活疫苗(1 000羽份)，即分別人為污染了103、102、10、1、0.1 EID50·1 000-1羽份CIAV的5瓶雞痘活疫苗，另用2 mL無菌PBS稀釋1瓶同一批次的雞痘活疫苗(1 000羽份)作為空白對照。上述不同疫苗以病毒核酸提取試劑盒提取病毒DNA后按照本研究建立的方法進行熒光定量PCR檢測，同時以本研究引物進行常規(guī)PCR檢測。按照上述操作在MDV活疫苗中人工加入不同劑量的CIAV模擬不同劑量的污染。

另外，對四家種禽企業(yè)送檢的39種(批)弱毒疫苗提取核酸后按照上述操作分別使用本研究建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR進行檢測，對于兩種方法結(jié)果不一致的參照《中國獸藥典》使用SPF雞檢查法進行復(fù)核檢測。

2結(jié)果

2.1實時熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化

對實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，確定引物和探針的最佳濃度分別為10和25 μmol·mL-1。反應(yīng)體系為20 μL，其中含10 μL 2×Premix ExTaq(2×)(Probe qPCR)，ROX plus 緩沖液，上、下游引物各0.5 μL，探針0.4 μL，模板2 μL，用滅菌超純水補足體積。反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃34 s(收集熒光信號)，擴增40個循環(huán)。使用優(yōu)化后的條件進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以10倍梯度稀釋(1×108～1×101拷貝·μL-1)的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進行擴增，獲得了檢測CIAV的動力學(xué)曲線(圖略)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖略)。結(jié)果顯示在模板為108～101拷貝·μL-1濃度時具有良好的線性關(guān)系，R2值達到0.996?？截悢?shù)對數(shù)值(x)與CT值的關(guān)系為y=-3.215x+41.4。說明標(biāo)準(zhǔn)品的起始模板濃度與CT值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2實時熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復(fù)性試驗

通過對重組質(zhì)粒各稀釋度樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，本方法對重組質(zhì)粒進行擴增最低可以檢測到10個病毒核酸分子拷貝，而常規(guī)PCR方法在103個病毒核酸分子拷貝時能勉強觀察到目的條帶(圖略)，表明本研究所建立的實時熒光定量PCR方法比普通PCR靈敏度高出約100倍。用所建立的實時熒光定量PCR方法對ALV-A/B/J、MDV、REV的DNA或cDNA進行檢測均無擴增信號，而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有良好的擴增，表明該方法具有良好的特異性(圖略)。取3份CIAV陽性肝組織樣品，提取組織DNA，進行3次實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)的變異系數(shù)均小于2%(表2)，表明該方法具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.3實時熒光定量PCR檢測弱毒疫苗中CIAV污染

利用建立的熒光定量PCR檢測方法對人工混入不同弱毒疫苗中五個不同污染劑量的CIAV污染檢測結(jié)果顯示可檢測到1 EID50·1 000-1羽份的低劑量污染，而空白疫苗檢測為陰性，顯示所建立的CIAV熒光定量方法不僅具備較高的靈敏度，還具有非常好的特異性。而使用同一引物進行常規(guī)PCR檢測，僅僅可以檢測到103EID50·1 000-1羽份(表3)。

使用建立的熒光定量PCR方法從39種(批)弱毒疫苗中檢測到2份CIAV陽性，盡管疫苗送檢時標(biāo)簽已撕掉，廠家未知，但巧合的是這兩份樣品均為FPV活疫苗；將這2份FPV活疫苗接種SPF雞后分別在35和42 d時均檢測到CIAV特異性抗體，判定為CIAV污染陽性，但以常規(guī)PCR檢測這2份樣品判定為陰性。

表2　重復(fù)性試驗結(jié)果

表3　熒光定量PCR檢測人工污染不同劑量CIAV結(jié)果

3討論

在過去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被證實存在一些外源性病毒的污染，這種現(xiàn)象主要是使用了污染有其他病毒的SPF雞胚或毒種生產(chǎn)疫苗造成的，這些病毒主要是能夠通過雞胚垂直傳播的病毒，如ALV、REV、CIAV等。目前針對外源病毒污染的報道最多的是ALV[9-13]和REV[14-16]，此外就是CIAV污染[1，7]。

目前對疫苗中外源病毒污染的檢測主要包括細(xì)胞培養(yǎng)檢查法以及經(jīng)典的SPF雞檢查法，但是絕大多數(shù)疫苗(如MDV活疫苗)的檢測非常復(fù)雜和困難，這是因為MDV等接種CEF細(xì)胞后能夠產(chǎn)生細(xì)胞病變，使污染的病毒復(fù)制受到干擾。盡管經(jīng)典的SPF雞檢查法相對可靠，但其周期較長成本也比較高，更重要的是對于一般種禽場存在困難，因為這需要特定的設(shè)備并要求長期飼養(yǎng)SPF雞備用。因此越來越多的檢測機構(gòu)試圖通過分子生物學(xué)檢測方法來檢測疫苗中ALV、REV和CIAV的污染。

但是，對于常規(guī)的分子生物學(xué)檢測方法來講，在檢測ALV和REV時經(jīng)常會檢測到假陽性的結(jié)果，這是因為對REV來講，存在著REV與其他病毒的基因重組。早已證實，REV的基因成分能夠整合進其他病毒的基因組中，報道最多的是MDV等基因組較大的病毒基因組中[17-19]，例如2004年在我國已經(jīng)分離到整合進REV的LTR基因片段的天然MDV重組野毒株[20-21]。除了MDV外，最容易整合進REV基因成分的是FPV[22-24]，在我國FPV疫苗以及野毒株中整合進REV基因片段的研究也已有報道[25]。而對ALV來講，內(nèi)源性ALV的干擾無疑是非常嚴(yán)重的，一般的分子生物學(xué)檢測會受到內(nèi)源性ALV的干擾而出現(xiàn)假陽性。

相對于上述ALV和REV基因的復(fù)雜性，CIAV基因組較小并且其基因組非常保守。CIAV屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，有3個開放閱讀框(ORF)，分別編碼衣殼蛋白(VP1) 、分子伴侶(VP2)和凋亡素(VP3)，在3個ORF中只有VP1的變異相對較大，但不同毒株之間同源性也非常高[3-6]，因此可以用常規(guī)的分子生物學(xué)方法來檢測疫苗中CIAV的污染，例如邵紅霞等就建立了針對CIAV的PCR檢測方法并在一些商品化疫苗中檢測出CIAV的污染[7]。

通常，在禽弱毒疫苗中CIAV污染的劑量是非常小的，這可能導(dǎo)致一般的PCR方法無法有效檢測出一些低劑量的CIAV污染。本研究通過對大量CIAV毒株(約90株以上)的分析，選取CIAV最保守的基因區(qū)域建立了針對CIAV的TaqMan探針實時熒光定量檢測方法，并證實其靈敏度、特異性和可重復(fù)性均非常良好。為了驗證所建立的方法在檢測疫苗中CIAV污染的最低限度，作者在MDV等弱毒疫苗中分別人工加入了不同劑量的CIAV，然后使用所建立的方法進行檢測，通過模擬試驗觀察此方法在檢測弱毒疫苗中CIAV污染的可行性。結(jié)果顯示所建立的熒光定量PCR方法展示了靈敏度優(yōu)勢，該方法可以檢測出MDV等弱毒疫苗中1EID50/1 000羽份的CIAV污染，這種污染劑量已經(jīng)很低了。實際上，即使再低劑量的污染檢測不到我們也無須擔(dān)心，因為那種劑量的污染已經(jīng)接近于零的水平，感染雞后不會導(dǎo)致任何不良結(jié)果。所建立熒光定量PCR檢測方法靈敏度優(yōu)勢在檢測商品化疫苗中得到了更好的體現(xiàn)，利用常規(guī)PCR方法對市場上購買的39種(批)弱毒疫苗檢測均未檢測到CIAV陽性，但本研究建立的熒光定量PCR方法則檢測到2種FPV弱毒疫苗中存在CIAV污染，并進一步通過接種SPF雞的經(jīng)典金標(biāo)準(zhǔn)得到了證實，這一結(jié)果提示對于商品化弱毒疫苗中CIAV污染的監(jiān)測仍需高度重視。本研究建立的方法將有助于企業(yè)能夠準(zhǔn)確而快速地檢測禽弱毒疫苗中的CIAV污染，為防控CIAV的傳播提供可借鑒的手段。

4結(jié)論

根據(jù)CIAV基因組保守序列設(shè)計合成引物及TaqMan探針，建立了快速檢測CIAV的實時熒光定量PCR檢測方法。建立方法的檢測靈敏度可達10拷貝·μL-1，該方法能夠檢測到1 000羽份弱毒疫苗中1個EID50的低劑量污染。應(yīng)用該方法從送檢的39種(批)商品化禽用弱毒疫苗中檢測到2份為CIAV陽性。建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好，可用于檢測疫苗中CIAV低劑量的污染。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.020

收稿日期：2016-04-10

基金項目：農(nóng)業(yè)部財政項目“禽垂直傳播性疾病診斷技術(shù)研究”

作者簡介：任志浩(1992-)，男，山東青島人，碩士生，主要從事動物分子病毒學(xué)研究，E-mail：zhren92@163.com；房立春(1991-),男，山東濟南人，碩士生，主要從事動物分子病毒學(xué)研究，E-mail：18854881003@163.com。兩人對本研究有同等貢獻，為并列第一作者 *通信作者：趙鵬，E-mail：zhaopeng@sdau.edu.cn;常爽，E-mail：changshuang81@126.com。趙鵬、常爽并列通信作者

中圖分類號：S852.659.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1459-06

Development and Application of a Quantitative PCR for Detection of Chicken Infectious Anemia Virus Contamination in Attenuated Vaccines

REN Zhi-hao#，F(xiàn)ANG Li-chun#，LUAN Huai-biao，LI Yang，WANG Yi-xin，CUI Zhi-zhong，CHANG Shuang*，ZHAO Peng*

(CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

Abstract:To detect the contamination of Chicken infectious anemia virus (CIAV) in attenuated vaccines for poultry，primers and TaqMan probes were designed and synthesized based on the published CIAV genome sequence，and a real-time quantitative PCR method for detecting the CIAV was established by optimizing the reaction conditions.Results analysis showed that the sensitivity of the qPCR may increase detection to 10 copies·μL-1，and the method was approximately 100-fold higher than the sensitivity of the conventional PCR.This detection method had good specificity，and showed no cross-reactions with ALV，REV and MDV genes，the CV (coefficient of variation) of intra-assay and inter-assay were less than 2%，and also showed that the method had the characteristics of better repeatability.In our experiment，a low dosage of 1 EID50·1 000-1plumes and in 2 positive (5.1%) of 39 samples were detected for CIAV detection from commercial poultry vaccines by qPCR method.In this study，suggesting that this method provides a high sensitivity，strong specificity and better repeatability system for detection of a low dosage CIAV contamination in attenuated vaccines.

Key words:chicken infectious anemia virus；real-time PCR；live vaccine；contamination